(Chanos chanos Forskal) DAN IKAN PATIN (Pangasius sp.)
SEFRI RUSYADI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Purifikasi dan Karakterisasi Inhibitor Katepsin dari Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal) dan Ikan Patin (Pangasius sp.) adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2010
Sefri Rusyadi NIM C351070101
ABSTRACT
SEFRI RUSYADI. Purification and Characterization of a Chatepsin Inhibitor from Milk fish (Chanos chanos, Forskal) and Catfishes (Pangasius sp.). Supervised by TATI NURHAYATI and RUDDY SUWANDI
Proteolytic enzymes are distributed in all types of organisms including fishes. The cysteine protease is the largest group and includes lysosomal cathepsins were shown to cause softening and degradation of the myofibrillar protein. The action of proteases was regulated with endogenous inhibitors. The purposes of this research were to optimize extraction of protease inhibitor from skin, muscle, and viscera of fishes, to purify chatepsin inhibitor from the selected source, and to study the characteristics of the chatepsin inhibitor. A chatepsin protease inhibitor has been purified to homogeneity from the muscle of milk fish (Chanos chanos, Forskal) and catfishes (Pangasius sp.). Previously, we report the purification and further biochemical characterization of the endogenous chatepsin inhibitor. The purification was carried out by DEAE-Shepadex A-50 and Shepadex G-100. Throughout the purification procedure, chatepsin inhibitory activity was assayed using haemoglobin as substrate. The molecular inhibitor was 16,65 kDa, as estimated by SDS-PAGE and gel filtration. the smaller protein was purified with yield 1,85 % and purity of 16,91 fold. The chatepsin inhibitor was stable in the pH range of 7,0-9,0 with maximum stability at pH 8,0. Inhibitor presented thermal stability at temperature below 60 oC and exhibited maximum activity at temperature of 20-50 oC.
RINGKASAN
SEFRI RUSYADI. Purifikasi dan Karakterisasi Inhibitor Katepsin dari Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal) dan Ikan Patin (Pangasius sp.). Dibimbing oleh TATI NURHAYATI dan RUDDY SUWANDI
Proses penurunan mutu ikan segar terutama diawali dengan proses perombakan oleh aktivitas enzim yang secara alami terdapat di dalam ikan. Salah satu jenis enzim yang berperan penting dalam proses kemunduran mutu ikan adalah enzim-enzim pengurai protein seperti katepsin, calpain dan kolagenase. Enzim proteolitik ini dapat menyebabkan timbulnya akumulasi metabolit, perubahan citarasa, dan pelunakan tekstur, terbentuknya komponen volatil serta peningkatan jumlah bakteri yang akhirnya menimbulkan kebusukan. Katepsin merupakan kelompok dari sistein proteinase diantaranya katepsin B dan L yang dapat menyebabkan terjadinya pelunakan daging (softening) pada ikan. Interaksi antara sistein protease dan inhibitornya telah menjadi tujuan beberapa penelitian pada dua dekade ini. Inhibitor spesifik dari sistein protease yang berupa molekul protein, sangat dibutuhkan untuk mencegah terjadinya proteolisis yang destruktif. Inhibitor protease pada ikan diperkirakan dapat melakukan perlindungan dari mikrooganisme, proses embriogenesis pada regulasi pertumbuhan awal embrio. Saat ini terdapat permintaan yang kuat terhadap protease inhibitor alami yang dapat digunakan untuk mencegah proses kemunduran pada daging ikan dan produk berbasis surimi. Beberapa inhibitor protease telah dicoba ditambahkan ke dalam daging ikan untuk menjelaskan peranan enzim pada proses pelunakan daging saat post mortem.
Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan sumber inhibitor katepsin dari bagian ikan bandeng dan ikan patin, yaitu kulit, daging, dan organ dalam, serta untuk mengetahui dan mendapatkan informasi mengenai metode purifikasi dan karakteristik inhibitor katepsin alami dari ikan. Hasil penelitian ini kedepannya dapat dimanfaatkan sesuai dengan sifat dan karakteristiknya tersebut baik untuk bidang kesehatan maupun untuk mencegah proses kemunduran pada daging ikan dan produk berbasis surimi. Untuk memperoleh inhibitor katepsin yang mempunyai aktivitas yang tinggi, perlu dilakukan proses purifikasi dan karakterisasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan purifikasi dan karakterisasi adalah pemilihan sumber inhibitor katepsin, penggunaan substrat enzim dan pemilihan metode yang tepat pada setiap tahapan purifikasi seperti pemilihan metode ekstraksi, pemilihan presipitan pada tahap presipitasi, pemilihan jenis kantong dialisis dan pemilihan jenis gel kromatografi.
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu preparasi bahan baku berupa ikan bandeng dan ikan patin yang diambil kulit, daging, dan jeroan dan diukur aktivitas penghambatannya terhadap protease katepsin. Setelah mendapatkan inhibitor dengan aktivitas penghambatan terbaik, tahapan selanjutnya, yaitu purifikasi inhibitor katepsin dari ekstrak ikan patin yang meliputi presipitasi, dialisis, pemurnian dengan kromatografi dan karakterisasi inhibitor. Presipitasi menggunakan ammonium sulfat 30-80% (w/v), dialisis dengan kantong dengan ukuran cut off 12 kDa. Pemurnian dengan kromatografi kolom, yaitu penukar ion (ion exchange DEAE Sephadex A-50 ), dan filtrasi gel sephadex G-100. Karakterisasi inhibitor katepsin dilakukan terhadap ekstrak kasar
dan hasil pengendapan dengan ammonium sulfat yang meliputi penentuan suhu optimum, pH optimum, stabilitas panas dan pH, pengaruh ion logam serta penentuan bobot molekul dengan metode SDS-PAGE.
Hasil optimasi sumber inhibitor katepsin terbaik dari bagian kulit, daging dan organ dalam ikan bandeng dan patin diperoleh pada bagian daging yang diekstraksi pada suhu 80 oC dengan aktivitas penghambatan sebesar 87,84% pada ikan bendeng dan 90,28% dari ikan patin. Ekstrak jeroan menunjukkan aktivitas inhibitor yang negatif, sedangkan ekstrak inhibitor dari kulit ikan pada suhu ekstraksi 80 oC menunjukkan aktivitas yang cukup tinggi, yaitu 77,72% pada ikan bandeng dan 77,24% pada kulit ikan patin.
Ekstrak kasar inhibitor katepsin terbaik dari daging ikan bandeng dan patin, dilakukan pengendapan dengan ammonium sulfat. Hasil pengendapan dengan aktivitas penghambatan terbaik pada konsentrasi ammonium sulfat 70% (w/v) pada bagian pelet atau endapan baik pada ikan bandeng maupun ikan patin. Hasil pengendapan inhibitor dari ikan patin merupakan ekstrak terpilih yang selanjutnya digunakan untuk dilakukan dialisis dan dimurnikan dengan penukar ion DEAE Sephadex A-50. Puncak aktivitas inhibitor tertinggi terdapat pada fraksi no. 10 dengan aktivitas 1,98 U/ml. Fraksi tersebut mempunyai konsentrasi protein sebesar 0,1059 mg/ml dan aktivitas spesifik sebesar 18,762 U/mg dengan kelipatan pemurnian 4,65 kali. Fraksi aktif dengan aktivitas tertinggi (fraksi 10) selanjutnya dimurnikan kembali dengan kromatografi filtrasi gel. Hasilnya menunjukkan puncak aktivitas inhibitor berada pada fraksi ke 8 dengan aktivitas sebesar 1,8281 U/ml, konsentrasi protein sebesar 0,0268 mg/ml dan menunjukkan peningkatan aktivitas spesifik yang cukup tinggi menjadi 68,159 U/mg dengan kelipatan kemurnian sebesar 16,91 kali. Fraksi ke 8 dengan aktivitas tertinggi merupakan ekstrak murni inhibitor protease katepsin yang selanjutnya dilakukan karakterisasi bobot molekul dengan elektroforesis (SDS-PAGE)
Karakteristik inhibitor katepsin yang dihasilkan, yaitu mempunyai suhu optimum 40 oC, dan pH optimum 8. Ekstrak inhibitor katepsin relatif stabil pada suhu 10-50 oC dan pada kisaran pH 7-9. Inhibitor ekstrak mempunyai bobot molekul 15,651 kDa. Ion-ion logam menurunkan aktivitas inihibitor protease kecuali ion logam Mn2+ dan Na+ 1 mM.
@ Hak cipta milik IPB, tahun 2010 Hak cipta dilindungi Undang-Undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyatakan sumber :
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu makalah.
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI INHIBITOR KATEPSIN
DARI IKAN BANDENG (Chanos chanos, Forskal) DAN
IKAN PATIN (Pangasius sp.)
SEFRI RUSYADI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada Program Studi Teknologi Hasil Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
HALAMAN PENGESAHAN
Judul Tesis : Purifikasi dan Karakterisasi Inhibitor Katepsin dari Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal) dan Ikan Patin (Pangasius sp.)
Nama : Sefri Rusyadi NIM : C351070101
Disetujui : Komisi Pembimbing
Dr. Tati Nurhayati S.Pi, M.Si. Dr. Ir. Ruddy Suwandi, MS, M.Phil
Ketua Anggota
Mengetahui :
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Teknologi Hasil Perairan
Dr. Tati Nurhayati S.Pi, M.Si. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala Rahmat dan Karunia-Nya sehingga penulisan tesis ini dapat diselesaikan. Judul tesis ini adalah ”Purifikasi dan Karakterisasi Inhibitor Katepsin dari Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal) dan Ikan Patin (Pangasius sp.)”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si dan Dr Ir. Ruddy Suwandi MS, M.Phil selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan, arahan, dukungan, semangat serta pelajaran tentang berbagai macam hal sehingga penulis dapat menyelesaikan thesis ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Ir. Sri Purwaningsih, M.Si. serta seluruh dosen pengajar Departemen Teknologi Hasil Perairan, atas panduan ilmu dan saran-sarannya.
Terima kasih disampaikan juga kepada ketua tim penelitian dari Hibah
Bersaing Batch 2 tahun 2009, DP2M-Ditjen Dikti DEPDIKNAS melalui Dr.Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si yang telah mendanai penelitian ini.
Hasil karya ini saya persembahkan kepada kedua orang tuaku Bapak Hairuddin S.Ag dan Ibu Siti Kamilah, kakak dan adikku, serta calon istriku Kiki Puspita Amalia S.Pi dan keluarga atas segala pengertian, doa, dukungan dan pengorbanan yang diberikan.
Terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah
membantu penelitian, khususnya teman seperjuangan Mba Tatty Yuniarti, teman-teman Pascasarjana THP 2006 sampai 2010, Tim Inhibitor Enzim THP 42 (Febri, Ary, Zaenuri, Fahrul). Terimakasih juga kepada Ibu Ika yang telah banyak
membantu dalam kromatografi dan elektroforesis. Akhirnya, semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2010
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pamekasan Madura pada tanggal 26 September 1983 sebagai anak kedua dari empat bersaudara, putra dari pasangan Hairuddin S.Ag dan Siti Kamilah. Penulis mengawali pendidikan di SDN Bulay 1 pada tahun 1990 dan menyelesaikan pendidikan pada tahun 1996. Pada tahun yang sama penulis diterima di SLTPN 1 Pamekasan dan menyelesaikan pendidikannya pada tahun 1999. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMAN 1 Pamekasan dan selesai pada tahun 2002.
Pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Pada tahun 2007 penulis melanjutkan studi pada Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Program Studi Teknologi Hasil Perairan.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL... vii
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... x
1 PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 2
1.3 Tujuan dan Manfaat Penelitian ... 3
1.4 Hipotesis Penelitian ... 3
2 TINJAUAN PUSTAKA ... 4
2.1 Deskripsi dan Identifikasi Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal) ... 4
2.2 Deskripsi dan Identifikasi Ikan Patin (Pangasius sp.) ... 5
2.3 Protease pada Ikan ... 6
2.4 Inhibitor Protease ... 8
2.4.1 Inhibitor Sistein Proteinase ... 9
2.4.2 Mekanisme Kerja Inhibitor Protease ... 12
2.5 Pemurnian Enzim dan Inhibitor Enzim ... 13
2.6 Elektroforesis SDS-PAGE ... 15
2.7 Kromatografi ... 16
3 METODOLOGI ... 18
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 18
3.2 Alat dan Bahan ... 18
3.3 Metode Penelitian ... 19
3.3.1 Ekstraksi Enzim Katepsin (Dinu et al. 2002) ... 20
3.3.2 Ekstraksi Inhibitor Katepsin (An et al. 1995) ... 21
3.3.3 Presipitasi dan Dialisis (Ustadi et al. 2005)... 22
3.3.4 Pemurnian dengan Kromatografi (Ustadi et al. 2005)... 22
3.3.5 Karakterisasi Inhibitor Katepsin ... 23
3.4 Prosedur Analisis ... 23
3.4.1 Aktivitas Katepsin (Dinu et al. 2002) ... 23
3.4.2 Uji Aktivitas Inhibitor Katepsin (Dinu et al. 2002) ... 24
3.4.3 Pengukuran Konsentrasi Protein (Bradford 1976) ... 25
3.4.4 Penentuan Berat Molekul dengan SDS-PAGE ... 26
4 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 28
4.1 Optimasi Proses Ekstraksi Inhibitor Katepsin ... 28
4.2 Produksi dan Pemurnian Inhibitor Katepsin ... 30
4.2.1 Ekstraksi Inhibitor Katepsin ... 30
4.2.2 Pemurnian Inhibitor Katepsin dengan Kolom Kromatografi ... 32
4.3 Karakteristik Inhibitor Katepsin ... 36
4.3.1 Suhu Optimum ... 36
4.3.2 Penentuan pH Optimum ... 37
4.3.3 Stabilitas terhadap Panas ... 39
4.3.4 Stabilitas terhadap pH ... 40
4.3.5 Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas Inhibitor... 40
4.3.6 Perbandingan Aktivitas Inhibitor Komersial ... 42
4.3.7 Penentuan Bobot Molekul ... 42
5 KESIMPULAN DAN SARAN ... 46
5.1 Kesimpulan ... 47
5.2 Saran ... 47
DAFTAR PUSTAKA ... 48
DAFTAR TABEL
Halaman 1. Beberapa penelitian mengenai purifikasi inhibitor enzim dari
jaringan hewan ... 11
2. Metode kromatografi untuk faraksinasi protein ... 17
3. Prosedur untuk mengukur aktivitas katepsin ... 23
4. Prosedur pengukuran aktivitas inhibitor katepsin ... 24
5. Pembuatan larutan standar BSA konsentrasi 0,01-0,3 mg/ml ... 26
6. Komposisi gel penahan dan pemisah SDS-PAGE ... 26
7. Peningkatan aktivitas inhibitor katepsin pada berbagai tahap pemurnian ... 35
8. Perbandingan aktivitas inhibitor komersial dengan inhibitor ekstrak patin ... 42
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Ikan bandeng (Chanos chanos, Forskal)... 4
2. Ikan patin (Pangasius sp.) ... 5
3. Reaksi polimerisasi akrilamida dan N,N’-metilen-bis-akrilamida... 16
4. Diagram alur kerja penelitian pemurnina inhibitor katepsin ... 19
5. Diagram alir proses ekstraksi enzim katepsin dengan teknik differensial sentrifugasi (Dinu et al. 2002) ... 20
6. Diagram alir proses ekstraksi inhibitor enzim katepsin dengan teknik differensial sentrifugasi (An et al. 1995) ... 21
7. Persen (%) penghambatan aktivitas katepsin pada ekstrak inhibitor ikan bandeng (1) dan ikan patin (2), (□) suhu 60 oC, (□) suhu 70 oC, (□) suhu 80 oC ... 28
8. Uji protein pada semua ekstrak kasar inhibitor katepsin (□) inhibitor bandeng, (■) inhibitor patin ... 29
9. Persentase (%) aktivitas penghambatan inhibitor katepsin ikan bandeng setelah pengendapan ammonium sulfat (A) ; konsentrasi protein setelah pengendapan dangan ammonium sulfat (B), —■— endapan, —▲— supernatan ... 31
10. Persentase (%) aktivitas penghambatan inhibitor katepsin ikan patin setelah pengendapan ammonium sulfat (A) ; konsentrasi protein setelah pengendapan dangan ammonium sulfat (B), —■— endapan, —▲— supernatan ... 31
11. Pemurnian inhibitor katepsin menggunakan kromatografi penukar ion DEAE sephadex A-50, –●– konsentrasi protein, –×– aktivitas inhibitor, — gradien NaCl (M). ... 33
12. Pemurnian inhibitor katepsin menggunakan filtrasi gel sephadex G-100, –●– konsentrasi protein, –×– aktivitas inhibitor ... 33
13. Persentase (%) penghambatan inhibitor protease ekstrak kasar ikan patin dan bandeng pada suhu 10-70oC (A); Aktivitas penghambatan inhibitor ekstrak ikan patin setelah pengendapan dangan ammonium sulfat 70 % (B), (□) inhibitor bandeng, (■) inhibitor patin... 36
14. Persentase (%) penghambatan inhibitor protease ikan patin dan bandeng pada pH 3-10 (A); Aktivitas penghambatan inhibitor ekstrak ikan patin setelah pengendapan dangan ammonium sulfat 70% (B), (□) inhibitor bandeng, (■) inhibitor patin ... 38
15. Stabilitas panas inhibitor katepsin pada suhu 10-70 oC, –●– ekstrak kasar, –▲– hasil pengendapan ... 39
16. Stabilitas inhibitor katepsin pada kisaran pH 3-10,
–●– ekstrak kasar, –▲– hasil pengendapan... 40 17. Pengaruh beberapa jenis logam terhadap aktivitas penghambatan
ekstrak ikan bandeng (A) dan ikan patin (B), (□) 1 mM,
(■) 5 mM ... 41 18. Hasil elektroforesesis: (M) Marker, (1) ekstrak kasar, (2) hasil
pengendapan ammonium sulfat, (3) hasil dialisis, (4) penukar ion,
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Bahan bahan untuk ekstraksi katepsin dan inhibitor ... 53 2. Bahan-bahan untuk pengukuran aktivitas katepsin
dan inhibitor katepsin ... 53 3. Kurva standar penentuan konsentrasi protein
menurut metode Bradford ... 54 4 Komposisi gel dan pereaksi untuk elektroforesis ... 55 5 Pereaksi yang digunakan untuk pewarnaan perak dan
