LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA PERCOBAAN KE 2
PEMISAHAN PROTEIN PUTIH TELUR DENGAN FRAKSINASI (NH4)2SO4
Disusun oleh : Ulan Darulan - 10511046
Kelompok 1
Asisten Praktikum : R. Roro Rika Damayanti (10510065) Tanggal percobaan : Rabu, 1 Oktober 2014
Tanggal pengumpulan : Rabu, 8 Oktober 2014
LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
PERCOBAAN 1
REAKSI UJI TERHADAP ASAM AMINO DAN PROTEIN I. Tujuan Percobaan
1. Melakukan pemisahan protein putih telur dengan penambahan (NH4)2SO4 jenuh.
2. Menentukan berat molekul protein putih telur pada berbagai fraksi (NH4)2SO4 dengan
menggunakan metode SDS-PAGE II. Prinsip Percobaan
Penambahan garam pada konsentrasi rendah dapat meningkatkan kelarutan protein (salting in) tetapi protein akan mengalami prepitasi pada konsentrasi garam yang tinggi (salting out). Garam yang biasa digunakan adalah amonium sulfat, sodium sulfat, dan sodium klorida. Endapan yang terbentuk dapat dilarutkan kembali, protein tidak mengalami denaturasi. Mekanisme salting out terjadi melalui dehidrasi protein akibat penambahan garam. Ion garam dapat menarik molekul air yang melarutkan protein, sehingga protein menjadi tidak larut. Pemisahan protein putih telur dapat dilakukan dengan fraksinasi.
SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium Dodesil Sulfat adalah teknik elektroforesis gel yang menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja. Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan deterjen ionik yang dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur protein. Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen. Metode SDS-PAGE digunakan untuk memisahkan protein demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi molekuler. III. Data Pengamatan
Data migrasi Marker
Jarak migrasi (cm) Mr (kDa) Log Mr
0.5 116 2.06446
1.4 66,2 1.82086
2.5 45 1.65321
3.4 35 1.54407
Sampel
Fraksi Jarak migrasi
0-20 % r1 = 2.1r2 = 3,7
20-50 % r1 = 2.0
r2 = 3,6
50-70 % r1 = 2.1
r2 = 3,5
IV. Pengolahan data
2. Perhitungan ukuran protein berdasarkan jarak migrasi
Dari kurva tersebut maka didapatkan nilai regresi y = -0.157x + 2.0854 Maka akan didapatkan nilai kDA :
y = mx + c
Log kDA = m(jarak tempuh) + c Untuk fraksi 0-20% (NH4)2SO4
Log kDA = -0,157 (2,1) + 2.0854 Log kDA = 1.7557
kDA = 56.97706
Dengan cara yang sama, diperoleh Mr protein pada berbagai fraksi: Fraksi Jarak migrasi log kDa Mr (kDa)
0-20 % 2,13,7 1.75571.5045 56.9770631.95214 20-50 % 2,03,6 1.77141.5202 59.0744933.12836 50-70 % 2,1 3,5 1.7557 1.5359 56.97706 34.34788 V. Pembahasan
Pada percobaan kali ini, dilakukan pemurnian senyawa protein dari putih telur dengan metode fraksinasi. Fraksinasi adalah proses pemisahaan senyawa tertentu dari campurannya. Dimana untuk percobaan ini metode fraksinasi yang digunakan adalah dengan memanfaatkan prinsip salting out. Salting out adalah proses berkurangnya kelarutan protein atau proses pengendapan protein yang disebabkan adanya konsentrasi garam dalam larutan yang terlalu tinggi. Proses ini terjadi karena garam akan lebih mudah terhidrasi oleh air dibandingkan protein dikarenakan entropi dari hidrasi garam lebih tinggi (luas permukaan ion garam total akan lebih besar). Sesuai hukum termodinamika, suatu proses akan mengarah kepada penambahan entropi sistem sehingga protein kurang terhidrasi dan akhirnya menggumpal satu sama lain dan mengendap. Pada percobaan ini digunakan garam amonium sulfat, karena garam ini memiliki kelarutan yang sangat tinggi dalam air, juga tidak berbahaya dan dijual dengan harga yang relatif murah dipasaran.
Dari hasil pengamatan, terdapat perbedaan pengendapan dalam segi kuantitas pada setiap fraksi, hal ini dikarenakan dalam sampel putih telur terdapat beberapa jenis senyawa protein yang memiliki titik isoelektrik yang berbeda sehingga terdapat senyawa protein yang mengendap hanya saat konsentrasi garam amonium sulfat yang ditambahkan mencapai 50% dan 70%. Perbedaan kelarutan protein bergantung kepada kehidrofobikan dari muatan dan kehidrofilikan permukaan protein. Karena protein merupakan polimer dari asam amino, maka kehidrofobikan protein ditentukan oleh gugus samping (gugus R) residu asam amino; jika protein sebagian besar terdiri dari asam amino dengan gugus
R-nya hidrofobik maka protein yang terbentuk memiliki sifat hidrofobik yang besar. Protein dengan kelarutan yang kecil mengindikasikan permukaan protein dengan hidrofobilitas yang besar, sedangkan protein dengan hidrofobilitas yang kecil akan larut dalam pelarut polar (contoh : air).
Endapan yang dihasilkan pada proses fraksinasi tersebut kemudian dianalisis dengan menggunakan teknik SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis), SDS-PAGE adalah metode pemisahan elektroforesis berdasarkan berat dari senyawa-senyawa yang akan dipisahkan dengan bantuan medan listrik yang mengalir melalui perantaraan fasa diam gel. Untuk pemisahan senyawa protein, gel yang digunakan adalah gel yang dibuat dari poliacrylamida. Protein akan bergerak dengan kecepatan migrasi yang berbeda sesuai dengan berat dan ukurannya. Protein yang lebih besar, akan memiliki kecepatan migrasi yang lebih lambat dan akhirnya akan memilki jarak migrasi yang paling kecil begitu juga sebaliknya. Data jarak migrasi ini kemudian dibandingkan dengan marker SDS-PAGE melalui kurva kalibrasi sehingga akan diperoleh data massa molekul protein dalam masing-masing fraksi.
Gel yang digunakan adalah poliacrylamida dengan Bahan yang digunakan dalam pembuatan stacking gel ini yaitu 40 % akrilamid yang digunakan sebagai pembentuk pori-pori untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran yang dimilikinya, akrilamid dipilih juga karena larutan ini bersifat inert sehingga tidak bereaksi dengan sampel protein. Pada gel ini juga ditambahkan buffer tris pH 6.8 ini guna membuat protein bermuatan negatif dan untuk mempertahan pH protein agar tidak berubah. 10 % H2O berperana sebagai pelarut polar dan media polar untuk aliran listrik dalam gel. Reagen 10 % SDS juga digunakan sebagai surfaktan yang mendenaturasi protein dengan memutuskan ikatan disulfide protein agar menjadi unfolding dan dapat menyelubungi protein dengan muatan negatif. 10 % APS dimasukkan sebanyak 50 μL sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid. TEMED digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur. Bagian gel yang kedua, separating gel, berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, komposisi gel separating ini tidak jauh berbeda dengan stacking gel, hanya saja berbeda pada volume dari setiap zat yang digunakan. Pada pembuatan gel ini buffer tris yang digunakan bukan pada pH 6.8 tapi pada pH 8.8 ini berfungsi untuk menjaga agar muatan protein tetap negatif. Dalam gel tersebut terdapat TEMED yang berfungsi sebagai katalis pembentukan
gel dan penstabil buffer tris. Selain itu terdapat APS yang berfungsi untuk mengaktifkan TEMED. Setelah setiap fraksi dimasukkan ke dalam gel, maka gel tersebut dielektroforesis. Setelah itu dilakukan staining dengan menggunakan Coomasie Brilliant Blue dalam waterbath agar band yang timbul tampak jelas. Setelah itu dilakukan destaining agar band dapat diamati.
Untuk analisis jenis protein yang dipisahkan, digunakan UNSTAINED PROTEIN MOLECULAR WEIGHT MARKER sebagai perbandingan, yang nantinya hasil band dari marker tersebut diterjemahkan dalam bentuk kurva jarak migrasi terhadap Log Mr. Sehingga didapatkan fungsi regresinya untuk menghitung Mr dari tiap senyawa protein yang dianalisis dalam sampel.
Pada hasil percobaan yang dilakukan, didapatkan hasil metode SDS-PAGE yang kurang baik. Hal ini diindikasikan karena saat pembuatan gel, campuran komposisi gel tidak tersebar merata. Hal ini ditunjukan dari hasil noda yang ditimbulkan tidak berbentuk pita melainkan menyebar keluar jalur. Komposisi gel yang tidak merata dapat menimbulkan pori-pori yang dihasilkan tidak merata pula, sehingga mengakibatkan senyawa protein tidak dapat mengalir melalui gel dengan baik. Karenanya untuk menanggulanginya , proses pengadukan komponen penyusun gel harus dilakukan dengan cukup lama agar tercapai pemerataan komponen.
Selain dengan menggunakan fraksinasi, pemurnian protein dapat dilakukan dengan berbagai metode lain, salah satunya adalah metode Dialisis. Metode dialisis adalah proses perpindahan molekul terlarut dari suatu campuran larutan yang terjadi akibat difusi pada membran semi-permeabel. Molekul terlarut yang berukuran lebih kecil dari pori-pori
membran tersebut dapat keluar, sedangkan molekul lainnya yang lebih besar akan tertahan di dalam kantung membran. Selulosa adalah salah satu jenis materi penyusun membran dialisis yang cukup umum dipakai karena bersifat inert untuk berbagai jenis senyawa atau molekul yang akan dipisahkan. Laju difusi ditentukan oleh beberapa kondisi:
Konsentrasi molekul pelarut yang akan keluar dari kantung dialisis. Jika konsentrasi molekul terlarut di lingkungan lebih kecil dibandingkan dengan yang ada di dalam kantung dialisis maka laju difusi akan semakin cepat.
Luas permukaan kantung dialisis. Semakin luas permukaan membran yang digunakan maka laju difusi akan semakin cepat.
Volume pelarut. Jika rasio luas permukaan membran dengan volume pelarut besar maka laju difusi akan berlangsung dengan cepat karena molekul terlarut dapat berdifusi dalam jarak yang dekat.
VI. Kesimpulan
Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa dari tiap fraksi telah terdeteksi beberapa protein dengan Mr sebagai berikut :
Fraksi 0 - 20 % = 56.97706 kDa 31.95214 kDa Fraksi 20 - 50% = 59.07449 kDa 33.12836 kDa Fraksi 50 - 70% = 56.97706 kDa 34.34788 kDa VII. Daftar pustaka
Boyer, Rodney F. 1993. Model Experimental Biochemistry, 2nd ed. Michigan: The Benjamine/ Cummings Publishing Company, Inc. Page: 248-249
Muchtadi, D., Nurheni Sri Palupi, dan Made Astawan. 1992. Metode kimia biokimia dan biologi dalam evaluasi nilai gizi pangan olahan. Hal.: 5-28, 82-92, dan 119-121.
http://abo.com.pl/pl/p/Unstained-Protein-Molecular-Weight-Marker/14370 (diakses pada tanggal 7 Oktober 2014 pada pukul 20.37)
