KARYA AKHIR
HUBUNGAN EKSPRESI PROGRAMMED DEATH-LIGAND 1 (PD-L1) DENGAN DERAJAT TUMOUR-INFILTRATING
LYMPHOCYTES (TILs) PADA ADENOKARSINOMA KOLOREKTAL
THE CORRELATION BETWEEN PROGRAMMED DEATH-LIGAND 1 (PD-L1) EXPRESSION AND THE DEGREE OF TUMOUR-
INFILTRATING LYMPHOCYTES (TILs) IN COLORECTAL ADENOCARCINOMA
NURSAKTI HAMZAH
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS-1 (Sp.1) PROGRAM STUDI ILMU PATOLOGI ANATOMI
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019
KARYA AKHIR
HUBUNGAN EKSPRESI PROGRAMMED DEATH-LIGAND 1 (PD-L1) DENGAN DERAJAT TUMOUR-INFILTRATING
LYMPHOCYTES (TILs) PADA ADENOKARSINOMA KOLOREKTAL
THE CORRELATION BETWEEN PROGRAMMED DEATH-LIGAND 1 (PD-L1) EXPRESSION AND THE DEGREE OF TUMOUR-
INFILTRATING LYMPHOCYTES (TILs) IN COLORECTAL ADENOCARCINOMA
NURSAKTI HAMZAH C107215204
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS-1 (Sp.1) PROGRAM STUDI ILMU PATOLOGI ANATOMI
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019
i
HUBUNGAN EKSPRESI PROGRAMMED DEATH-LIGAND 1 (PD-L1) DENGAN DERAJAT TUMOUR-INFILTRATING
LYMPHOCYTES (TILs) PADA ADENOKARSINOMA KOLOREKTAL
KARYA AKHIR
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Spesialis-1 (Sp.1)
Program Studi Ilmu Patologi Anatomi
Disusun dan diajukan oleh
NURSAKTI HAMZAH
Kepada
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS-1 (Sp.1) PROGRAM STUDI ILMU PATOLOGI ANATOMI
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019
ii
iii
iv
PRAKATA
Alhamdulilah puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, yang atas berkat rahmat dan hidayah-Nya sehingga karya akhir ini dapat diselesaikan dengan baik. Penulisan karya akhir ini merupakan salah satu persyaratan dalam rangka penyelesaian Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makassar. Disamping itu, penulis bermaksud untuk menyumbangkan pikiran mengenai programmed death-ligand 1 (PD-L1) dan tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) pada adenokarsinoma kolorektal.
Dalam penelitian dan penulisan karya akhir ini, penulis mendapat banyak bantuan dari berbagai pihak dan karena itu ucapan terimakasih yang sebesar- besarnya disampaikan kepada:
1. dr. Upik A. Miskad, Ph.D, SpPA(K), sebagai pembimbing pertama yang dengan penuh perhatian membimbing dan memberikan dorongan pada penyusunan karya akhir ini.
2. Prof. dr. Syarifuddin Wahid, Ph.D, SpPA(K), Sp.F sebagai pembimbing kedua dalam penelitian yang selalu membimbing, mendukung, mereview dan mendorong penulis hingga menyelesaikan karya akhir ini.
3. Dr. dr. Andi Alfian Zainuddin, MKM yang telah membimbing dan membantu penulis dalam metodologi penelitian dan analisis statistik dalam karya akhir ini.
4. dr. Ni Ketut Sungowati, Sp.PA(K), sebagai salah satu penguji dalam meneliti, mereview dan dengan penuh ketulusan membimbing penulis baik dalam penelitian ini maupun sebagai pengajar.
v 5. dr. Muh. Husni Cangara, PhD, Sp.PA sebagai salah satu penguji dalam penelitian dan dengan penuh ketulusan membimbing penulis baik dalam penelitian maupun pada masa pendidikan.
6. Dr. dr. Berti Julian Nelwan, Mkes, Sp.PA sebagai Ketua Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin yang selama ini telah membimbing sekaligus membina penulis selama menempuh masa pendidikan.
7. Dr. dr Rina Masadah, M.Phil, Sp.PA(K), yang pada saat penulis menyusun karya akhir ini masih menjabat sebagai Ketua Program Studi Departemen Patologi Anatomi yang selama ini telah membimbing dan mendorong penulis untuk menyelesaikan karya akhir ini dan membimbing penulis selama menempuh masa pendidikan.
8. Seluruh staf pengajar di bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin tanpa terkecuali (dr. Truly D.Dasril Sp.PA(K), dr.
Djumadi Achmad, Sp.PA(K), dr. Mahmud Ghaznawie, Sp.PA(K), dr.
Cahyono Kaelan, Sp.PA(K),SpS.,PhD, dr. Gunawan Arsyadi, Sp.PA(K), Dr.dr. Gatot S.Lawrence, Sp.PA(K), dr. Anna Maria Tjoanto, Sp.PA(K), dr.Juanita, Sp.PA, dr. Ruth Norika Amin, M.Kes,Sp.PA, dr. Imeldy Prihatni M.Kes,Sp.PA, dr. Andy Visi Kartika, M.Kes,Sp.PA, dr. Syamsu Rijal, M.Kes,Sp.PA, dr. Devy Marisca, M.Kes, Sp.PA) atas bantuan dan bimbingan selama penulis menempuh pendidikan maupun dalam penyusunan karya akhir ini.
9. Rektor dan Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makasar, atas kesediaannya menerima penulis menjadi peserta didik di Program
vi Pendidikan Dokter Spesialis-1, Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makasar.
10. Manajer Program Pendidikan Dokter Spesialis Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin.
11. Kementrian Kesehatan Republik indonesia atas bantuan dana pendidikan melalui Beasiswa Program Pendidikan Dokter Spesialis Kemenkes sejak tahun 2016.
12. Semua teman sejawat residen di Bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makassar atas bantuan dan dorongannya selama penulis menjalani masa pendidikan dan dalam penyusunan karya akhir ini, khususnya dr. Halidah Rahawarin, M.Kes, Sp.PA, dr. Yolanda Manule, dr. Huswatun Hasanah, dr. Rini Yusriany, dan juga atas kerjasama dan kekompakannya selama ini.
13. Seluruh pegawai di Bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin dan Laboratorium Patologi Anatomi Rumah Sakit Universitas Hasanuddin dan Rumah Sakit Wahidin Sudirohusodo Makasar, serta karyawan Sentra Diagnostik Patologia Makassar.
14. Orang tua (ayahanda Hamzah(alm.) dan ibunda Sitti Nuriah(almh.)), kakak- kakakku (Hasyim Hamzah, Nurwahidah Hamzah, Thabrani Hamzah, Hamdani Hamzah dan Nurjannah Hamzah), dan seluruh keluarga atas doa, dukungan dan kasih sayangnya kepada penulis.
15. Yang tercinta suami (Muhammad Yusuf Achmad,ST), dan anak (Arung Najwan Yusuf) yang telah menjadi pendorong dan penyemangat terbesar bagi penulis selama menjalani pendidikan.
vii 16. Semua pihak yang telah membantu penulis yang tidak dapat di sebutkan satu
persatu.
Akhirnya hanya Allah SWT yang dapat membalas semua amalan kebaikan yang telah diberikan. Semoga karya akhir ini dapat bermanfaat bagi kita semua dan rahmat-Nya senantiasa tercurah bagi kita semua. Akhir kata, penulis memohon maaf yang sebesar-besarnya apabila dalam tulisan ini terdapat hal-hal yang tidak berkenan.
Makassar, 10 Juni 2019
NURSAKTI HAMZAH
viii
ABSTRAK
Nursakti Hamzah
Hubungan Ekspresi Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1) dengan Derajat Tumour-Infiltrating Lymphocytes (TILs) pada Adenokarsinoma Kolorektal
Dibimbing oleh Upik A. Miskad, Syarifuddin Wahid
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan antara ekspresi programmed death-ligand 1 (PD-L1) sel tumor dengan derajat tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) pada adenokarsinoma kolorektal. Penelitian ini dilakukan dengan metode cross-sectional dengan mengambil 52 sampel adenokarsinoma kolorektal periode tahun 2014-2016 secara simple random. Terhadap spesimen dari sampel dilakukan pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi rabbit monoclonal PD-L1 dan dilakukan penilaian derajat TILs stroma berdasarkan pewarnaan hematoxylin-eosin (H-E).
Hasil penelitian menunjukkan terdapat hubungan bermakna antara ekspresi PD-L1 sel tumor dengan derajat TILs pada adenokarsinoma kolorektal berdasarkan uji Chi- square, yaitu diperoleh nilai p=0,017 (p<0,05). Hasil ini mengindikasikan bahwa derajat TILs berpotensi untuk digunakan sebagai salah satu faktor prediktif terhadap ekspresi PD-L1 sel tumor pada adenokarsinoma kolorektal.
Kata Kunci : PD-L1, TILs, adenokarsinoma kolorektal.
ix
ABSTRACT
Nursakti Hamzah
The Correlation between Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1) Expression and the Degree of Tumour-Infiltrating Lymphocytes (TILs) in Colorectal Adenocarcinoma
Supervised by Upik A.Miskad, Syarifuddin Wahid
The purpose of this study was to find out the correlation between programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of tumour cell and the degree of tumour- infiltrating lymphocytes (TILs) in colorectal adenocarcinoma. Cross-sectional method was used in this study by taking 52 samples of colorectal adenocarcinoma in the period of 2014-2016 using simple random technique. To each specimen of the samples, for PD-L1, immunohistochemistry (IHC) staining was performed using a rabbit monoclonal antibody, and the assessment of degree of stromal TILs was done on hematoxylin-eosin (H-E) staining. The result of this study showed that there was a significant correlation between PD-L1 expression of tumour cell and the degree of TILs in colorectal adenocarcinoma based on the Chi-square test where the value of p = 0.017 (p < 0.05) was obtained. It indicates that the degree of TILs has a potential to be used as one of the predictive factors to PD-L1 expression of tumour cell in colorectal adenocarcinoma.
Keywords: PD-L1, TILs, colorectal adenocarcinoma
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL i
HALAMAN PENGESAHAN ii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA AKHIR iii
PRAKATA iv
ABSTRAK viii
ABSTRACT ix
DAFTAR ISI x
DAFTAR TABEL xiv
DAFTAR GAMBAR xv
DAFTAR LAMPIRAN xvii
DAFTAR SINGKATAN xviii
BAB I. PENDAHULUAN 1
I.1. Latar Belakang Masalah 1
I.2. Rumusan Masalah 6
I.3. Tujuan Penelitian 6
I.3.1. Tujuan Umum 6
I.3.2. Tujuan Khusus 7
I.4. Hipotesis 7
I.5 Manfaat Penelitian 8
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 9
II.1. Anatomi dan Histologi Kolorektal 9
II.2. Kanker Kolorektal 12
II.2.1. Definisi Kanker Kolorektal 12 II.2.2. Insiden Kanker Kolorektal 13
xi
II.2.3. Jenis Kanker Kolorektal 14
II.2.4. Faktor Resiko Kanker Kolorektal 14 II.2.5. Sistem Grading Adenokarsinoma Kolorektal 16 II.2.6. Sistem Staging Kanker Kolorektal 17 II.2.7. Karsinogenesis Kanker Kolorektal 18
II.3. Aspek Imunologi Tumor 23
II.3.1. Antigen Tumor 23
II.3.2. Respon Imun Terhadap Tumor 27
II.3.3. Checkpoint Signaling Imun 32
II.4. Faktor Prognostik Pada Kanker Kolorektal 42 II.4.1. Tumour-Infiltrating Lymphocytes (TILs) 42 II.4.2. Ekspresi Programmed Death-Ligand 1
(PD-L1) 43
II.5. Penanganan Kanker Kolorektal 44
Kerangka Teori 49
Penjelasan Kerangka Teori 50
BAB III. KERANGKA KONSEP 52
III.1. Identifikasi Variabel 52
III.2. Klasifikasi variabel 52
Kerangka Konsep 53
BAB IV. METODOLOGI PENELITIAN 54
IV.1. Desain Penelitian 54
IV.2. Tempat dan Waktu Penelitian 54
IV.3. Populasi Penelitian 54
IV.4. Sampel dan Cara Pengambilan Sampel 54
IV.5. Perkiraan Besar Sampel 55
IV.6. Kriteria Inklusi dan Eksklusi 55
xii
IV.6.1. Kriteria Inklusi 55
IV.6.2. Kriteria Eksklusi 56
IV.7. Cara Kerja 56
IV.7.1. Alokasi Subyek 56
IV.7.2. Prosedur Pewarnaan Hematoxylin-Eosin 57 IV.7.3. Prosedur Pewarnaan Imunohistokimia 58 IV.7.4. Interpretasi Hasil Pewarnaan
Imunohistokimia 59
IV.7.5. Metode Skoring Tumour-Infiltrating
Lymphocytes (TILs) 59
IV.8. Definisi Operasional dan Kriteria Obyektif 62
IV.8.1. Definisi Operasional 62
IV.8.2. Kriteria Obyektif 63
IV.9. Pengolahan dan Analisa Data 65
IV.10. Alur Penelitian 66
IV.11. Personalia Penelitian 66
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN 67
V.1. Hasil Penelitian 67
V.1.1.Jumlah Sampel 67
V.1.2. Karakteristik Sampel 74
V.1.3. Analisis Perbedaan Derajat TILs
Berdasarkan Grade Histopatologi 75 V.1.4. Analisis Perbedaan Ekspresi PD-L1
Berdasarkan Grade Histopatologi 77 V.1.5. Analisis Hubungan Ekspresi PD-L1
dengan Derajat TILs 78
V.2. Pembahasan 79
xiii V.2.1. Perbedaan Derajat TILs Berdasarkan
Grade Histopatologi 81
V.2.2. Perbedaan Ekspresi PD-L1 Berdasarkan
Grade Histopatologi 83
V.2.3. Hubungan Ekspresi PD-L1 dengan
Derajat TILs 85
BAB VI. KESIMPULAN DAN SARAN 87
VI.1. Kesimpulan 87
VI.2. Saran 87
DAFTAR PUSTAKA 89
xiv
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
Tabel 1. Kriteria derajat histologi adenokarsinoma kolorektal 17
Tabel 2. Karakteristik sampel 74
Tabel 3. Derajat TILs berdasarkan grade histopatologi 75 Tabel 4. Ekspresi PD-L1 sel tumor berdasarkan grade histopatologi 77 Tabel 5. Ekspresi PD-L1 sel tumor dengan derajat TILs 78
xv
DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman
Gambar 1. Anatomi kolorektal 9 Gambar 2. Histologi kolorektal yang menunjukkan empat lapisan
dinding usus besar. 12
Gambar 3. Perubahan morfologi dan molekuler pada adenoma-
carcinoma sequence. 21
Gambar 4. Perubahan morfologi dan molekuler pada mismatch repair
pathway 23
Gambar 5. Tiga fase ‘cancer immunoediting’ terdiri dari fase
elimination, equilibrium, dan escape 30 Gambar 6. Struktur gen, mRNA dan protein PD-L1 35
Gambar 7. Struktur protein PD-L1 36
Gambar 8. PD-1/PD-L1 signaling, menurunkan proliferasi, survival
dan produksi sitokin dari sel T CD8+ 41 Gambar 9. Konsep imunoterapi pada suatu kanker 46 Gambar 10. Langkah-langkah dalam penilaian derajat TILs 61 Gambar 11. TILs stroma dilaporkan dalam persentase 62 Gambar 12. Adenokarsinoma rekti diferensiasi baik, obj.4x 68 Gambar 13. Adenokarsinoma rekti diferensiasi sedang, obj.10x 68 Gambar 14. Adenokarsinoma kolon diferensiasi buruk, obj.4x 68 Gambar 15. TILs derajat rendah, obj.4x(A) dengan area stroma
yang menunjukkan TILs 10%, obj.10x(B) 69 Gambar 16. TILs derajat sedang. Area stroma yang menunjukkan
TILs 20% obj.10x (A) dan area stroma dengan TILs
30%, obj.10x (B) 70
xvi Gambar 17. TILs derajat tinggi, obj.4x (A), dengan area stroma
yang menunjukkan TILs 70%, obj.10x (B) 70 Gambar 18. A,B: sampel dengan ekspresi PD-L1 positif (terwarnai
pada ≥ 50% sel tumor/skor 2), obj.4x 71 Gambar 19. A,B: sampel dengan ekspresi PD-L1 positif (terwarnai
pada 5%-49% sel tumor/skor 1), obj.4x 71 Gambar 20. A,B: sampel dengan ekspresi PD-L1 negatif (< 5%
sel tumor yang terwarnai / skor 0), obj.4x 72 Gambar 21. Ekspresi PD-L1 dengan intensitas kuat, obj.40x 72 Gambar 22. Ekspresi PD-L1 dengan intensitas sedang, obj.40x 72 Gambar 23. Ekspresi PD-L1 dengan intensitas lemah, obj.40x 73 Gambar 24. Ekspresi PD-L1 negatif, obj.40x 73
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
1. Keterangan Kelaikan Etik (Ethical Clearence) 2. Daftar Sampel Penelitian
xviii
DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN
PD-L1 programmed death-ligand 1
TILs tumour-infiltrating lymphocytes
H-E hematoxylin-eosin
MHC major histocompatibility complex MSI microsatellite instability
MSI-h microsatellite instability-high
NK natural killer
IFN-γ interferon-gamma
PD-1 programmed death-1
FAP familial adenomatous polyposis
MMR mismatch repair
EMAST elevated microsatellite alterations at selected tetranukleotida repeats
CEA carcinoembryogenic antigen
AFP Α-fetoprotein
APC antigen presenting cell
CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4
TCR T-cell receptor
ITIM immune receptor tyrosine-based inhibitory motif ITSM immunoreceptor tyrosine-based switch motif MAPK mitogen-activated protein kinase
PI3K phosphoinositide 3-kinase
HIF-1 hypoxia-inducible factor alpha
HRE hypoxia response element
STAT-3 signal transducer and activation of transcription-3
xix
miR microRNA
Bcl-xl B-cell lymphoma-extra large TGF-β Transforming growth factor beta
APC adenomatous polyposis coli
DNA deoxyribose-nucleic acid
RNA ribose-nucleic acid
KRAS Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog BRAF B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase HER-2 human epidermal growth factor receptor
EBV Epstein-Barr virus
HPV human papilloma virus
HTLV-1 human T-lymphotropic virus type 1
Treg regulatory T cell
CD cluster of differentiation
1 BAB I
PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang Masalah
Kanker kolorektal adalah keganasan ketiga yang paling sering ditemukan dan merupakan penyebab utama kematian keempat akibat kanker di dunia, dan terhitung sekitar 1,4 juta kasus baru dan hampir 700.000 kematian di tahun 2012. (Ferlay et al., 2015; Arnold et al., 2016) Pada tahun 2030, diperkirakan kejadiannya meningkat 60% menjadi lebih dari 2,2 juta kasus baru dan 1,1 juta kematian. (Arnold et al., 2016)
Kanker kolorektal merupakan kanker paling terbanyak ketiga pada pria dan yang kedua pada wanita. Pada tahun 2012, di seluruh dunia diperkirakan terdapat 746.000 kasus baru pada pria (10,0% dari total insiden kanker pada pria) dan terdapat 614.000 kasus baru pada wanita (9,2% dari total insiden kanker pada wanita). (Ferlay et al., 2015)
Kematian akibat kanker kolorektal di seluruh dunia lebih banyak dilaporkan di wilayah yang kurang berkembang, yaitu 52% pada tahun 2012 yang dianggap menggambarkan kelangsungan hidup yang lebih buruk di wilayah ini. (Ferlay et al., 2015) Di Indonesia, data tahun 2012 menunjukkan insiden kanker kolorektal pada pria menempati urutan kedua terbanyak setelah kanker paru-paru dan terbanyak ketiga pada wanita setelah kanker payudara dan kanker serviks. Sementara angka kematian akibat kanker kolorektal menempati urutan ketiga penyebab kematian
2 terbanyak pada pria akibat kanker, dan urutan keempat penyebab kematian terbanyak pada wanita. (WHO, 2014) Di Makassar, berdasarkan data dari Rumah Sakit Pendidikan Dr.Wahidin Sudirohusodo (RSWS) tercatat lebih dari 100 kasus kanker kolorektal tipe adenokarsinoma selama tahun 2017.(Data rekam medik RSWS)
Menurut jenis histopatologinya, kanker kolorektal memiliki berbagai macam jenis. Dari berbagai penelitian yang dilakukan mengenai kanker kolorektal, jenis yang paling banyak ditemukan adalah adenokarsinoma, yaitu lebih dari 90% kasus. (Fleming, Ravula, Tatishchev, & Wang, 2012 ; Schneider & Langner, 2014)
Limfosit yang ditemukan pada area tumor dikenal dengan sebutan tumour-infiltrating lymphocytes (TILs). (Jakubowska, Kisielewski, Kańczuga-Koda, Koda, & Famulski, 2017; Yao et al., 2017) TILs dianggap sebagai gambaran respon imun primer host melawan tumor, dimana TILs merupakan salah satu bagian penting dari lingkungan mikro tumor yang berperan dalam menekan pertumbuhan tumor. (Gooden, Bock, Leffers, Daemen, & Nijman, 2011; Mei et al., 2014; Bupathi & Wu, 2016) Salah satu subpopulasi dari TILs yang memegang peran penting dalam imunitas terhadap tumor adalah sel T sitotoksik CD8+ yang merupakan bentuk respon imun adaptif, yang dapat melakukan fungsi surveilans dengan mengenali dan membunuh secara langsung sel-sel target, dalam hal ini sel-sel tumor yang mengekspresikan peptida yang berasal dari antigen tumor dan dipresentasikan pada molekul major
3 histocompatibility complex (MHC) kelas I. (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2017;
Yao et al., 2017)
Saat ini, derajat TILs dapat dinilai dari preparat yang menggunakan pewarnaan hematoxylin-eosin (H-E) sesuai rekomendasi International TILs Working Group, 2014. TILs dapat dinilai pada intratumor, yaitu TILs yang bersentuhan langsung dengan sel tumor atau berada dalam sarang tumor, dan pada stroma tumor, yaitu area di antara sarang tumor.
Beberapa penelitian saat ini menyimpulkan bahwa TILs pada stroma lebih baik digunakan sebagai parameter dalam diagnostik dibandingkan TILs intratumor dengan menggunakan pewarnaan H-E. Penilaian TILs pada stroma tidak akan dipengaruhi oleh densitas dan pola pertumbuhan tumor, oleh karena TILs dinilai pada area di antara sarang tumor.
(Salgado et al., 2015)
Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa infiltrasi limfosit memiliki kaitan dengan survival yang lebih baik pada beberapa tipe kanker.
(Gooden et al., 2011) Penelitian dengan skala cukup besar dengan menggunakan 2369 sampel pasien kanker kolorektal di Israel mengarahkan bahwa TILs merupakan salah satu indikator prognostik setelah disesuaikan dengan usia, jenis kelamin, etnis, stadium, grade, dan status microsatellite instability (MSI). (Rozek et al., 2016) Hyuk et al dalam penelitiannya memperoleh hasil adanya hubungan yang signifikan antara derajat TILs dengan derajat diferensiasi tumor pada kanker kolorektal, yaitu derajat TILs yang rendah berhubungan dengan derajat diferensiasi
4 yang buruk. Penelitian tersebut juga mengkonfirmasi bahwa derajat TILs berhubungan secara signifikan dan independent dengan prognosis yang buruk terhadap overall survival tetapi bukan terhadap disease-free survival berdasarkan analisis multivariate. (Hyuk, 2012) Beberapa penelitian juga telah menunjukkan bahwa dengan adanya infiltrasi TILs, baik TILs intratumor maupun TILs pada stroma tumor, memiliki kontribusi terhadap prognosis yang lebih baik pada kanker kolorektal. (Deschoolmeester, Baay, Lardon, Pauwels, & Peeters, 2011)
Pada tahap awal karsinogenesis, sel-sel imun yang menginfiltrasi tumor terutama sel T CD8+ dan sel natural killer (NK) berpotensi membatasi pertumbuhan tumor atau mencegah metastasis sel tumor.
Namun, tumor juga dapat mengembangkan beberapa mekanisme untuk menghindari respon imun tubuh. (Parcesepe, Giordano, Laudanna, Febbraro, & Pancione, 2016; Smith & Kang, 2014)
Programmed death-1 (PD-1; CD279) adalah salah satu bagian dari sel T regulator yang terekspresi pada permukaan sel T, sel B dan NK aktif. (Keir, Butte, Freeman, & Sharpe, 2008; Wang et al., 2016) PD-1 dapat mengalami upregulasi selektif akibat paparan yang persisten terhadap antigen, sehingga ekspresi PD-1 pada sel T merupakan salah satu penanda akan sel T yang exhausted (kelelahan). (Dong, Sun, &
Zhang, 2017) Ligannya, programmed death -ligand 1 (PD-L1; B7-H1 dan CD274) terekspresi pada sel tumor, sel T dan sel B, makrofag, dan sejumlah tipe sel tertentu. Ikatan antara PD-L1 dengan PD-1 akan
5 menghantarkan sinyal inhibitor yang akan mengurangi produksi sitokin dan proliferasi sel T dan pada akhirnya akan menyebabkan peningkatan apoptosis sel T. Ekspresi PD-L1 pada tumor telah digambarkan sebagai marker prediktif untuk respon tumor terhadap imunoterapi anti-PD-1 atau anti-PD-L1 dalam beberapa tipe keganasan. (L. Wang et al., 2016)
Penelitian sebelumnya dengan sampel kanker kolorektal yang dilakukan oleh Rosenbaum et al di Amerika Serikat mendapatkan bahwa secara histologik, tumor dengan ekspresi PD-L1 positif lebih cenderung dengan diferensiasi yang buruk, dan berhubungan secara signifikan dengan usia yang lebih tua dan pada jenis kelamin wanita. Namun, dalam penelitian tersebut menggambarkan tumor dengan PD-L1 positif mengandung sejumlah besar TILs CD8+ dan secara signifikan TILs lebih cenderung pada tumor dengan ekspresi PD-L1 positif. (Rosenbaum, Bledsoe, Morales-Oyarvide, Huynh, & Mino-Kenudson, 2016) Sedangkan penelitian oleh Masugi et al, mengungkapkan ekspresi PD-L1 tumor kolorektal berbanding terbalik dengan kadar TILs pada analisis univariabel, namun tidak memiliki hubungan yang signifikan pada analisis multivariabel. Sampai saat ini, masih sedikit yang diketahui tentang hubungan yang kompleks antara PD-L1 dan TILs. (Masugi et al., 2017)
Penelitian ini pertama dilakukan dengan mengambil sampel penderita kanker kolorektal di Makassar, untuk menilai derajat TILs (pada stroma) dan ekspresi PD-L1 sel tumor pada kanker kolorektal tipe adenokarsinoma, dan selanjutnya untuk menentukan apakah derajat TILs
6 memiliki korelasi dengan ekspresi PD-L1, yang penting untuk digunakan sebagai faktor prediktif maupun prognostik pada penderita kanker kolorektal.
I.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian dalam latar belakang masalah di atas dapat dirumuskan pertanyaan penelitian sebagai berikut :
1. Apakah terdapat perbedaan derajat TILs pada adenokarsinoma kolorektal derajat diferensiasi baik, sedang, dan diferensiasi buruk?
2. Apakah terdapat perbedaan ekspresi PD-L1 sel tumor pada adenokarsinoma kolorektal derajat diferensiasi baik, sedang, dan diferensiasi buruk?
3. Apakah terdapat perbedaan derajat TILs pada adenokarsinoma kolorektal dengan ekspresi PD-L1 sel tumor yang negatif dan positif?
I.3. Tujuan Penelitian I.3.1. Tujuan Umum
Menentukan hubungan ekspresi PD-L1 sel tumor dengan derajat TILs pada kanker kolorektal tipe adenokarsinoma.
7 I.3.2. Tujuan Khusus
1. Menentukan derajat TILs pada adenokarsinoma kolorektal diferensiasi baik, diferensiasi sedang, dan diferensiasi buruk dengan pewarnaan H-E.
2. Menentukan ekspresi PD-L1 sel tumor pada adenokarsinoma kolorektal diferensiasi baik, diferensiasi sedang, dan diferensiasi buruk dengan pewarnaan immunohistokimia.
3. Membandingkan derajat TILs antara adenokarsinoma kolorektal dengan sel tumor yang menunjukkan ekspresi PD-L1 positif dan adenokarsinoma kolorektal dengan sel tumor yang menunjukkan ekspresi PD-L1 negatif.
I.4. Hipotesis
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah :
1. Terdapat perbedaan derajat TILs dengan derajat diferensiasi adenokarsinoma kolorektal : semakin rendah derajat TILs, semakin buruk derajat diferensiasinya.
2. Terdapat perbedaan ekspresi PD-L1 pada sel tumor dengan derajat diferensiasi adenokarsinoma kolorektal : semakin positif ekspresi PD-L1 pada sel tumor, semakin buruk derajat diferensiasinya.
8 3. Terdapat hubungan ekspresi PD-L1 sel tumor dengan
derajat TILs pada adenokarsinoma kolorektal : semakin positif ekspresi PD-L1 pada sel tumor, maka semakin rendah derajat TILs.
I.5. Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi ilmiah tentang konsep biologis hubungan ekspresi PD-L1 dan derajat TILs pada kanker kolorektal tipe adenokarsinoma.
2. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar penelitian lebih lanjut terutama aspek imunologi pada kanker kolorektal.
3. Data penelitian ini dapat digunakan sebagai faktor prediktif dan faktor prognostik penderita kanker kolorektal terutama untuk kepentingan imunoterapi.
9 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Anatomi dan Histologi Kolorektal
Usus besar (kolorektal) memanjang dari ileum terminal ke kanalis anus. Selain rektum dan appendiks vermiform, usus besar dibagi menjadi empat bagian: kolon kanan atau kolon ascendens, kolon tengah atau kolon transversum, kolon kiri atau kolon descendens, dan kolon sigmoid. Sigmoid bersambungan dengan rektum, yang berakhir pada kanalis anus. (AJCC, 2006)
Gambar 1. Anatomi kolorektal (Mescher, 2013)
10 Saekum merupakan kantong berongga yang berawal dari segmen proksimal kolon kanan. Ukurannya 6 cm hingga 9 cm dan diliputi oleh peritoneum. Kolon ascendens berukuran panjang 15-20 cm dengan permukaan posteriornya (maupun kolon descendens) hanya memiliki sedikit peritoneum sehingga kontak langsung dengan retroperitoneum.
Sebaliknya, permukaan anterior dan lateral dari kolon ascendens (dan kolon descendens) memiliki serosa dan berada intraperitoneal. Fleksura hepatika menghubungkan kolon ascendens dengan kolon transversum melewati hanya bagian inferior ke hepar dan anterior ke duodenum.
(AJCC, 2006)
Kolon transversum sepenuhnya intraperitoneal, ditunjang oleh mesenterium panjang yang melekat pada pankreas. Fleksura splenik menghubungkan kolon transversum ke kolon descendens, melewati bagian inferior ke limpa dan anterior ke cauda pankreas. Ukuran kolon descendens sepanjang 10–15 cm. Kolon kembali lagi menjadi sepenuhnya intraperitoneal di kolon sigmoid, dimana mesenterium berkembang pada batas medial dari m.psoas major posterior belakang dan meluas ke rektum. Transisi dari kolon sigmoid ke rektum ditandai oleh fusi tenia dari kolon sigmoid untuk membentuk otot longitudinal sirkumferensial dari rektum yang berada kira-kira 12–15 cm dari linea dentata. (AJCC, 2006)
Rektum memiliki panjang sekitar 12 cm, memanjang di proksimal dari fusi tenia ke puborektalis ring di distal. Rektum diliputi oleh
11 peritoneum di depan dan di kedua sisi pada sepertiga atas dan hanya di dinding anterior pada sepertiga bagian tengahnya. Peritoneum direfleksikan di lateral dari rektum untuk membentuk fossa perirectal dan di anterior, uterus atau lipatan rektovesikal. Tidak ada lapisan peritoneal di sepertiga bawah, yang sering diketahui sebagai ampula rektum. Kanalis anal, yang panjangnya 3-5 cm, memanjang dari puborectalis sling ke anal verge. (AJCC, 2006)
Histologi dinding usus besar terdiri dari empat lapisan : (Mescher, 2013)
1. Lapisan mukosa, terutama mengandung kelenjar intestinal tubular yang berada hingga ke muskularis mukosa, dilapisi oleh sel-sel goblet dan sel absortif dengan sejumlah kecil sel-sel neuroendokrin. Sel-sel absortif kolumnar atau kolonosit memiliki mikrovili yang iregular dan ruang interselular yang berdilatasi untuk absorbsi cairan yang aktif. Sel-sel goblet yang memproduksi mukus lubrikan menjadi lebih banyak di sepanjang kolon dan rektum. Stem cell epitelial berada pada sepertiga bawah setiap kelenjar.
2. Lapisan submukosa, memiliki vaskularisasi yang baik.
3. Lapisan muskularis, memiliki lapisan sirkuler yang khas, dengan otot longitudinal luar hanya ada pada tenia coli.
4. Lapisan serosa, dengan adventitia pada rektum.
Pada kanalis anal, epitel kolumnar yang melapisi rektum berubah menjadi epitel skuamous berlapis dari kulit anus. Di dekat anus, lapisan
12 sirkular dari muskularis rektum membentuk spinkter anus interna, dengan kontrol selanjutnya oleh otot striae dari spinkter anus eksterna. (Mescher, 2013)
Gambar 2. Histologi kolorektal yang menunjukkan empat lapisan dinding usus besar. (Mescher, 2013)
II.2 Kanker Kolorektal
II.2.1 Definisi Kanker Kolorektal
Kanker kolorektal didefinisikan sebagai keganasan yang timbul pertama kali di kolon atau rektum yang merupakan bagian akhir dari
13 traktus gastrointestinal. Keganasan yang berasal dari epitel kolorektal disebut dengan karsinoma kolorektal. (S.R. Hamilton, F.T. Bosman, P.Boffetta, M.Ilyas, 2010)
II.2.2 Insiden Kanker Kolorektal
Kanker kolorektal merupakan kanker paling terbanyak ketiga pada pria dan yang kedua pada wanita. Pada tahun 2012, di seluruh dunia diperkirakan terdapat 746.000 kasus baru pada pria (10,0% dari total insiden kanker pada pria) dan terdapat 614.000 kasus baru pada wanita, (9,2% dari total insiden kanker pada wanita). (Ferlay et al., 2015)
Di Indonesia, data tahun 2012 menunjukkan insiden kanker kolorektal pada pria menempati urutan kedua terbanyak setelah kanker paru-paru dan terbanyak ketiga pada wanita setelah kanker payudara dan kanker serviks. Sementara angka kematian akibat kanker kolorektal menempati urutan ketiga penyebab kematian terbanyak pada pria akibat kanker, dan urutan keempat penyebab kematian terbanyak pada wanita.
(WHO, 2014) Di Makassar, berdasarkan data dari Rumah Sakit Pendidikan Dr.Wahidin Sudirohusodo (RSWS) tercatat lebih dari 100 kasus kanker kolorektal tipe adenokarsinoma selama tahun 2017.
(Data rekam medik RSWS)
14 II.2.3 Jenis Kanker Kolorektal
Menurut jenis histopatologinya, kanker kolorektal memiliki berbagai macam jenis. Dari berbagai penelitian yang dilakukan mengenai kanker kolorektal, jenis yang paling banyak ditemukan adalah adenokarsinoma.
Lebih dari 90% karsinoma kolorektal adalah adenokarsinoma. Karsinoma kolorektal jenis lainnya yang lebih jarang meliputi karsinoma neuroendokrin, sel skuamous, sel spindel dan undifferentiated carcinoma.
(Fleming et al., 2012)
Lebih dari 90% karsinoma kolorektal merupakan adenokarsinoma yang berasal dari sel-sel epithelial dari mukosa kolorektal, dimana formasi glandular menjadi dasar dalam grading histopatologi pada adenokarsinoma kolorektal. (Fleming et al., 2012; S.R. Hamilton, F.T.
Bosman, P.Boffetta, M.Ilyas, 2010) Pada penelitian mengenai gambaran histologi kanker kolorektal dari tahun 1998-2001 di Amerika Serikat dengan 522.630 kasus kanker kolorektal didapatkan gambaran histopatologis dari karsinoma kolorektal sebesar 96% berupa adenokarsinoma, 2% karsinoma lainnya (termasuk karsinoid tumor), 0,4%
epidermoid carcinoma, dan 0,08% berupa sarcoma. (Stewart, Wike, Kato, Lewis, & Michaud, 2006)
II.2.4 Faktor Resiko Kanker Kolorektal
Secara umum perkembangan kanker kolorektal merupakan interaksi antara faktor lingkungan dan faktor genetik. Kanker kolorektal
15 dapat berkembang dari faktor lingkungan yang bersifat multipel yang beraksi terhadap predisposisi genetik. Terdapat banyak faktor yang dapat meningkatkan atau menurunkan resiko terjadinya kanker kolorektal.
Faktor resiko terhadap kanker kolorektal sendiri dapat dibagi menjadi dua, yaitu faktor yang dapat dimodifikasi seperti merokok dan konsumsi alkohol, dan yang tidak dapat dimodifikasi seperti riwayat kanker kolorektal atau polip adenoma individu dan keluarga. (Komite Penanggulangan Kanker Nasional, 2017)
Beberapa faktor resiko terhadap kanker kolorektal : (Komite Penanggulangan Kanker Nasional, 2017)
a. Faktor genetik. Sekitar 20% kasus kanker kolorektal memiliki riwayat keluarga. Kerentanan genetik misalnya pada familial adenomatous polyposis (FAP) dan hereditary nonpolyposis colon cancer syndrome menyebabkan kanker kolorektal.
b. Penurunan aktifitas fisik dan obesitas dihubungkan dengan resiko kanker kolon. Aktifitas fisik yang teratur bersifat protektif yang dikatakan dapat mengurangi resiko kanker kolorektal hingga 50%.
Sementara kurangnya aktifitas fisik dapat menyebabkan kelebihan berat badan yang dapat menjadi faktor yang meningkatkan resiko kanker kolorektal.
c. Faktor diet. Beberapa peneltian, termasuk yang dilakukan oleh American Cancer Society, menemukan bahwa konsumsi tinggi daging merah dan/atau daging yang telah diproses meningkatkan
16 resiko kanker kolorektal, begitu pula dengan mengkonsumsi daging merah yang dimasak pada temperatur tinggi dengan waktu masak yang lama. Selain itu, mengkonsumsi sedikit buah dan sayur juga memiliki resiko kanker kolorektal yang lebih tinggi.
d. Vitamin D. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa individu dengan kadar vitamin D yang rendah meningkatkan resiko kanker kolorektal, namun hubungan vitamin D dan kanker sampai saat ini masih belum diketahui secara pasti.
e. Merokok dan alkohol. Banyak penelitian telah membuktikan bahwa merokok tobako dapat menyebabkan kanker kolorektal. Individu yang mengkonsumsi alkohol secara sedang dengan 2-4 porsi per hari selama hidupnya, memiliki resiko 23% lebih tinggi terhadap kanker kolorektal dibanding individu yang mengkonsumsi kurang dari 1 porsi alkohol perhari.
II.2.5 Sistem Grading Adenokarsinoma Kolorektal
Sistem grading berdasarkan World Health Organization (WHO), yang mengklasifikasikan adenokarsinoma kolorektal menjadi 4 derajat (grade), yaitu : (S.R. Hamilton, F.T. Bosman, P.Boffetta, M.Ilyas, 2010)
17 Tabel 1. Kriteria derajat histologi adenokarsinoma kolorektal
Kriteria Kategori diferensiasi
Grade Descriptive grade
>95% bentukan glandular
Well-
differentiated
1 Low
50-95%
bentukan glandular
Moderately differentiated
2 Low
>0-49%
bentukan glandular
Poorly
differentiated
3 High
High level of microsatellite instability
Variable Variable Low
Kategori ” undifferentiated carcinoma “ (grade 4) ditujukan untuk karsinoma tanpa bentukan glandular, produksi mucin, atau neuroendocrine, squamous atau diferensiasi sarcomatoid;
Klasifikasi yang dikemukakan oleh C. Dukes (1929-1935) memberikan dasar pada berbagai sistem stadium yang digunakan sekarang. Klasifikasi ini terbagi menjadi 2 gambaran histopatologi, yaitu kedalaman penetrasi ke dalam dinding dan ada atau tidaknya metastase pada kelenjar limfe regional. Klasifikasi TNM saat ini lebih banyak dipakai menggantikan klasifikasi lainnya, termasuk klasifikasi Dukes. (S.R.
Hamilton, F.T. Bosman, P.Boffetta, M.Ilyas, 2010)
II.2.6 Sistem Staging Kanker Kolorektal
Klasifikasi staging (pentahapan) kanker digunakan untuk menentukan luas atau ekstensi kanker dan nilai prognostik pasien. Sistem yang paling banyak digunakan adalah sistem TNM yang dibuat oleh
18 American Joint Committee on Cancer (AJCC) dan International Union for Cancer Control (UICC). Sistem ini mengklasifikasikan ekstensi tumor primer (T), kelenjar getah bening regional (N) dan metastasis jauh (M), sehingga staging akan dinilai berdasarkan T, N dan M. Klasifikasi TNM yang terbaru adalah TNM edisi ke 7 dan mulai digunakan pada 1 Januari 2010. (Edge & Compton, 2010; Jacques et al., 2009)
II.2.7 Karsinogenesis Kanker Kolorektal
Mekanisme terjadinya kanker kolorektal dianggap merupakan kejadian molekuler yang heterogen termasuk faktor genetik dan epigenetik. Setidaknya terdapat 2 jalur genetik yang telah dikenal luas yaitu melalui jalur APC/β-catenin dan jalur microsatellite instability (MSI).
Kedua jalur ini merupakan akumulasi dari berbagai mutasi, akan tetapi berbeda dalam hal gen-gen yang terlibat pada masing-masing jalur.
Sementara faktor epigenetik, paling sering disebabkan oleh proses metilasi yang kemudian menginduksi gene silencing, dan dapat meningkatan progresifitas pada kedua jalur tersebut. (Kumar, Abbas, &
Aster, 2015)
Sekitar 5% dari semua kanker kolorektal disebabkan oleh mutasi genetik yang diwariskan, dan sisanya 95% kasus, sekitar 20% memiliki riwayat keluarga yang terkena namun tidak dapat dikategorikan ke sindrom kanker kolorektal herediter manapun. Hal ini dikatakan mungkin
19 disebabkan oleh perubahan genetik sekunder akibat predisposisi yang diturunkan, atau faktor dari diet dan lingkungan. (Dintinjana, Redzović, &
Dintinjana, 2014)
Adenoma-Karsinoma Sequence / Jalur APC/β-catenin
Transformasi dari mukosa kolon normal menjadi kanker invasif dapat berkembang melalui suatu tahapan akumulasi perubahan genetik dan epigenetik. Sebagian besar kanker kolorektal berkembang dari kondisi adenoma yang sudah ada sebelumnya yang memiliki lesi malignan genetik, dimana transformasi ini dapat berlangsung selama 10- 15 tahun. Perkembangan kanker kolorektal didasari oleh faktor spesifik dan mekanisme patogenetik yang bersifat kompleks dan heterogen.
Faktor-faktor etiologi termasuk paparan lingkungan dan pola makan, masih menjadi tantangan besar dalam mendefinisikan agen spesifik yang mempengaruhi resiko kanker kolorektal (Dintinjana et al., 2014)
Pada jalur ini, yang khas adalah mutasi dari APC (adenomatous polyposis coli) pada proses neoplastik awal. Untuk bisa menyebabkan adenoma, kedua kopi gen APC harus mengalami inaktifasi fungsional, baik melalui proses mutasi genetik ataupun melalui proses epigenetik.
Gen APC merupakan kunci negatif dari regulator β-catenin, sebuah komponen dari jalur Wnt signaling. β-catenin merupakan protein sitoplasmik tetapi bekerja pada nukleus sebagai faktor transkripsi. Protein APC normalnya mengikat dan memicu degradasi β-catenin, sehingga apabila fungsi APC hilang, maka β-catenin akan menumpuk dan
20 ditranslokasi ke inti sel, yang kemudian akan membentuk kompleks dengan DNA-binding factor TCF, selanjutnya mengaktifkan transkripsi gen termasuk MYC dan cyclin D1 yang akan memicu proliferasi sel. (Kumar et al., 2015)
Mutasi APC selanjutnya diikuti oleh mutasi gen lainnya, misalnya mutasi aktivasi KRAS, yang akan memicu pertumbuhan sel dan mencegah terjadinya apoptosis. Pendapat bahwa mutasi KRAS merupakan kejadian terakhir pada perkembangan kanker kolorektal, didukung oleh hasil penelitian bahwa mutasi KRAS jarang (<10%) ditemukan pada adenoma yang berukuran kurang dari 1 cm, tetapi sering (sekitar 50%) ditemukan pada adenoma yang berukuran lebih dari 1 cm dan pada adenokarsinoma kolorektal. (Kumar et al., 2015)
Polip adenomatosa atau adenoma adalah lesi prekursor yang penting untuk kanker. Hanya sebagian kecil adenoma berkembang menjadi kanker, dimana adenoma berukuran >1 cm diperkirakan memiliki kemungkinan 15% berkembang menjadi karsinoma selama periode 10 tahun. Individu dengan familial adenomatous poliposis yang sangat mempengaruhi perkembangan adenoma, dapat berkembang menjadi kanker kolorektal pada dekade ketiga sampai kelima kehidupan.
(Dintinjana et al., 2014)
Progresifitas tumor juga dihubungkan dengan mutasi pada gen-gen penekan tumor (tumor suppressor genes), seperti gen-gen yang
21 mengkode SMAD2 dan SMAD4 yang merupakan efektor sinyal transforming growth factor beta (TGF-β). Secara normal, sinyal TGF-β menghambat siklus sel, sehingga hilangnya fungsi dari gen tersebut menyebabkan pertumbuhan sel yang tidak terkontrol. Gen penekan tumor TP53, diketahui mengalami mutasi pada 70%-80% kanker kolon. (Kumar et al., 2015)
Gambar 3. Perubahan morfologi dan molekuler pada adenoma-carcinoma sequence. (Kumar et al., 2015)
Microsatellite Instability (MSI) Pathway
Mikrosatelit merupakan pengulangan singkat urutan nukleotida yang tersebar di seluruh genom. Karena dari cara berulang itu maka rentan terhadap kesalahan selama replikasi. Sistem mismatch repair (MMR) deoxyribose-nucleic acid (DNA) dapat mengenali dan memperbaiki kesalahan ini. Microsatellite instability (MSI) adalah konsekuensi dari ketidakmampuan sistem MMR memperbaiki kesalahan.
Anggota sistem MMR yang telah diidentifikasi adalah MSH2, MLH1, MSH6, PMS2, MLH3, MSH3, PMS1, dan Exo1.73. Sekitar 60% dari
22 semua kanker, terdapat bentuk lain dari MSI (EMAST-elevated microsatellite alterations at selected tetranukleotida repeats). (Dintinjana et al., 2014)
Pada pasien dengan defisiensi MMR DNA, mutasi-mutasi akan tertimbun di dalam pengulangan mikrosatelit, yang dihubungkan dengan MSI. Kondisi ini dihubungkan dengan MSI-high atau tumor MSI-h.
Beberapa rangkaian mikrosatelit berlokasi pada gen yang mengkode atau mempromosi regulasi pertumbuhan sel, misalnya gen yang mengkode reseptor TGF-β tipe II. Oleh karena TGF-β menghambat proliferasi sel epitel kolon, maka mutasi reseptor TGF-β tipe II dapat menyebabkan pertumbuhan sel yang tidak terkontrol. (Kumar et al., 2015)
Subset microsatellite unstable dari kanker kolon tanpa disertai mutasi dari MMR DNA, menunjukkan adanya hipermetilasi CpG island (CIMP). Pada tumor ini, region promotor MLH1 mengalami hipermetilasi, sehingga menyebabkan penurunan ekspresi MLH1 dan fungsi perbaikan.
Mutasi aktivasi pada onkogen BRAF(B-Raf proto-oncogene) sering ditemukan pada kanker ini, sebaliknya, KRAS dan TP53 tidak mengalami mutasi. Dengan demikian gabungan antara MSI, mutasi BRAF, metilasi pada target tertentu, seperti MLH1 merupakan ciri dari jalur karsinogenesis ini. (Kumar et al., 2015)
23 Gambar 4. Perubahan morfologi dan molekuler pada mismatch repair pathway.
(Kumar et al., 2015)
II.3. Aspek Imunologi Tumor
II.3.1 Antigen Tumor
Berbagai tumor ganas mengekspresikan berbagai jenis molekul yang akan dikenali oleh sistem imun sebagai antigen asing. Jika sistem imun mampu bereaksi terhadap tumor pada seorang individu, tumor tersebut pasti mengekspresikan antigen yang dilihat sebagai antigen asing (nonself) oleh sistem imun individu tersebut. (Abbas, Abul K, Lichtman,Andrew H. and Pillai, 2016)
Klasifikasi dari antigen tumor ini awalnya dibagi dua berdasarkan pola ekspresinya, yaitu tumor-spesific antigen dan tumor-associated antigen. Tumor-spesific antigen merujuk pada antigen yang diekspresikan hanya oleh sel tumor dan tidak pada sel normal, bisa bersifat unik hanya diekspresikan oleh satu jenis tumor dan bisa pula oleh beberapa tumor
24 dengan tipe yang sama. Sementara tumor-associated antigen merujuk pada antigen yang diekspresikan baik oleh sel tumor maupun oleh sel normal namun mengalami perubahan atau disregulasi. (Abbas et al., 2017)
Sekarang ini klasifikasi modern berdasarkan pada struktur molekuler, sumber antigen yang diekspresikan oleh sel tumor yang menstimulasi sel T, dan respon antibodi terhadap pejamunya.
Berikut ini merupakan pembagian utama dari antigen : (Abbas et al., 2017)
A. Produk dari gen-gen yang bermutasi.
Onkogen dan gen-gen tumor supressors yang bermutasi akan menghasilkan protein yang berbeda dengan protein seluler normal yang akhirnya bisa memicu respon tumor. Contoh produk onkogen adalah mutasi Ras, yang didapatkan pada sekitar 10 % karsinoma pada manusia. Contoh produk gen tumor supressors adalah p53 yang bermutasi yang didapatkan pada sekitar 50% tumor pada manusia.
Produk-produk dari gen ini bisa berupa protein sitosol maupun nuklear yang mengalami degradasi dalam proteasom sehingga bisa dipresentasikan oleh molekul MHC kelas I.
B. Protein seluler yang tidak bermutasi namun terekspresi secara abnormal.
Antigen tumor ini merupakan protein normal yang ekspresinya abnormal, sehingga memacu sistem imun. Contohnya adalah HER2
25 (human epidermal growth factor receptor 2) /Neu yang mengalami overekspresi pada kanker payudara dan karsinoma lainnya.
C. Antigen dari virus onkogenik.
Produk dari virus onkogen ini berperan sebagai antigen yang dapat memicu respon dari sel T. Kebanyakan dari tumor yang diinduksi oleh virus DNA ini, protein antigen yang mengkode virus terdapat dalam nukleus, sitoplasma, dan membran plasma sel tumor. Protein virus yang disintesis secara endogen ini dapat diproses dan dipresentasikan oleh molekul MHC pada permukaan sel tumor.
Peptida virus ini merupakan antigen asing, karenanya tumor yang diinduksi virus DNA ini merupakan tumor paling imunogenik yang diketahui. Contohnya virus EBV (Epstein-Barr virus) penyebab limfoma sel B dan kanker nasofaring, HPV (human papilloma virus) penyebab karsinoma di serviks, orofaring dan tempat lain, dan lain- lain. Contoh virus RNA (retrovirus) adalah human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) yang merupakan penyebab leukimia atau limfoma sel T pada orang dewasa.
D. Antigen Onkofetal
Protein ini terekspresi normal selama perkembangan normal fetus tetapi tidak pada jaringan matur, terekspresi pada level tinggi pada beberapa jenis kanker. Contohnya adalah carcinoembryogenic antigen (CEA) yang konsentrasinya meningkat pada keganasan kolon, pankreas, lambung, dan payudara. Α-fetoprotein (AFP) juga
26 merupakan antigen onkofetal yang meningkat pada karsinoma hepar, kanker sel germinal, dan kadang-kadang pada kanker pankreas dan lambung. Protein ini juga digunakan sebagai penanda tumor sehingga cukup penting untuk kepentingan diagnosis.
E. Antigen berupa glikolipid dan glikoprotein yang mengalami perubahan Kebanyakan dari tumor pada manusia dan tumor eksperimental mengekspresikan glikoprotein dan glikolipid permukaan yang konsentrasinya lebih tinggi ataupun dalam bentuk abnormal, yang dapat berfungsi sebagai penanda diagnostik maupun terapi target.
Molekul ini dapat berupa gangliosid, antigen blood group, dan musin.
Gangliosid yaitu GM2, GD2, dan GD3 merupakan glikolipid yang mengalami overekspresi pada neuroblastoma, melanoma, dan banyak sarkoma.
F. Antigen tissue-spesific differentiation
Tumor-tumor dapat mengekspresikan molekul yang secara normal hanya terekspresi pada sel asal tumor dan tidak pada jaringan lainnya. Antigen ini disebut differentiation antigens karena spesifik untuk stadium diferensiasi tertentu dari berbagai macam jenis sel.
Contohnya adalah tyrosine pada melanoma yang merupakan antigen diferensiasi melanosit. Contoh lain adalah CD10 dan CD20 yang merupakan penanda permukaan dari tumor-tumor yang berasal dari sel B. Antigen-antigen ini merupakan molekul normal diri sendiri sehingga biasanya tidak menginduksi respon imun yang kuat.
27 II. 3. 2 Respon Imun Terhadap Tumor
Selama lebih dari satu abad telah dikemukakan bahwa fungsi fisiologis sistem imun adaptif adalah untuk mencegah pertumbuhan berlebihan sel yang bertransformasi dan menghancurkan sel-sel tersebut sebelum sel-sel ini menjadi tumor yang berbahaya.
Pengendalian dan eliminasi sel ganas oleh sistem imun disebut sebagai immune surveillance. (Abbas, Abul K, Lichtman,Andrew H. and Pillai, 2016)
Menurut Dunn et al, terminologi yang lebih luas dan lebih tepat adalah cancer immunoediting yang mencakup 3 proses yaitu 3 E : elimination, equilibrium, dan escape. (Dunn, Bruce, Ikeda, Old, &
Schreiber, 2002) A. Fase Elimination
Fase ini mewakili proses yang dulunya merupakan konsep cancer immunosurveillance, yang bila mampu mengeradikasi tumor yang berkembang, maka tumor tidak akan masuk ke fase selanjutnya. Fase ini meliputi konsep dasar dari cancer immunosurveillance, dimana saat berhasil menghentikan perkembangan tumor, maka dapat dikatakan menggambarkan suatu proses editing yang sempurna tanpa melewati tahap selanjutnya. Pada tahap awal dari eliminasi, ketika suatu tumor solid mencapai ukuran tertentu, maka tumor akan bertumbuh invasif dan membutuhkan pasokan darah yang cukup akibat produksi dari
28 protein-protein yang stromagenik dan angiogenik. Pertumbuhan yang invasif menyebabkan kerusakan minor di jaringan sekitar yang akan menginduksi sinyal inflamatori dan akhirnya akan menarik sel-sel dari sistem imun innate (sel Natural Killer T (NKT), NK, sel T γδ, makrofag, dan sel dendritik) ke lokasi tersebut. Struktur pada sel-sel yang bertransformasi akan dikenali oleh infiltrasi sel imun seperti sel NKT, NK, atau sel T γδ yang nantinya akan menstimulasi produksi dari IFN-γ.
Pada fase kedua, IFN-γ yang pertama kali diproduksi dapat menyebabkan kematian tumor dalam jumlah yang terbatas sebagai akibat mekanisme antiproliferatif dan apoptotik. Selain itu, juga dapat menginduksi produksi dari kemokin CXCL 10 (interferon- inducible protein-10, IP-10), CXCL 9 (monokine induced by IFN-γ, MIG) dan CXCL 11 (inteferon-inducible T cell chemoacttractant, I-TAC) dari sel tumor itu sendiri sebagaimana dari jaringan normal sekitarnya.
Setidaknya beberapa dari kemokin ini memiliki kapasitas angiostatik yang poten yang dapat menghambat pembentukan pembuluh darah baru dalam tumor yang pada akhirnya dapat meningkatkan kematian sel-sel tumor. Debris sel tumor yang terbentuk baik akibat langsung maupun tidak langsung dari produksi IFN-γ pada tumor, kemudian akan diingesti oleh sel dendritik pada kelenjar limfe. Kemokin yang diproduksi selama proses inflamasi yang menghebat akan menarik lebih banyak sel-sel NK dan makrofag pada lokasi yang dimaksud. Pada fase ketiga, sel NK yang menginfiltrasi tumor dan makrofag akan berinteraksi
29 secara timbal balik dalam memproduksi IFN-γ dan IL-12, dan akan membunuh lebih banyak sel tumor melalui mekanisme yang melibatkan tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, perforin dan reactive oxygen, serta nitrogen intermediate. Saat pembersihan oleh kelenjar limfe, sel-sel dendritik baru yang berimigrasi akan menginduksi sel-sel T helper CD4+ spesifik tumor untuk menghasilkan IFN-γ yang pada akhirnya akan memfasilitasi perkembangan sel T CD8+ spesifik tumor. Pada fase keempat, sel-sel T CD8+ dan CD4+
akan menetap pada lokasi tumor, dan sel-sel T sitolitik akan menghancurkan sisa-sisa sel tumor yang mengekspresikan antigen yang imunogenitasnya meningkat akibat paparan dari produksi lokal IFN-γ.
B. Fase Equilibrium
Pada fase ini sistem imun pejamu dan sel tumor yang lolos dari fase eliminasi memasuki equilibrium yang dinamis, dimana sel-sel limfosit dan IFN-γ memberikan tekanan secara terus menerus terhadap sel tumor namun tidak dapat dieliminasi sepenuhnya, terdiri dari sel tumor yang bermutasi dan tidak stabil secara genetik. Periode ini mengikuti pola seleksi Darwin, dimana meskipun banyak sel tumor yang dihancurkan, tetapi muncul varian baru dengan mutasi yang berbeda yang meningkatkan resistensinya terhadap respon imun. Hasil akhir dari fase ini adalah populasi baru klon tumor dengan immunogenitas yang berkurang, berasal dari populasi parental yang heterogen akibat
30 manipulasi dari sistem imun. Sepertinya periode ini merupakan yang terpanjang dari ketiga fase, dan dapat berlangsung lebih dari periode bertahun-tahun.
C.Fase Escape
Pada fase ini, varian sel tumor yang telah diseleksi pada fase equilibrium sebelumnya dapat berkembang dalam lingkungan dengan sistem imun yang intak. Adanya defek dari sistem imun ini kemungkinan besar muncul ketika perubahan genetik dan epigenetik membuat sel tumor resisten terhadap deteksi dan/atau eliminasi sistem imun, yang membuat tumor dapat meluas dan bisa dideteksi secara klinis, dan bahkan dapat menyebabkan kematian.
Gambar 5. Tiga fase ‘cancer immunoediting’ terdiri dari fase elimination, equilibrium, dan escape. Pada a dan b : sel-sel tumor yang sedang berkembang (biru), varian sel tumor (merah), stroma dan sel-sel yang tidak bertransformasi (abu-abu). Pada c : varian tambahan dari tumor (oranye) yang terbentuk dari fase equilibrium. Lingkaran kecil berwarna oranye menandakan sitokin, dan flashes putih menandakan aktivitas sitotoksik limfosit melawan sel tumor. (Dunn et al., 2002)
31 Tubuh mampu melawan dan mengeliminasi sel-sel tumor melalui mekanisme pertahanan oleh sel-sel imun. Akan tetapi tumor menggunakan beberapa mekanisme untuk dapat menghindari destruksi oleh sistem imun : (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2016).
Beberapa tumor menghambat ekspresi antigen yang menjadi
sasaran serangan sistem imun. Tumor ini disebut antigen loss variant. Jika antigen yang hilang tersebut tidak terlibat dalam pemeliharaan sifat-sifat keganasan tumor tersebut, maka sel tumor varian tersebut akan terus tumbuh dan menyebar.
Tumor lain ada yang menghambat ekspresi MHC kelas I, sehingga
mereka tidak dapat menyajikan antigen kepada sel T CD8+. Sel NK mengenali molekul yang diekspresikan oleh sel tumor, namun tidak pada sel normal, dan sel NK akan teraktivasi jika sel targetnya tidak mempunyai molekul MHC kelas I. Oleh karena itu sel NK mempunyai mekanisme untuk membunuh sel tumor negatif MHC kelas I.
Tumor mengikat jalur yang menghambat aktivasi sel T. Beberapa
tumor mengekspresikan ligan untuk reseptor penghambat sel T (misalnya programmed death-1 (PD-1)). Tumor juga mungkin hanya memicu sedikit produksi kostimulator B pada antigen presenting cell (APC), menyebabkan kecenderungan pengikatan yang lebih memilih reseptor penghambat cytotoxic T-lymphocyte- associated antigen 4 (CTLA-4) pada sel T daripada reseptor
32 perangsang CD28. Hasil akhirnya adalah penurunan aktivasi sel T setelah pengenalan antigen tumor. Beberapa jenis tumor dapat memicu regulatory T cell (Treg), yang juga menekan respon imun anti tumor.
Terdapat tumor lain yang dapat mensekresi sitokin imunosupresif,
misalnya TGF-β, atau memicu sel Treg yang menekan respon imun.
II.3.3 Checkpoint Signaling Imun
Neoantigen yang dihasilkan oleh kanker sebagai akibat dari adanya sejumlah perubahan genetik maupun epigenetik, menjadi potensial untuk dikenali oleh sistem imun, sehingga dapat memicu respon imun sel T. Koordinasi oleh sel T sitotoksik yang akan berikatan dengan sel-sel kanker dan melakukan pembunuhan, diperlukan agar proteksi sistem imun menjadi efektif. (He, Hu, Hu, & Li, 2015) Dalam kondisi fisiologis yang normal, terdapat status keseimbangan antara molekul checkpoint imun yang membuat respon imun dari sel T tetap dalam intensitas dan cakupan yang tepat agar meminimalkan kerusakan pada jaringan normal di sekitarnya, dan mencegah reaksi autoimun. Namun, beberapa jalur dimanfaatkan oleh sel kanker untuk melakukan upregulasi sinyal negatif melalui molekul permukaan sel, yang akan menghambat aktivasi atau menginduksi apoptosis dari sel T, dan pada akhirnya dapat
33 memicu progresitas dan metastasis dari kanker. (He et al., 2015; Zou, 2005)
Penelitian pada molekul checkpoint imun saat ini terutama difokuskan pada CTLA-4, PD-1 dan ligannya PD-L1 (B7H1) dan PD-L2 (B7DC). Berbeda dengan CTLA-4 yang meregulasi aktivitas sel T terutama pada stadium awal, PD-1 membatasi aktivitas sel T dalam lingkungan mikro tumor terutama pada stadium yang lebih lanjut dari pertumbuhan tumor. (He et al., 2015; Zou, 2005)
CTLA-4 (CD152) adalah glikoprotein membran yang hampir menyerupai CD28, berikatan dengan ligan yang sama dari famili B7 (CD80 dan CD86) pada permukaan antigen APC. Adanya stimulasi antigenik dari T-cell receptor (TCR), menyebabkan sel T memperoleh kapasitas untuk mengekspresikan CTLA-4 yang akan mengikat molekul B7 dengan afinitas yang lebih besar dari CD28. Interaksi CTLA-4/B7 akan menghambat respon sel T, yang berbeda halnya dengan ikatan CD28/B7 yang mengaktifkan imunitas sitotoksik. Sehingga, hal ini penting dalam mempertahankan toleransi imun. (Passardi, Canale, Valgiusti, & Ulivi, 2017)
Programmed Death-1 (PD-1) dan Programmed Death-Ligand 1(PD-L1)
Pada saat sel T mengenali antigen yang diekspresikan oleh MHC pada sel target, sitokin inflamasi kemudian diproduksi yang akan memulai proses inflamasi. Sitokin ini menyebabkan programmed death-ligand 1
34 (PD-L1) terekspresi di jaringan, mengaktifkan protein programmed death-1 (PD-1; CD279) pada sel T yang mengarah pada toleransi imun. (Alsaab, Sau, Alzhrani, & Tatiparti, 2017)
PD-1 adalah suatu co-reseptor inhibitor yang terekspresi pada permukaan sel T CD8+ dan CD4+, sel NK, limfosit B, dan beberapa jenis TILs. (Passardi et al., 2017) Selain itu, PD-1 dapat mengalami upregulasi selektif akibat adanya paparan yang persisten terhadap antigen, sehingga ekspresi PD-1 pada sel T merupakan salah satu penanda akan T sel yang exhausted (kelelahan) . (Dong et al., 2017)
PD-1 adalah protein transmembran tipe 1 yang dikode oleh gen PDCD1. Struktur PD-1 tediri dari suatu extracelular IgV domain, suatu regio transmembran hidrofobik, dan intracellular domain. Intracellular tail meliputi suatu bagian yang potensial fosforilasi yang berlokasi pada immune receptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) dan immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM). Penelitian menunjukkan bahwa ITSM aktif penting untuk efek inhibitor PD-1 terhadap sel T. (He et al., 2015)
PD-1 memiliki dua ligan yaitu PD-L1 juga disebut B7-H1; (CD274) dan PD-L2 (B7-DC; CD273), yang keduanya merupakan coinhibitor. (He et al., 2015)
PD-L1 dikode oleh gen CD274 yang berada pada kromosom 9 manusia pada band p24. PD-L1 adalah protein 40kDa yang mengandung
35 290 asam amino. Disebutkan bahwa regio promoter dari gen CD274 mengandung beberapa elemen yang memberikan respon terhadap IFN-γ , yang diperlukan untuk upregulasi ekspresi PD-L1 yang dimediasi oleh IFN-γ. (Guo, Lin, & Kwok, 2017) PD-L1 berperan sebagai protein transmembran yang terdiri dari satu regio transmembran dan dua extracellular domain, Ig-C dan Ig-V. PD-L1 juga memiliki cytoplasmic domain yang pendek dan menyalurkan sinyal intraselular. Gen CD274 yang mengkode protein PD-L1 terdiri atas 7 ekson yang masing-masing ekson mengkode bagian tertentu dari protein PD-L1. (Chen J., Jiang,C.C., Jin L., and Zhang, 2015)
Gambar 6. Struktur gen, mRNA dan protein PD-L1. Gen PD-L1 mengandung 7 ekson, ekson 1 mengkode 5’UTR dan ekson 2-6 masing-masing mengkode signal sequence, IgV-like domain, IgC-like domain, transmembrane dan intracellular domain,dan ekson 7 mengkode intracellular domain dan 3’UTR.
Protein PD-L1 mengandung satu transmembrane domain dan 2 extracellular domain, IgV-like dan IgC-like. (Chen J., Jiang,C.C., Jin L., and Zhang, 2015)
36 Gambar 7. Struktur protein PD-L1. (Guo et al., 2017)
Regulasi PD-L1
Programmed death-ligand 1 (PD-L1) terekspresi pada sel tumor, sel T dan sel B, makrofag, dan sejumlah tipe sel tertentu. (L. Wang et al., 2016) PD-L1 terdapat pada membran plasma dan sitoplasma sel kanker, tapi tidak semua kanker atau tidak semua sel dalam suatu kanker mengekspresikan PD-L1. Ekspresi PD-L1 dipicu oleh molekul proinflamatori yang multipel, termasuk IFN-γ tipe I dan II, TNF-α, LPS, GM-CSF, dan VEGF, begitu pula dengan sitokin IL-10 dan IL-4, dimana IFN-γ merupakan pemicu yang paling poten yang dihasilkan oleh sel T yang teraktivasi. (He et al., 2015) Sementara itu, berbeda halnya dengan PD-L1 yang dapat terekspresi pada sejumlah tipe sel tertentu, ekspresi PD-L2 sangat terbatas pada APC. (Chen J., Jiang,C.C., Jin L., and Zhang, 2015)
37 Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekspresi PD-L1 diregulasi oleh beberapa signaling pathway, faktor transkripsional, dan faktor epigenetik. (Chen J., Jiang,C.C., Jin L., and Zhang, 2015)
1. Signaling Pathway MAPK Pathway
Aktivasi mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway dapat menyebabkan upregulasi ekspresi PD-L1. MAPK pathway berperan dalam upregulasi PD-L1 melalui aktivasi onkogenik dari EGFR pada non small cell lung carcinoma (NSCLC).
MAPK pathway juga terlibat dalam upregulasi PD-L1 pada sel-sel kanker yang mendapatkan terapi obat kemoterapi. Contohnya, paclitaxel menyebabkan ekspresi PD-L1 yang dihilangkan oleh MEK inhibitor U0126. Selain itu, konsentrasi cisplatin juga memicu ekspresi PD-L1 melalui aktivasi MAPK.
PI3K/Akt Pathway
Peranan Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt pathway dalam regulasi PD-L1 pada sel kanker pertama kali dicetuskan oleh penemuan bahwa penambahan PI3K inhibitor pada sel-sel melanoma yang resisten terhadap BRAF inhibitor menyebabkan pengurangan ekspresi PD-L1. Hal ini didukung oleh observasi bahwa penurunan PTEN menyebabkan upregulasi PD-L1 yang dihapus oleh inhibisi Akt. Menariknya, meskipun upregulasi transkripsional telah menunjukkan berkaitan dengan peningkatan
