1 BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Kanker adalah penyakit pertumbuhan sel yang terjadi akibat adanya kerusakan gen yang mengatur pertumbuhan dan diferensiasi sel (Sukardja, 2004). Selain itu, kanker merupakan kelompok penyakit yang dikarakteristikkan sebagai pertumbuhan sel yang tidak terkontrol, invasi jaringan lokal dan mengalami metastasis (Dipiro et al., 2005). Salah satu jenis kanker yang mengkhawatirkan wanita adalah kanker payudara. Lebih dari 1,2 juta perempuan didiagnosa menderita kanker payudara setiap tahun di seluruh dunia (Anonimd, 2010). Data yang didapatkan dari Departemen Kesehatan RI tahun 2008 menyatakan estimasi insiden kanker payudara di Indonesia mencapai 26 per 100.000 wanita (Chandra, 2009).
Usaha pengobatan kanker secara intensif telah dilakukan tetapi hingga saat ini belum ditemukan obat yang dapat mengatasi penyakit tersebut secara memuaskan. Hal ini disebabkan terutama karena rendahnya selektivitas obat-obatan antikanker yang digunakan ataupun karena patogenis kanker itu sendiri belum begitu jelas. Para peneliti berusaha mencari senyawa antikanker dari keanekaragaman hayati yang tersedia di Indonesia baik berdasarkan penggunaannya secara tradisional maupun dengan pendekatan secara kemotaksonomi (Bogoriani dkk., 2007).
Penggunaan obat tradisional secara umum dinilai lebih aman daripada penggunaan obat modern. Hal ini disebabkan karena obat tradisional memiliki efek samping yang relatif lebih sedikit daripada obat modern (Sari, 2006). Masyarakat Indonesia telah mengenal berbagai macam ramuan tradisional yang digunakan sebagai obat antikanker (Bogoriani dkk., 2007). Potensi obat tradisional sebagai antikanker perlu untuk terus dikembangkan.
Tanaman dari famili Zingiberaceae tumbuh luas di area perkebunan daerah tropis dan banyak digunakan dalam pengobatan tradisional untuk mengobati luka bengkak dan meningkatkan nafsu makan (Faizah et al., 2002). Rimpang dari tanaman anggota famili ini dilaporkan memiliki aktivitas antiinflamasi, antiulcer, antioksidan dan antimikroba (Faizah et al., 2002; Murakami et al., 2004 cit Adel et al., 2010). Spesies dari famili Zingiberaceae adalah Zingiber zerumbet (L) SM. (lempuyang gajah) dan lempuyang emprit (Zingiber littorale Val.). Zingiber zerumbet (L) SM. memiliki aktivitas suppresant COX-2, antiinflamasi, dan antitumor (Murakami et al., 2002; Sakinah et al., 2007; Tanaka et al., 2001 cit Abdulb et al., 2008). Sedangkan lempuyang emprit secara konsep kemotaksonomi Zingiber littorale Val. memiliki kekerabatan tinggi dengan Zingiber zerumbet L. sehingga dimungkinkan memiliki khasiat sama dengan lempuyang gajah (Marsusi dkk., 2001).
Salah satu komponen utama dari rimpang lempuyang gajah dan rimpang lempuyang emprit (Zingiber americans Bl.) adalah zerumbone (Riyanto, 2007). Zerumbone memiliki aktivitas antiinflamasi dengan penghambatan aktivasi NF-κB yang terdiri dari homodimer and heterodimer protein Rel/NF-NF-κB yang secara
langsung mengatur transkripsi gen (Giang et al., 2009). Zerumbone juga mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa (Abdulb et al., 2008), sel Coav-3 dan MCF-7 (Wahab et al., 2009). Zerumbone dilaporkan mampu bertindak sebagai agen antikanker cytoselective dan mampu menekan ekspresi iNOS dan COX-2 pada sel RAW 264,7 (Murakami et al., 2002). Ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah dan lempuyang emprit memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agen sitotoksik khususnya terhadap sel kanker payudara T47D. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji aktivitas sitotoksik kedua ekstrak terhadap sel kanker payudara T47D.
B. Rumusan Masalah
1. Apakah ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah (Zingiber zerumbet L.) dan lempuyang emprit (Zingiber littorale Val.) mengandung zerumbone?
2. Apakah ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah (Zingiber zerumbet L.) dan lempuyang emprit (Zingiber littorale Val.) memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D?
C. Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui kandungan zerumbone dalam ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah (Zingiber zerumbet L.) dan lempuyang emprit (Zingiber littorale Val.)
2. Untuk mengetahui aktivitas sitotoksik ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah (Zingiber zerumbet L.) dan lempuyang emprit (Zingiber littorale Val.)
terhadap sel kanker payudara T47D dengan menentukan nilai IC50nya menggunakan metode MTT.
D. Tinjauan Pustaka 1. Kanker
a. Karsinogenesis kanker
Kanker merupakan suatu penyakit sel dengan ciri gangguan atau kegagalan mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostatis lainnya pada organisme multiseluler (Ganiswara, 1995). Hal ini terkait erat dengan fungsi antioksidan dan antiinflamasi. Produksi berlebihan NO dan prostaglandin, akibat aktivitas iNOS dan COX-2, mendorong terjadinya penyakit kanker (Setyawan dan Darusman, 2008). Kanker atau neoplasma berkembang dari sel dalam mekanisme normal dengan kontrol pertumbuhan dan proliferasi yang berubah. Mekanisme terbentuknya kanker (kasinogenesis) terjadi melalui beberapa tahapan, yaitu: 1) Tahap Inisiasi
Tahap ini perlu pemaparan karsinogen terhadap sel normal. Karsinogen tersebut menyebabkan kerusakan genetik yang tidak dapat diperbaiki sehingga mengakibatkan mutasi sel yang bersifat ireversibel. Sel yang termutasi ini memiliki respon yang berubah terhadap lingkungannya dan tumbuh selektif sehingga berpotensi menjadi sel kanker (Di Piro et al., 2005).
2) Tahap Promosi
Selama tahap ini, karsinogen mengubah lingkungan untuk mempromosikan pertumbuhan sel termutasi melebihi sel normal. Berbeda dengan tahap inisiasi,
bahwa pada tahap promosi bersifat reversibel. Sifat ini menjadi target kemopreventif selanjutnya dengan perubahan lifestyle dan diet. Akan tetapi, pada titik tertentu sel yang termutasi akan menjadi kanker (Di Piro et al., 2005).
3) Tahap Progresi
Tahap akhir dari pertumbuhan tumor adalah progresi. Keterlibatan perubahan genetik menyebabkan proliferasi sel yang begitu cepat. Pada tahap ini melibatkan invansi tumor ke dalam jaringan lokal dan mengalami metastasis (penyebaran yang jauh) (Di Piro et al., 2005).
b. Karakteristik/ kemampuan sel kanker
Sel kanker memiliki pengaruh pada jalur regulator yang menguasai proliferasi dan homeostasis sel normal. Genotip sel kanker merupakan manifestasi perubahan esensial pada fisiologi sel yang secara kolektif memerintah pertumbuhan kanker.
1.) Self-sufficiency in growth signals
Sel normal memerlukan growth signals (GS) untuk melakukan proliferasi sel. Sedangkan sel tumor menghasilkan growth factors sendiri tanpa tergantung pada growth factors dari sel lain. Reseptor growth factors seringkali membawa aktivitas tirosin kinase di dalam sitoplasma yang diekspresikan secara berlebih pada sel kanker (Hanahan dan Weinberg, 2000).
2.) Insensitivity to antigrowth signals
Sinyal antiproliferasi pada jaringan normal mengatur untuk mempertahankan aktivitas sel dan homeostasis jaringan. Antigrowth signals dapat memblok proliferasi dengan mekanisme yang berbeda. Sel dipaksa keluar dari
siklus proliferasi aktif menuju fase istirahat (G0). Sel kanker selalu menghindari sinyal antiproliferasi. Gangguan jalur pRb menyebabkan terlepasnya faktor transkripsi E2F sehingga terjadi proliferasi sel yang membuat sel tersebut menjadi tidak sensitif terhadap faktor anti pertumbuhan (Hanahan dan Weinberg, 2000). 3.) Evasion of apoptosis
Kematian sel secara terprogram (apoptosis) bisa terjadi antara lain (Gambar 3): adanya famili Bcl-2 memberikan sinyal kematian supaya mitokondria melepaskan sitokrom C, protein p53 mengatur ekspresi proapoptosis Bax dalam merespon kerusakan DNA, serta adanya protease intraseluler (caspase) yang diaktivasi oleh reseptor kematian seperti FAS atau sitokrom C (Hanahan dan Weinberg, 2000). Selain itu, jalur yang juga berperan dalam apoptosis adalah jalur PI3K. PI3K ini merupakan salah satu protein anti-apoptosis. Protein ini akan diaktivasi oleh reseptor tirosin kinase yang selanjutnya akan mengkatalisis fosforilasi phospatidil inositol (IP) membentuk PI-3,4,5-P3 (PIP3). Kemudian PIP3 mengaktifkan Akt memainkan peranan dalam menghambat apoptosis (Ujiantari dkk., 2010). Resistensi sel kanker terhadap apoptosis terjadi karena rendahnya pengatur proapoptosis akibat mutasi protein penekan tumor p53 (Hanahan dan Weinberg, 2000).
Gambar 1. Jalur-jalur Pertumbuhan yang Muncul pada Sel Mamalia dan Mekanisme Apoptosis (Hanahan dan Weinberg, 2000)
4.) Limitless replicative potensial
Sel tumor yang dikultur menunjukkan bahwa potensi replikasi tak terbatas merupakan fenotif yang diperlukan selama perkembangan tumor dan esensial untuk perkembangan kanker. Mekanisme dalam limitless replicative potensial pada sel kanker yaitu mengatur ekspresi enzim telomere dengan menambahkan hexanucleotide ke dalam akhir DNA telomerik dan mempertahankan telomere melalui perubahan interkromosomal berbasis rekombinan. Jadi, kematian sel dapat diaktifkan dengan memperpendek telomere atau menentang sinyal pertumbuhan dengan memasuki fase G0 (Hanahan dan Weinberg, 2000).
5.) Sustained angiogenesis
Tanda awal angiogenesis yaitu adanya vascular endothelial growth factor (VEGF) dan fibroblast growth factor (FGF). Antibodi anti VEGF mampu
memperbaiki pertumbuhan tumor dan neovaskularisasi. Inhibitor angiogenesis prototipikal yaitu thrombospondin-1 yang mengikat CD36 . Hilangnya fungsi p53 dapat menyebabkan rendahnya kadar thrombospondin-1 sehingga melepaskan sel endothelial dari efek penghambatannya (Hanahan dan Weinberg, 2000).
6.) Tissue invasion and metastasis
Massa tumor berpindah, menyebar dan bergerak ke tempat lain membentuk koloni baru (kanker). Kemampuan invasi dan metastasis sel kanker mampu melepaskan massa tumor ke daerah tubuh yang memiliki nutrisi dan tempat memadai (Hanahan dan Weinberg, 2000).
c. Kanker Payudara
Kanker payudara adalah tumor ganas yang dimulai dari sel-sel payudara. Sebuah tumor ganas adalah sekelompok sel-sel kanker yang dapat tumbuh ke dalam (menginvasi) sekitar jaringan atau penyebaran (metastasis) ke daerah yang jauh dari tubuh. Penyakit ini hampir seluruhnya terjadi pada wanita, tetapi pria juga bisa mendapatkannya (Anonima, 2010).
Kanker payudara merupakan penyebab utama kematian pada wanita akibat kanker. Setiap tahunnya, di Amerika Serikat 44,000 pasien meninggal karena penyakit ini sedangkan di Eropa lebih dari 165,000 (Anonimb, 2010). Kanker payudara menduduki urutan kedua setelah kanker leher rahim di Indonesia (Tjindarbumi, 1995 cit Pane, 2002). Sejak 1988 sampai 1992, keganasan tersering di Indonesia tidak banyak berubah. Selain jumlah kasus yang banyak, lebih dari 70% penderita kanker payudara ditemukan pada stadium lanjut (Moningkey, 2000 cit Pane, 2002).
Ada beberapa faktor risiko yang berpengaruh terhadap kanker payudara antara lain: Usia lebih dari 50 tahun, tidak pernah hamil/ melahirkan anak < 2 orang, menyusukan anak dalam waktu singkat, menopause, kegemukan ( BMI > 23 kg/m2 ), asupan lemak tinggi, memiliki riwayat keluarga menderita kanker payudara, dan riwayat trauma tumpul payudara (Azamris, 2006).
Perubahan DNA dapat menyebabkan sel normal payudara menjadi kanker. Mutasi DNA dapat meningkatkan resiko perkembangan kanker. Gen penekan tumor sepeti BRCA1 dan BRCA2 menjaga tumor kanker dari perubahan. Ketika gen tersebut termutasi kanker akan semakin berkembang (Anonim, 2003). Sel kanker payudara T47D merupakan suatu sel yang morfologinya seperti sel epitel, yang diambil dari jaringan payudara seorang wanita. Sel ini dapat ditumbuhkan dengan media penumbuh RPMI 1640 dengan fetal bovine serum 10% pada suhu 37oC, dapat tumbuh secara kontinyu dan menempel pada flask (Nurulita dan Mahdalena, 2006). Sel kanker payudara T47D mengekspresikan Estrogen Reseptor (ER) (Meiyanto dkk., 2006) dan sensitif terhadap doxorubicin (Untung dkk., 2008).
2. Terapi kanker payudara
Agen kemoterapi kanker seringkali dikategorikan berdasar mekanisme aksi atau berdasarkan asalnya. Agen pengalkil menggunakan efeknya pada sintesis DNA dan protein dengan mengikat DNA dan mencegah pembalikan molekul DNA. Antimetabolit menyerupai komponen struktur nuklir (metabolit) seperti dasar nukleotida, atau menghambat enzim yang terlibat dalam sintesis DNA dan protein. Antibiotik antitumor mendapatkan namanya dari sumbernya, agen ini
merupakan produk fermentasi dari spesies Streptomyces. Doxorubicin (golongan Antrasiklin) diklasifikasikan sebagai antibiotik antitumor, tetapi lebih akurat untuk merujuk sebagai intercalating inhibitor topoisomerase. Antrasiklin (doxorubicin dan epirubicin) secara historis telah dikenal sebagai kelas paling aktif dari agen kemoterapi dalam pengobatan kanker payudara metastatik. Hal ini menimbulkan asumsi bahwa rejimen mengandung antrasiklin berhubungan dengan tingkat kesembuhan lebih tinggi dibandingkan dengan rejimen non-antrasiklin ketika digunakan dalam pengaturan adjuvant (Di Piro et al., 2005). 3. Kultur Sel
Sistem kultur sel sering digunakan untuk mengukur aktivitas biologi, sitotoksisitas, dan mutagenisitas. Kebanyakan uji, seperti aktivitas biologi dihubungkan dengan konsentrasi awal obat dalam medium kultur (Weinkam and Plakunov, 1989). Kegiatan kultur jaringan sangat tergantung dan ditentukan oleh pilihan media yang digunakan (Santoso dan Nursandi, 2002).
Media dan kultur memerlukan beberapa persyaratan supaya memberikan pemeliharan yang sesuai pada explan, yaitu sebagai berikut:
a. Parameter Fisiologis
1) Suhu 37oC untuk sel-sel dari homeother
2) Mempertahankan pH 7,2-7,5 dan osmolalitas dari medium 3) Mengatur kelembaban
4) Fase gas, kesetimbangan konsentrasi bikarbonat dan tekanan CO2
5) Cahaya, memiliki efek buruk pada sel-sel; produk senyawa beracun yang terinduksi cahaya dapat terjadi dalam beberapa media; sel harus dikultur
dalam gelap dan sesedikit mungkin terkena cahaya kamar (Anonime, 2010).
b. Kebutuhan media
1) Ion massal: Na, K, Ca, Mg, Cl, P atau CO2 2) Trace element: besi, seng, selenium
3) Gula, glukosa adalah gula yang paling umum 4) Asam amino, 13 asam amino esensial
5) Vitamin B 6) kolin, inositol
7) Serum, mengandung sejumlah besar pertumbuhan mempromosikan kegiatan seperti buffering nutrisi beracun dengan mengikat mereka, menetralisir tripsin dan protease lainnya, memiliki efek tidak terdefinisi pada interaksi antara sel dan substrat, dan berisi hormon peptida atau seperti hormon faktor pertumbuhan yang mempromosikan pertumbuhan yang sehat.
8) Antibiotik, meskipun tidak diperlukan untuk pertumbuhan sel, antibiotik sering digunakan untuk mengontrol pertumbuhan bakteri dan jamur kontaminan (Anonime, 2010).
c. Makanan, 2-3 kali / minggu.
d. Pengukuran pertumbuhan dan kelangsungan hidup.
Kelangsungan hidup sel dapat diamati secara visual dengan menggunakan mikroskop fase kontras terbalik. Sel hidup merupakan fase terang; sel suspensi biasanya bulat dan agak simetris; adherent cell akan membentuk proyeksi ketika
mereka melekat pada permukaan pertumbuhan. Perhitungan sel ditentukan menggunakan sebuah hemositometer (Anonime, 2010).
4. Tanaman Lempuyang Gajah a. Klasifikasi tanaman
Tanaman lempuyang gajah (Zingiber zerumbet L.) memiliki klasifikasi sebagai berikut:
Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Anak kelas : Zingiberidae Bangsa : Zingiberales Suku : Zingiberaceae Marga : Zingiber
Jenis : Zingiber zerumbet L. (Anonimb, 2009)
Gambar 2. Tanaman dan Rimpang Lempuyang Gajah
b. Sinonim
c. Nama daerah
Jawa : Lempuyang gajah (Jawa Tengah), Lempuyang paek (Madura) (Syamsuhidayat dan Hutapea, 2000).
d. Uraian tanaman
Lempuyang gajah merupakan tanaman berbatang semu dengan ketinggian mencapai 1 m dan mempunyai daun berwarna hijau yang berbentuk lancet, sedangkan permukaan bagian atas serta tangkai daun berbulu. Bunga muncul dari permukaan tanah, berwarna kuning hingga jingga, berbentuk bunga majemuk, dan berkelompok membentuk tandan yang dilengkapi dengan daun pelindung. Buah berbentuk bulat telur berwarna merah (Mursito, 2001).
e. Kandungan kimia
Rimpang mengandung minyak menguap seperti zerumbone, humulene, camphene (Faizah et al., 2002) dan α-caryophyllene (Purwanti dkk., 2003). Selain itu, mengandung saponin, flavonoida dan polifenol (Syamsuhidayat dan Hutapea, 2000). Uji fitokimia dari ekstrak etanol rimpang tersebut positif adanya komponen fenolik, tanin, asam amino, karbohidrat, dan alkaloid (Somchit et al., 2005). Hasil isolasi dari tanaman ini diperoleh adanya dua senyawa se-isomer yaitu 6-methoxy-2E,9E-humuladien-8-one dan stigmast-4-en-3-one (Jang dan Seo, 2005).
f. Kegunaan
Rimpang dimanfaatkan dalam ramuan sebagai obat pelangsing, penambah nafsu makan (stomakik), penghangat badan, obat pusing, obat disentri, dan membantu mengeluarkan gas (karminatif) pada perut kembung (Mursito, 2001). Penelitian terhadap ekstrak etanol dari rimpang memiliki aktivitas analgesik dan
antipiretik yang mampu menghambat inflamasi akibat induksi prostaglandin (Somchit et al., 2005). Zerumbone dan α-caryophyllene terdapat dalam rimpang dan daun serta kedua senyawa ini pada konsentrasi tinggi menunjukkan aktivitas antiinflamasi, antiulkus, antioksidan dan antimikroba (Jaganath dan Ng, 2000; Somchit dan Shukriyah, 2003; Mascolo et al, 1989; Agrawal et al., 2000; Nakatani, 2000 cit Bhuiyan et al., 2009).
5. Tanaman Lempuyang Emprit a. Klasifikasi tanaman
Tanaman lempuyang emprit (Zingiber littorale Val.) memiliki klasifikasi sebagai berikut:
Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Anak kelas : Zingiberidae Bangsa : Zingiberales Suku : Zingiberaceae Marga : Zingiber
Gambar 3. Tanaman dan Rimpang Lempuyang Emprit
b. Sinonim
Zingiber americans Bl. (Anonima, 2009). c. Nama daerah
Jawa : Lempuyang emprit (Jawa Tengah), Lempuyang pahit (Sunda), lempuyang pahit (Jakarta) (Syamsuhidayat dan Hutapea, 2000). d. Uraian tanaman
Tanaman ini merupakan semak, semusim, tegak, tingginya ± 75 cm. Berbatang semu dengan pelepah daun yang menyatu, di bawah tanah membentuk rimpang. Daunnya tunggal, berbentuk lanset, ujung runcing, tepi rata, pangkal tumpul, panjang 10-18 cm, lebar 2-2,5 cm, pelepah panjang ± 17 cm, bagian bawah merah, bagian atas hijau. Bunga berbentuk majemuk, landan, daun pelindung ujung melengkung, tabung mahkota kecil, taju putih, bentuk lanset, bibir kuning. Buahnya berbentuk kotak, bulat telur, panjang ± 12 mm, diameter ± 8 mm, berwarna merah. Berbiji bulat panjang, diameter ± 4 mm, memiliki warna coklat dan berakar serabut dengan warna putih (Syamsuhidayat dan Hutapea, 2000).
e. Kandungan kimia
Rimpang lempuyang emprit mengandung minyak atsiri, sterol, asam lemak, tanin, glikosida (poliosa), saponin, senyawa pereduksi (Pudjiastuti dkk., 2000) dan flavonoida (Syamsuhidayat dan Hutapea, 2000). Komponen penyusun minyak atsiri dalam lempuyang emprit antara lain linalool, α-caryophyllene, pinena, norpinena, 1,2-benzene dicarboxylyc acid (Purwanti dkk., 2003) serta zerumbone (Riyanto, 2007). Juga mengandung komponen fitosterol seperti kolesterol, kampesterol, stigmasterol, dan β-sitosterol (Riyanto, 2007).
f. Kegunaan
Rimpang Zingiber littorale Val. berkhasiat sebagai obat demam, rematik dan obat sakit perut (Syamsuhidayat dan Hutapea, 2000). Selain itu, juga menambah nafsu makan serta mengobati radang tenggorokan (Falaha, 2009). Hasil penelitian dari infus rimpang lempuyang pahit menunjukkan adanya efek analgesik (Pudjiastuti dkk., 2000).
6. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis merupakan bentuk kromatografi planar dengan fase diam berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik. Lempeng KLT terdapat reagen fluoresen untuk memfasilitasi deteksi bercak solut dan agen pengikat seperti kalsium sulfat. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak secara menaik (ascending) atau pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini
dapat mudah diatur sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal (Gandjar dan Rohman, 2007).
Gambar 4. Struktur Kimia Zerumbone (Keong et al., 2010)
Komponen minyak atsiri dalam rimpang lempuyang gajah dan lempuyang emprit bervariasi (Purwanti dkk., 2003). Salah satunya komponen utamanya adalah zerumbone. Zerumbone memiliki gugus α,β-unsaturated carbonyl (Gambar 4) (Keong et al., 2010). Fase gerak yang sesuai untuk semua jenis minyak atsiri adalah toluen:etil asetat (93:7) (Wagner, 1995).
7. Uji sitotoksik
Kerusakan sel yang disebabkan oleh xenobiotik pada umumnya mengakibatkan perubahan pada permeabilitas maupun integritas membran sel. Enzim sitolitik akan keluar ke dalam media. Adanya enzim yang mengalami lisis ini merupakan parameter utama dalam penentuan sitotoksisitas suatu xenobiotik secara in vitro. Metode ini dipengaruhi oleh faktor kestabilan enzim sehingga dikembangkan metode untuk mengestimasi aktivitas sel yang masih hidup. Aktivitas sel, morfologi sel, adhesi sel, proliferasi sel, kerusakan membran sel maupun efek metabolik sel dapat digunakan sebagai parameter sitotoksik (Doyle and Grifftis, 2000).
Uji sitotoksik bertujuan untuk mengetahui potensi aktivitas sitotoksik larutan uji terhadap sel kanker. Data yang diperoleh digunakan untuk penghitungan potensi aktivitas sitotoksik suatu senyawa, yaitu berupa nilai IC
50. Semakin kecil IC
50 suatu senyawa maka semakin toksik senyawa tersebut (Doyle and Grifftis, 2000 cit Kusharyanti dkk., 2008).
Salah satu metode untuk menilai sitotoksisitas suatu bahan adalah dengan uji enzimatik menggunakan pereaksi 3-(4,5-dimetilthiazol-2-il) 2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT). Dasar uji enzimatik MTT adalah dengan mengukur kemampuan sel hidup berdasarkan aktivitas mitokondria dari kultur sel (Meizarini, 2005). Enzime dehidrogenase dari mitokondria mengubah MTT berwarna kuning yang larut air menjadi produk formazan berwarna ungu yang tidak larut air (Doyle and Griffiths, 2000). Uji ini banyak digunakan untuk mengukur proliferasi seluler secara kuantitatif atau untuk mengukur jumlah sel yang hidup (Meizarini, 2005).
Gambar 5. Reaksi Reduksi MTT menjadi Formazan oleh Enzim Suksinat Dehidrogenase (Mosmann, 1983)
Ketika garam tetrazolium direduksi oleh sel, baik secara enzimatis atau melalui reaksi langsung dengan NADH atau NADPH, garam tetrazolium berubah
membentuk presipitat tak terpecahkan (formazan) (Gambar 5). Formazan merupakan produk hasil reduksi garam tetrazolium oleh dehidrogenase dan reduktase. Formazan ini memiliki berbagai warna dari ungu, merah padam sampai orange tergantung pada garam tetrazolium yang digunakan sebagai substrat pada reaksi (Anonimc, 2010).
E. Landasan Teori
Lempuyang gajah (Zingiber zerumbet L.) dan lempuyang emprit (Zingiber littorale Val. ) merupakan tanaman dari famili Zingiberaceae (Anonimb, 2009). Secara kemotaksonomi Zingiber littorale Val. memiliki hubungan kekerabatan dengan Zingiber zerumbet L. dan kemungkinan memiliki khasiat yang sama (Marsusi dkk., 2001). Rimpang dari tanaman anggota famili ini dilaporkan memiliki aktivitas antiinflamasi, antiulcer, antioksidan dan antimikroba (Faizah et al., 2002; Murakami et al., 2004 cit Adel et al., 2010).
Komponen utama minyak atsiri dari rimpang lempuyang gajah dan lempuyang emprit adalah zerumbone, humulene, camprene (Faizah et al., 2002) dan α-caryophyllene (Purwanti dkk., 2003). Zerumbone yang diisolasi dari rimpang lempuyang gajah memiliki aktivitas sitotoksik terhadap beberapa sel kanker diantaranya sel HeLa dengan IC50 sebesar 11,3 μM (Abdulb et al., 2008), sel Coav-3 dengan IC50 sebesar 24,30 ± 0,9 μM dan sel MCF-7 dengan IC50 27,7 ± 1,2 μM (Wahab et al., 2009). Selain itu, zerumbone mampu menghambat aktivasi virus Eipstein-Barr yang diinduksi 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate dengan IC50 sebesar 0,14 μM (Murakami et al., 1999). Zerumbone pada
konsentrasi tinggi menunjukkan aktivitas antiinflamasi, antiulkus, antioksidan dan antimikroba (Jaganath dan Ng, 2000; Somchit dan Shukriyah, 2003; Mascolo et al, 1989; Agrawal et al., 2000; Nakatani, 2000 cit Bhuiyan et al., 2009).
Minyak atsiri bersifat larut dalam etanol sehingga zerumbone kemungkinan dapat terekstraksi menggunakan etanol (Ketaren, 1985). Ekstrak etanol dari kedua rimpang tersebut memiliki aktivitas analgesik dan antipiretik yang mampu menghambat proses inflamasi yang disebabkan oleh induksi mediator prostaglandin (Somchit et al., 2005). Penghambatan prostaglandin juga menghambat aktivitas protein bcl-2 sehingga menstimulasi proses apoptosis (Murakami et al., 2002). Berdasarkan pernyataan tersebut, ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah dan rimpang lempuyang emprit yang kemungkinan mengandung zerumbone diharapkan dapat beraktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D.
F. Hipotesis
Berdasarkan landasan teori tersebut, ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah dan lempuyang emprit kemungkinan mengandung zerumbone dan memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D.
