• Tidak ada hasil yang ditemukan

DARI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) STRAIN B134 LUSIANA KRESNAWATI HARTONO

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Membagikan "DARI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) STRAIN B134 LUSIANA KRESNAWATI HARTONO"

Copied!
31
0
0

Teks penuh

(1)

PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE

DARI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) STRAIN B134

LUSIANA KRESNAWATI HARTONO

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2013

(2)

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Purifikasi Parsial dan Karakterisasi β-Galaktosidase Dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh Pusat Penelitian Biologi LIPI (Proyek PKPP 2012). Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2013

Lusiana Kresnawati Hartono

(3)

ABSTRAK

LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Purifikasi Parsial dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan TATIK KHUSNIATI.

Intoleransi laktosa merupakan salah satu kasus yang sering terjadi pada bayi, orang dewasa, maupun manula. Hal tersebut terjadi karena keterbatasan galaktosidase pada saluran pencernaan. Salah satu solusinya adalah konsumsi β-galaktosidase dari sumber lain. Isolat BAL strain B134 merupakan salah satu sumber yang menghasilkan β-galaktosidase. Produksi β-galaktosidase tertinggi tercapai saat inokulum 2% ditumbuhkan dalam media MRS yang mengandung 2% laktosa, pH media 5, dan waktu inkubasi 24 jam pada suhu 37ºC. Purifikasi parsial β-galaktosidase menghasilkan kemurnian 3.131 kali, rendemen 3.206%, dan aktivitas spesifik sebesar 45.828 U/mg. Aktivitas tertinggi β-galaktosidase tercapai pada pH 6 dan suhu 45ºC. Aktivitas β-galaktosidase stabil pada pH 4.5 dan suhu 30ºC. Kation Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ pada konsentrasi 0.1 M bersifat aktivator terhadap aktivitas β-galatosidase sedangkan Ca2+, Cu2+, dan Hg2+ pada konsentrasi 0.1 M menghambat aktivitas β-galaktosidase. Nilai Km dan Vmaks dari β-galaktosidase sebesar 3.934 mM dan 3.278 µmol/menit.

Kata kunci: Purifikasi parsial, β-galaktosidase, Bakteri Asam Laktat (BAL).

ABSTRACT

LUSIANA KRESNAWATI HARTONO. Partial Purification and Characterization β-Galaktosidase from Lactic Acid Bacteria (LAB) Strain B134 Isolate. Supervised by I MADE ARTIKA and TATIK KHUSNIATI.

Lactose intolerance is often occurs in baby, adult, and eldery. It could happen because of the absence of β-galactosidase in gastrointestinal tract. One of solution is β-galactosidase intake from other sources. LAB strain B134 Isolate is a source of β-galactosidase. The aim of the present study was to partial purification and characterization of β-galactosidase from LAB strain B134 isolate. Maximum production of β-galactosidase was obtained when 2% inoculums in MRS that contain 2% lactose, pH: 5, and incubation for 24 hours in 37ºC. Partial purification of β-galactosidase used dialysis. The purification factor, yield, and specific activity of β-galactosidase were found to be 3.313 times, 3.026%, and 45.828 U/mg respective. β-galaktosidase showed higest activity was at pH 6 and temperature 45ºC. Activity of β-galactosidase was stable at pH 4.5 and 30ºC. Cation Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ in 0.1 M increased β-galactosidase activity. Meanwhile, Ca2+, Cu2+, and Hg2+ in 0,1 M inhibited β-galactosidase activity. Km and Vmaks of β-galactosidase were 3.934 mM and 3.278 µmol/min.

(4)
(5)

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE

DARI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) STRAIN B134

LUSIANA KRESNAWATI HARTONO

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2013

(6)

Judul Skripsi : Purifikasi Parsial Dan Karakterisasi β-Galaktosidase Dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134

Nama : Lusiana Kresnawati Hartono NIM : G84090017

Disetujui oleh

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Pembimbing I

Dr Ir Tatik Khusniati, M.App.Sc Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Biokimia

(7)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian dengan judul Purifikasi Parsial dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Strain B134 dilakukan sejak Oktober 2012 hingga Januari 2013 di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc dan Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc. selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Neneng Karimayati, A.Md AL, Abdul Choliq, S.Pd, Febri, dan staf Laboratorium Biokimia Mikroba LIPI Biologi yang telah membantu selama penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada papa, mama, Bima, sahabat, dan teman-teman Biokimia 46 atas segala doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2013

(8)

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi DAFTAR GAMBAR vi DAFTAR LAMPIRAN vi PENDAHULUAN 1 METODE 2

Waktu dan Tempat Penelitian 2

Bahan 2

Alat 2

Prosedur Percobaan 2

HASIL DAN PEMBAHASAN 6

Hasil 6

Pembahasan 11

SIMPULAN DAN SARAN 13

Simpulan 13

Saran 14

DAFTAR PUSTAKA 14

LAMPIRAN 16

(9)

DAFTAR GAMBAR

1 Pengaruh Inokulum B134 terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari

isolat BAL strain B134 6

2 Pengaruh pH media terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat

BAL strain B134 7

3 Pengaruh konsentrasi laktosa terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari

isolat BAL strain B134 7

4 Kurva pertumbuhan isolat BAL strain B134 7

5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase 8 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase 9 7 Pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase 9 8 Pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase 10 9 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase 10

10 Kurva Michaelis-Menten 11

11 Kurva Line-Weaverburk 11

DAFTAR LAMPIRAN

1 Kurva standar ONP 16

2 Kurva standar protein 16

3 Penentuan inokulum dan keadaan media MRS optimum 17

4 Penentuan waktu produksi optimum 17

5 Optimasi suhu dan pH β-galaktosidase 17

6 Stabilitas suhu dan pH β-galaktosidase 18

7 Pengaruh logam terhadap aktivitas β-galaktosidase 19 8 Kinetika kimia β-galaktosidase purifikasi parsial 19

(10)
(11)

PENDAHULUAN

Kejadian intoleransi laktosa dijumpai pada bayi, orang dewasa, maupun manula. Intoleransi laktosa sering terjadi pada orang Asia, Afrika, Timur Tengah, beberapa negara Mediterania dan juga pada ras Aborigin Australia. Ras Kaukasia lebih sedikit mengalami kasus intoleransi laktosa, hanya sekitar 5% yang mengalaminya. Konsumsi laktosa penduduk dunia secara georafis yaitu Eropa Utara >90%, Eropa Selatan dan Asia Tengah 50%, Afrika 5-20%, dan Asia Tenggara 1% (Ranchiaro dan Tishkoff 2010). Penelitian pada anak usia 3-5 tahun di Jakarta menunjukkan 23% responden defisiensi β-galaktosidase (Hegar et al 1995). Penelitian lain pada anak usia 6-12 tahun 1998 di Jakarta menunjukkan sekitar 50% responden mengalami intoleransi laktosa. Kecenderungan intoleransi laktosa akan meningkat seiring pertambahan usia. Hal ini terjadi karena produksi β-galaktosidase menurun seiring pertambahan usia (Tehuteru 1999). Menurut Hegar et al. (1995), insiden terkait intoleransi laktosa di Indonesia mencapai 70%.

Intoleransi laktosa merupakan kondisi saat laktosa tidak dihidrolisis oleh enzim tetapi diproses oleh bakteri melalui tahap fermentasi. Fermentasi tersebut belangsung dalam usus yang menghasilkan gas yang menyebabkan rasa sakit. Laktosa yang tidak dapat dicerna melalui fermentasi akan menghambat penyerapan air dari feses yang menyebabkan diare (BPOM 2008). Enzim yang berperan penting dalam pencernaan laktosa dalam usus halus adalah β-galaktosidase.

β-galaktosidase merupakan enzim yang menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa dengan memutus ikatan β-galaktosida pada ujung nonreduksi β-D-galaktosa (Gary dan Kindell 2005). Hidrolisis laktosa secara enzimatik dengan β-galaktosidase memiliki nilai energi tinggi. Solusi bagi penderita intoleransi laktosa adalah mengkonsumsi suplemen β-galaktosidase. Menurut Fox dan McSweeney (1981), konsumsi suplemen β-galaktosidase efektif untuk mengurangi gangguan penyerapan laktosa. Namun, harga suplemen ini mahal.

Solusi lainnya adalah mencari sumber β-galaktosidase yang murah. Enzim ini terdapat pada hewan, tumbuhan, fungi, dan mikroorganisme. Pada bakteri dan khamir, β-galaktosidase bersifat intraseluler sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler (Mahoney 2004). Bakteri asam laktat (BAL) menghasilkan β-galaktosidase yang mampu menurunkan kadar laktosa dalam susu. Lactobacillus

bulgaricus merupakan salah satu contoh BAL. Lactobacillus bulgaricus mampu

mengurai 50-60% laktosa secara intraseluler (Wierzbicki dan Kosikowski 1973, Sumathy et al. 2012).

Kemampuan β-galaktosidase dalam mencerna laktosa akan meningkat apabila dilakukan pemurnian. Pemurnian enzim merupakan tahapan pemisahan enzim target dengan protein lain. Pemurnian enzim meliputi pengendapan oleh garam atau pelarut organik, dialisis, dan kromatografi. Aktivitas spesifik β-galaktosidase yang tinggi menggambarkan kemampuan enzim yang tinggi dalam menghidrolisis laktosa. β-galaktosidase dari Lactobacillus bulgaricus meningkat aktivitas spesifiknya menjadi 62.80 U/mg setelah dilakukan pemurnian. Kemurniannya meningkat 1.47 kali (Mozumder et al 2012). Sayangnya, pemurnian enzim membutuhkan biaya yang tidak sedikit dan menghasilkan

(12)

2

volume enzim yang sangat sedikit. Pemurnian parsial dapat dilakukan untuk mengatasi masalah tersebut. Tahapan pemurnian parsial akan menghilangkan satu atau beberapa langkah pemurnian enzim. Hal ini dapat dilakukan apabila aktivitas awal enzim tinggi.

Beberapa spesies lokal BAL yang diisolasi dari makanan tradisional asal Bogor, koleksi Puslit Biologi LIPI, memiliki aktivitas β-galaktosidase yang tinggi berdasarkan uji aktivitas awal. Salah satu strain yang memiliki aktivitas β-galaktosidase yang tinggi adalah B134. Penelitian tersebut mendasari karakterisasi β-galaktosidsase pada isolat bakteri asam laktat strain B134. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan permurnian parsial dan karakterisasi β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134.

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Oktober 2012 hingga Februari 2013 yang dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Mikroba Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) di Cibinong, Bogor.

Bahan

Bahan yang digunakan adalah biakan isolat BAL strain B134 yang merupakan koleksi biakan bakteri bidang Mikrobiologi LIPI, bahan media MRS modifikasi, akuades, buffer fosfat 0.05 M pH 6.5, buffer fosfat 0.1 M pH 6.5 dan pH 7, buffer fosfat 0.01 M pH 7, amonium sulfat, β-galaktosidase, o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal), Na2CO3 1M, o-nitrofenol (oNP), reagen Bradford,

NaCl 0.15 N, bovine serum albumin (BSA), reagen Bradford. Alat

Alat yang digunakan adalah mikropipet, laminar air flow cabinet, autoklaf Hirayama, neraca analitik, spektrofotometer UV-VIS 1700 Shimadzu, kuvet,

microwave, vorteks, cool room, penangas air Eyela, inkubator Isuzu, magnetic strirer, sentrifus, sonikator Eyela, tabung dialisis Cabinet, pH meter HM-25G

TOADKK, dan stopwatch.

Prosedur Percobaan Penyiapan media tumbuh isolat BAL strain B134

Bahan-bahan untuk membuat media MRS modifikasi dan 2 g CaCO3

dilarutkan dalam 200 mL akuades. Nilai pHnya diatur hingga 7.0. Selanjutnya, media dipanaskan dalam microwave sampai mendidih lalu ditambahkan 0.2 mL tween 80. Media agar MRS modifikasi di autoklaf pada 121ºC selama 15 menit. Setelah itu, media dituang ke cawan petri.

(13)

3 Peremajaan isolat BAL strain B134

Sebanyak 1 ose isolat BAL strain B134 dipindahkan ke cawan petri berisi MRS modifikasi dengan metode cawan gores. Kemudian, cawan petri diinkubasi dalam inkubator bersuhu 37ºC selama 24 jam. Kemudian, 1 ose bakteri diambil dan diremajakan kembali dalam agar miring selama 24 jam untuk dijadikan stok. Stok pada media agar miring ini menjadi biakan yang akan digunakan untuk total bakteri dan produksi awal β-galaktosidase.

Total Bakteri per mL Sel

Sebanyak 0.1 mL bakteri dimasukkan dalam tabung berisi 0.9 mL media MRS modifikasi cair (merupakan pengenceran 10-4). Pengenceran dilakukan secara berseri hingga 10-7. Masing-masing pengenceran diambil 100 µL dan disebar menggunakan batang kaca penyebar pada media agar MRS modifikasi dalam cawan petri. Setelah itu, cawan petri diinkubasi pada 37ºC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh pada masing-masing pengenceran dihitung.

Produksi Awal

Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari stok agar miring dipindahkan ke dalam 200 mL MRS modifikasi cair. Kemudian, media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Sel dipanen dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit. Pelet yang diperoleh dicuci sebanyak 2 kali dengan buffer PO4 0.05 M pH 6.5 (1 g/5 mL). Pelet hasil pencucian buffer yang kedua

ditambahkan buffer PO4 0.05 M pH 6.5 dan glass bead. Suspensi sel divorteks

selama 5 menit. Suspensi sel disentrifus kembali pada kecepatan 9.500 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase kasar. Volume enzim yang diperoleh diukur kemudian uji aktivitas dan uji kadar protein dilakukan untuk mengetahui aktivitas spesifik awal.

Optimasi Pertumbuhan

Penentuan Konsentrasi Inokulum. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi cair dengan pH 7. Variasi inokulum bakteri yang digunakan adalah 1%, 2%, dan 5%. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan inokulum optimum Isolat BAL strain B134.

Penentuan pH Media. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi cair dengan inokulum hasil optimasi. Variasi pH media yang digunakan adalah 5, 6, 7, dan 8. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan pH media optimum isolat BAL strain B134.

Penentuan pengaruh kadar laktosa. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi cair dengan inokulum dan media hasil optimasi. Variasi kadar laktosa yang digunakan adalah 1%, 2%, dan 3%. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan kadar laktosa optimum isolat BAL strain B134.

Penentuan waktu pertumbuhan. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi cair dengan inokulum bakteri, pH media, dan kadar laktosa hasil optimasi. Variasi waktu inkubasi yang digunakan adalah 0, 6, 12, 18,

(14)

4

24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, dan 72 jam. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan waktu inkubasi optimum isolat BAL strain B134.

Produksi β-Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997)

Inokulum isolat BAL strain B134 diambil sebanyak inokulum hasil optimasi dengan kerapatan optik 0.7 yang diinokulasikan dalam 2.400 mL media MRS modifikasi cair steril dan diinkubasi pada suhu 37ºC. Setelah inkubasi selama waktu pertumbuhan optimum, sel dipanen. Media berisi bakteri yang telah dipanen kemudian disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 9500 rpm pada suhu 4ºC. Pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan buffer fosfat 0.05 M pH 6.5 sebanyak dua kali. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan buffer fosfat 0.05 M pH 6.5. Kemudian, pemecahan sel dilakukan dengan sonikator pada 50 kHz selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar β-galaktosidase.

Pengendapan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1987)

Sebanyak 10 mL β-galaktosidase kasar diendapkan dalam amonium sulfat. Penambahan amonium sulfat dilakukan secara bertahap. Konsentrasi amonium sulfat yang digunakan yaitu 0-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, dan 60-70%. Larutan kemudian diaduk dengan magnetic stirrer secara perlahan selama 20 menit kemudian diinkubasi dalam cool room selama 1 jam. Setelah 1 jam, larutan disentrifus dengan kecepatan 9.500 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam 1 mL buffer PO4 0.05 M pH

6.5. Kejenuhan amonium sulfat yang optimum akan ditunjukkan oleh aktivitas spesifik yang tinggi.

Jumlah amonium sulfat (gram/liter) = ( ) Keterangan:

S1 : Konsentrasi awal amonium sulfat

S2 : Konsentrasi akhir amonium sulfat

NB: Nilai 533 menunjukkan bahwa dibutuhkan 533 gram amonium sulfat per liter untuk membuat larutan jenuh 100%.

Pemurnian dengan Dialisis

Tabung dialisis diisi 2 mL β-galaktosidase hasil pengendapan amonium sulfat. Tabung kemudian direndam dalam 2 liter buffer PO4 0.01 M pH 6.5 yang

diletakkan diatas stirer dan disimpan dalam cool room bersuhu 4ºC selama 15 jam. Uji Aktivitas β-Galaktosidase (modifikasi Liu et al. 2009)

Pengukuran Sampel. Uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL buffer PO4 0.1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke dalam

tabung reaksi lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 200 µl o-nitrofenil-β-D-galaktosida (oNPGal) 2 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Pada menit ke-5 ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis dengan mengukur

absorban pada λ=420 nm.

Pengukuran Kurva Standar. Berbagai konsentrasi oNP dari 0-2.5 mM yang dilarutkan dalam buffer PO4 0.01 M pH 7. Sebanyak 1 mL buffer PO4 0.1 M

(15)

5 pH 7 dan 100 µl akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 200 µl oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Selanjutnya campuran ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M. Larutan di vortex

dan intensitas warna kuning yang terbentuk diukur absorbansinya pada λ=420 nm. Hasil pembacaan aktivitas β-galaktosidase dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol oNP dari substrat oNPGal per menit pada kondisi percobaan.

Karakterisasi β-Galaktosidase

Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase. Optimasi pH dilakukan dengan menggunakan buffer asetat, fosfat dan tris-HCl pada variasi pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, dan 8.0. Pengujian aktivitas dilakukan pada suhu 37ºC selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas galaktosidase menunjukkan pH optimum galaktosidase. Stabilitas β-galaktosidase terhadap pH diuji dengan menginkubasikan β-β-galaktosidase pada larutan buffer pada berbagai pH (5-8 dengan selang 0.5) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, larutan β-galaktosidase dengan cepat didinginkan dalam penangas es. Aktivitas β-galaktosidase yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase pada pH optimum. Nilai aktivitas β-galaktosidase tersisa dinyatakan dalam persentase dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (β-galaktosidase tanpa perlakuan).

Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase. Uji aktivitas β-galaktosidase dengan variasi suhu 25, 30, 35, 40, 45, 50, dan 55 ºC dilakukan untuk penentuan suhu optimum. Pengujian aktivitas dilakukan berdasarkan pH optimum selama 5 menit. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-galaktosidase menunjukkan suhu optimum β-galaktosidase. Stabilitas β-galaktosidase terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan β-galaktosidase pada berbagai suhu (25-55oC dengan selang 5oC) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, β-galaktosidase dengan cepat didinginkan dalam penangas es. Aktivitas β-galaktosidase yang tersisa diuji dengan reaksi enzimatis β-galaktosidase pada pH dan suhu optimum. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dari aktivitas setelah perlakuan dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan).

Pengaruh kation terhadap aktivitas β-galaktosidase. Logam yang digunakan untuk pengujian pengaruh kation adalah Hg+, Cu2+, Ca2+, Co2+, Mg2+, Mn2+, dan Zn2+ dengan konsentrasi 0.1 M. Sebanyak 100 µL kation dengan konsentrasi 0.1 M ditambahkan dalam campuran substrat-buffer-enzim, dan diinkubasikan pada kondisi optimal reaksi enzimatis β-galaktosidase. Penghambatan atau peningkatan aktivitas β-galaktosidase oleh kation dinyatakan dalam persentase aktivitas β-galaktosidase dibandingkan dengan kontrolnya (tanpa penambahan kation logam).

Penentuan Kinetika Enzim. Analisis KM dan Vmaks dilakukan pada enzim

kasar dan enzim hasil dialisis. Sebanyak 1000 µl buffer fosfat 0.1 pada pH optimum, 100 µl enzim, dan 200 µl substrat oNPGal yang diujikan pada konsentrasi 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, dan 5 mg/ml diinkubasi selama 5-30 menit. Setiap 5 menit, sebanyak 1000 µl Na2CO3 1 M ditambahkan agar reaksi berhenti

kemudian larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV Vis pada λ=420 nm. Grafik dibuat dengan memplotkan hubungan antara waktu (sumbu X) dan

(16)

6

kadar oNP yang terbentuk (sumbu Y) dari berbagai konsentrasi substrat awal dimana nilai kecepatan reaksi (v) merupakan nilai kemiringan grafik tersebut. Selanjutnya grafik Lineweaver-Burk dibuat untuk menentukan nilai KM dan Vmaks.

Grafik Lineweaver-Burk diperoleh dari hubungan antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v) diukur sebagai kecepatan pembentukan produk persatuan waktu.

Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)

Pengukuran Kurva Standar. Standar protein yang digunakan adalah

bovine serum albumin (BSA) pada berbagai konsentrasi dari 0.005-1.00 mg/mL

menggunakan pelarut NaCl 0.15 M. Sebanyak 20 µl BSA ditambahkan dalam 1 mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.

Pengukuran Sampel. Sebanyak 20 µl β-galaktosidase ditambahkan dalam 1 mL larutan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.

Pembuatan Blanko. Sebanyak 40 µl NaCl 0.15 M ditambahkan dalam 1 mL lautan Bradford. Larutan divorteks dan diinkubasi selama 5 menit. Absorban larutan kemudian diukur pada λ=595 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Keadaan Optimum Pertumbuhan Isolat BAL strain B134

Inokulum isolat BAL strain B134 yang ditumbuhkan dalam MRS modifikasi paling optimum adalah 2% dengan aktivitas spesifik β-galaktosidase sebesar 8.265 U/mg (Gambar 1). Keadaan pH MRS modifikasi juga mempengaruhi aktivitas spesifik dari β-galaktosidase. Nilai pH 5 memiliki aktivitas spesifik sebesar 75.074 U/mg (Gambar 2). Konsentrasi laktosa 2% dalam MRS modifikasi menghasilkan aktivitas spesifik β-galaktosidase tertinggi sebesar 20.468 U/mg (Gambar 3).

Gambar 1 Pengaruh Inokulum B134 terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134

0.540 ± 0.014 1.976 ± 0.044 1.556 ± 0.041 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 1% 2% 5% Ak tiv ita s sp e sifi k β -galak to sid as e ( U/ m g) [Inokulum B134] (%)

(17)

7

Waktu Inkubasi Optimum Produksi β-Galaktosidase

Aktivitas β-galaktosidase mengalami peningkatan hingga jam ke 24. Aktivitas tertinggi sebesar 17.333 U/mL diperoleh pada jam ke 24 dengan OD sebesar 1.989 yang setara dengan 7.615 10-8 sel.

Gambar 4 Kurva pertumbuhan isolat BAL strain B134

Keterangan : Jumlah sel : Aktivitas β-galaktosidase (U)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 0 6 12 18 24 30 36 42 Ju m lah Sel (10 4) Jam ke- A kt iv itas β-g a la k to sida se (U)

Gambar 3 Pengaruh laktosa terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134

2.687 ± 0.212 20.631 ± 2.785 2.533 ± 0.993 0 5 10 15 20 25 1% 2% 3% A kt iv itas sp e si fi k β -g al akt o si d ase (U/m g) [Laktosa]

Gambar 2 Pengaruh pH media terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134

70.644 ± 3.036 43.040 ± 9.555 58.466 ± 11.914 29.636 ± 8.278 0 10 20 30 40 50 60 70 80 5 6 7 8 A kt iv itas sp e si fi k β -gal akt o si d ase (U/m g) pH media

(18)

8

Purifikasi Parsial β-Galaktosidase dari Isolat BAL Strain B134

Enzim kasar memiliki aktivitas spesifik sebesar 14.638 U/mg dengan rendemen sebesar 100%. Pengendapan amonium sulfat dioptimasi secara bertingkat sehingga diperoleh fraksi dengan aktivitas tertinggi adalah fraksi 40-50% dengan aktivitas spesifik sebesar 18.656 U/mg. β-galaktosidase hasil pengendapan amonium sulfat 50% jenuh memiliki aktivitas spesifik sebesar 28.170 U/mg dengan rendemen sebesar 19.576%. Kemurnian β-galaktosidase setelah pengendapan dengan amonium sulfat 50% jenuh sebesar 1.924 kali. β-galaktosidase setelah perlakuan dialisis memiliki aktivitas spesifik sebesar 45.828 U/mg dengan rendemen sebesar 3.206%. Kemurnian setelah dialisis adalah 3.131 kali.

Tabel 1 Aktivitas β-galaktosidase pada tahapan purifikasi parsial

Tahapan Volume enzim (mL) Total aktivitas (U) Total protein (mg) Aktivitas spesifik (U/mg) Rendemen (%) Kemurnian (kali) Enzim Kasar1 40 1530.543 104.562 14.638 100 1.000 Pengendapan amonium sulfat 50% jenuh 3.26 299.617 10.636 28.170 19.576 1.924 Dialisis 1.32 49.075 1.071 45.828 3.206 3.131

1 Berasal dari 8 gram bobot basah pelet Isolat BAL strain B134

Karakterisasi β-Galaktosidase Pengaruh Suhu

Gambar 5 menunjukkan bahwa aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu 25ºC hingga 45ºC, aktivitas β-galaktosidase mengalami peningkatan tetapi aktivitas menurun pada suhu 50-55ºC.

Pengaruh pH

Aktivitas β-galaktosidase meningkat pada pH 4.5 hingga 6 lalu mengalami penurunan pada pH 6.5 hingga 8.5 (Gambar 6). Aktivitas tertingginya berada pada pH 6 dengan nilai aktivitas sebesar 19.814 U/mL.

Gambar 5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase

9.465 ± 0.27 15.899 ± 0.38 16.907 ± 0.27 21.403 ± 0.27 25.667 ± 0.27 23.729 ± 1.04 20.977 ± 0.11 0 5 10 15 20 25 30 25 30 35 40 45 50 55 A kt iv itas β -g al akt o si d ase (U/m L) Suhu (ºC)

(19)

9

Stabilitas β-Galaktosidase

Kestabilan β-galaktosidase terhadap suhu ditunjukkan pada Gambar 7. Setelah inkubasi 1 jam, aktivitas β-galaktosidase tersisa pada suhu 30ºC sebesar 49.70%. Kestabilan β-galaktosidase terhadap pH ditunjukkan pada gambar 8. Aktivitas β-galaktosidase yang tersisa setelah 1 jam inkubasi berkisar antara 50.98%. Kestabilan aktivitasnya berada pada pH 4.5.

Gambar 7 Pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase

12.87 ± 3.84 47.90 ± 0.43 44.88 ± 4.70 37.03 ± 2.14 26.46 ± 0.00 8.94 ± 0.00 -0.72 ± 0.00 -10 0 10 20 30 40 50 60 25 30 35 40 45 50 55 A kt iv itas β -g al akt o si d ase te rsi sa (% ) Suhu (˚C)

Gambar 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase

0.400 ± 0.004 6.093 ± 0.11 18.961 ± 0.55 19.814 ± 0.66 18.496 ± 0.55 17.853 ± 0.27 12.140 ± 0.10 5.550 ± 1.32 1.829 ± 0.12 0 5 10 15 20 25 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 A kt iv itas β -g al akt o si d ase (U/m L) pH

(20)

10

Pengaruh Logam

Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase ditunjukkan pada Gambar 9. Penambahan kation Co2+, Zn2+, Mn2+, dan Mg2+ meningkatkan aktivitas β-galaktosidase sedangkan kation Ca2+,Cu2+, dan Hg2+ menghambat aktivitas β-galaktosidase.

Parameter Kinetik

Kurva Michaelis-Menten menunjukkan hubungan antara konsentrasi oNPGal dengan kecepatan β-galaktosidase hasil purifikasi parsial (Gambar 8). Nilai Km dan Vmaks ditentukan dari kurva Line-Weaverburk (Gambar 9). Persamaan Line-Weaverburk yang diperoleh adalah y=1.200x+0.305 dengan nilai r2 sebesar 0.963. Dari persamaan tersebut, nilai Km diketahui sebesar 3.934 mM dengan Vmaks sebesar 3.278 µmol/menit.

Gambar 9 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas β-galaktosidase

100.00 ± 0.00 85.44 ± 0.42 118.40 ± 0.35 120.19 ± 1.79 3.09 ± 0.12 156.30 ± 1.27 1.65 ± 0.06 114.14 ± 2.89 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Kontrol Ca2+ Co2+ Zn2+ Cu2+ Mn2+ Hg2+ Mg2+

A kt iv itas β -g al akt o si d ase re latif (% ) Kation

Gambar 8 Pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase

50.98 ± 0.28 32.71 ± 2.21 36.23 ± 2.77 37.79 ± 2.77 35.05 ± 3.32 39.75 ± 1.11 42.49 ± 0.55 42.88 ± 1.11 33.49 ± 5.53 0 10 20 30 40 50 60 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 A kt iv itas β -g al akt o si d ase te rsi sa (% ) pH

(21)

11

Gambar 8 Kurva Michaelis Menten

Gambar 9 Kurva Lineweaver-burk Pembahasan

Keadaan Optimum Pertumbuhan Isolat BAL Strain B134

Konsentrasi inokulum mempengaruhi aktivitas spesifik β-galaktosidase. Semakin tinggi konsentrasi inokulum yang digunakan akan melipatgandakan jumlah bakteri sehingga meningkatkan hidrolisis laktosa. Namun, konsentrasi inokulum yang terlalu tinggi akan menyebabkan bakteri berkompetisi untuk memperoleh nutrisi yang terkandung dalam media. Akibatnya aktivitas β-galaktosidase mengalami penurunan.

Nilai pH media dan konsentrasi laktosa juga berpengaruh terhadap aktivitas β-galaktosidase (Hsu et al 2007). Bakteri Asam Laktat (BAL) strain B134 ditumbuhkan dalam media MRS modifikasi (de Man Rogrosa Sharpe) (de Man et al 1960). Glukosa pada MRS digantikan oleh laktosa. Laktosa merupakan sumber karbon terbaik untuk menginduksi produksi β-galaktosidase. Rendahnya laktosa dalam media kultur menurunkan aktivitas β-galaktosidase (Hsu et al 2005). 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 5 10 V ( µ m o l/ m e n it) [Substrat] (mM) y = 1.2007x + 0.3058 R² = 0.9637 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 1/V 1/S

(22)

12

Waktu inkubasi B134 terbaik ditentukan berdasarkan aktivitas tertinggi β-galaktosidase. Saat fase eksponensial, sel akan melakukan penggandaan minimal dua kali lipat dari jumlah sel sebelumnya. Kebutuhan nutrisi meningkat selama fase ini. Laju hidrolisis laktosa pun mengalami peningkatan. Pada akhir fase eksponensial, pertumbuhan bakteri mulai melambat akibat ketersediaan nutrisi yang menurun (Yuwono 2006). Gambar 4 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase tertinggi tercapai saat fase eksponensial.

Produksi dan Purifikasi Parsial β-Galaktosidase

Isolat BAL strain B134 ditumbuhkan dalam MRS modifikasi yang telah dioptimasi. B134 diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Pemanenan sel dilakukan menggunakan sentrifus pada kecepatan 9500 rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase. β-galaktosidase selanjutnya dimurnikan dengan amonium sulfat. Pemisahan protein saat pengendapan dengan amonium sulfat berdasarkan sifat ioniknya selain itu enzim juga akan mengalami pemekatan (Yuanita et al. 2010).

Tahap akhir dari purifikasi parsial adalah dialisis. Tabung dialisis memiliki membran semipermeabel yang memungkinkan senyawa berukuran lebih kecil dari 10 kDA (kilo Dalton) dapat keluar dari membran, sedangkan β-galaktosidase yang berukuran 432 kDA akan tertahan dalam tabung. Senyawa yang keluar dari tabung dialisis seperti ion logam, inhibitor, peptida kecil.

Enzim β-galaktosidase yang diperoleh dari berbagai tahapan purifikasi parsial diuji aktivitasnya dan diukur pada λ= 420 nm. Prinsip pengujiannya adalah reaksi antara β-galaktosidase dengan substrat oNPG (o-nitofenil-β-D-galaktosida) akan memutus ikatan 1,4-β-D galaktosa yang akan menghasilkan produk oNP (o-nitrofenil) yang berwarna kuning dan galaktosa. Reaksi dihentikan menggunakan Na2CO3 setelah inkubasi 5 menit pada suhu 37ºC. Produk oNP yang terbentuk

diukur dengan spektrofotometer λ=420 nm. Aktivitas spesifik merupakan unit enzim yang terkandung dalam miligram protein. Aktivitas spesifik β-galaktosidase B134 sebesar 45.828 U/mg setelah pemurnian dialisis. Sebagai perbandingan, aktivitas spesifik β-galaktosidase dari Lactobacillus lactis pada pemurnian yang sama sebesar 55.62 U/mg (Mozumder et al. 2012).

Karakterisasi β-Galaktosidase

Kerja β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu dan pH. Gambar 3 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu. Aktivitas β-galaktosidase mengalami peningkatan seiring naiknya suhu karena energi kinetik yang dihasilkan enzim semakin meningkat. Gerak vibrasi, translasi, serta rotasi enzim semakin cepat. Peningkatan gerak enzim meningkatkan terjadinya tumbukan antara enzim dengan substrat. Sebaliknya, suhu tinggi menyebabkan enzim mengalami perubahan konformasi sisi aktif sehingga aktivitasnya mengalami penurunan (Hames dan Hooper 2000).

Perubahan konformasi tersebut menyebabkan rusaknya interaksi non kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik, dan interaksi elektrostatik) yang menjaga strutur 3D enzim. Akibatnya enzim mengalami denaturasi yang merubah struktur lipatan enzim. Stuktur enzim akan terbuka dibagian permukaan sehingga sisi aktifnya berubah dan aktivitas enzim mengalami penurunan (Hames dan Hooper 2000).

(23)

13 Aktivitas galaktosidase dipengaruhi oleh pH. Peningkatan aktivitas β-galaktosidase sebelum mencapai aktivitas optimum disebabkan adanya interaksi antara H+ dari lingkungan dengan residu asam amino yang terletak pada sisi aktif enzim. Interaksi tersebut menyebabkan peningkatan keadaan ionisasi sisi aktif enzim. Hal ini menyebabkan sifat katalitik enzim untuk mengikat substrat meningkat. Ketika mencapai pH optimum, keadaan ionisasi berada pada keadaan yang tepat sehingga aktivitas enzim mencapai nilai tertinggi. Aktivitas enzim pada pH yang basa mengalami penurunan karena interaksi antara OH- dari lingkungan dengan residu asam amino akan menurunkan sifat katalitik enzim dan menyebabkan enzim terdenaturasi (Nelson dan Cox 2008).

Kestabilan enzim dipengaruhi oleh suhu dan pH. Gambar 7 dan 8 menunjukkan kestabilan β-galaktosidase pada suhu 30ºC dan pH 4.5. Faktor yang mempengaruhi kestabilan enzim seperti ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, interaksi ion, dan jembatan sulfida. Stabilnya enzim terhadap panas karena terbentuknya konformasi terntentu yang tahan terhadap denaturasi. Konformasi tersebut terbentuk karena pelipatan asam amino (Yuningtyas 2011).

Enzim membutuhkan koenzim dan aktivator untuk meningkatkan sifat katalitiknya. Ion logam merupakan aktivator yang dibutuhkan enzim untuk mengaktivasi kompleks substrat-enzim (Bintang 2010). Ion logam akan mengikat substrat pada sisi pemotongan. Ion logam juga dapat menstabilkan konformasi aktif enzim (Baehaki et al. 2008).

Peningkatan aktivitas enzim terjadi karena ion logam menjadi bagian integral dari sisi aktif enzim, merubah konstanta keseimbangan reaksi enzimatis, merubah muatan listrik, menghambat ion inhibitor, dan menukar ion yang kurang efektif pada sisi aktif enzim atau substrat (Richardson dan Hyslop 1985). Natarajan et al (2012) menunjukkan bahwa Mg2+ dan Mn2+ meningkatkan aktivitas β-galaktosidase dari Bacillus sp. Penurunan aktivitas enzim terjadi karena ion logam bertindak sebagai inhibitor. Kekuatan ion logam akan mempengaruhi konformasi dari enzim. Ion Cu2+ dan Hg2+ bertindak sebagai inhibitor irreversibel yang membentuk ikatan kovalen dengan gugus prostetik di sisi aktif enzim (Bintang 2010).

Faktor lain yang mempengaruhi kerja enzim adalah konsentrasi substrat. Peningkatan konsentrasi substrat akan meningkatkan kerja enzim hingga mencapai titik steady state yaitu saat kecepatan enzim tetap meskipun konsentrasi substrat bertambah (Nelson dan Cox 2008). Nilai Km dari β-galaktosidase sebesar 3.934 mM dengan Vmaks sebesar 3.278 µmol/menit. Sebagai perbandingan, nilai Km dan Vmaks β-galaktosidase dari Lactobacillus plantarum NCIMB sebesar 3.934 mM dan 3.278 µmol/menit (Kara 2004).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Pertumbuhan terbaik isolat BAL strain B134 tercapai pada inokulum 2% yang ditumbuhkan pada media MRS yang mengandung 2% laktosa, pH media 5, dan waktu inkubasi 24 jam pada suhu 37ºC. β-galaktosidase dari Isolat BAL strain B134 berhasil dimurnikan secara parsial. Aktivitas spesifik β-galaktosidase setelah purifikasi parsial sebesar 45.828 U/mg dengan kemurnian sebesar 3.131

(24)

14

kali. Aktivitas galaktosidase optimum pada suhu 45ºC dan pH 6. Aktivitas β-galaktosidase stabil pada pH 5.5 dan suhu 30ºC. Pengaruh kation Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+ pada konsentrasi 0.1 M terhadap aktivitas β-galatosidase bersifat aktivator sedangkan Ca2+, Cu2+, dan Hg2+ pada konsentrasi 0.1M menghambat aktivitas β-galaktosidase. Nilai Km dan Vmaks dari β-galaktosidase sebesar 3.934 mM dan 3.278 µmol/menit.

Saran

Penelitian lebih lanjut mengenai β-galaktosidase dapat dilakukan pemurnian galaktosidase menggunakan kromatografi filtrasi gel, amobilisasi β-galaktosidase, dan potensi β-galaktosidase dapat diaplikasikan untuk menghasilkan produk susu rendah laktosa.

DAFTAR PUSTAKA

[BPOM] Badan Pengawasan Obat dan Makanan. 2008. Kenali Intoleransi Lebih Lanjut. InfoPOM Vol 9 No.1:1-3.

Baehaki Ace, Maggy T. Suhartono, Nurheni Sri Palupi, dan Tati Nurhayati. 2008. Purifikasi dan Karakterisasi Protease dari Bakteri Patogen Pseudomonas

aeruginosa. Jurnal. Teknol Dan Industri Pangan 19(1):80-87.

Bintang, Maria. 2010. Biokimia: Teknik penelitian. Jakarta: EGC.

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding .

Anal Biochem 72:248-254.

Chooklin Supasit, Lupong Kaewsichan, Jasade Kaewsrichan. 2011. Potential use of Lactobacillus casei TISTR 1500 for the bioconversion from palmyra sap and oil palm sap to lactic acid. Electronical Journal of Biotechnology 14 (5).

De Man, J. C, Rogosa M, Sharpe Elisabeth. 1960. A Medium for the Cultivation of Lactobacilli. J.Appl.Bact. 23:130-135.

Fox PF, McSweeney PLH. 1981. Dairy Chemistry and Biochemistry. London: Blackie Academic and Professional.

Gary RK, Kindell SM. 2005. Quantitative assay of senescence-associated beta-galactosidase activity in mammalian cell extracts. Anal Biochem. 343 (3):329-34.

Hames B.D. dan Hoper N.M. 2000. Biochemistry: The instant notes. 2nd Ed. Hongkong: SpringerVerlag.

Hsu CA, Yu RC, Lee SL, Chou CC. 2005. Production of β-galactosidase by Bifidobacteria as influenced by various culture conditions. International

Journal of Food Microbiology 104:197-206.

Hegar B, Buller H.A. 1995. Breath hydrogen test in lactose malabsorption.

Pediatric Indonesia 35: 161-171.

Hsu CA, Yu RC, Lee SL, Chou CC. 2007. Cultural condition affecting the growth and production of β-galactosidaseby Bifidobacterium longum CCRC 15708 in a jar fermenter. Intenational Journal of Food Microbiolgy 116:186-189.

Kara Firat. 2004. Release and characterization of beta-galactosidase from

(25)

15 Liu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating

β-galaktosidase from Enterobacter cloaceae B5. Process Biochemistry 44:232-236.

Mahoney R.R. 2004. Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. Food Chem 63:147-154.

Mozumder N H M R, Akhtaruzzaman M, Bakr M A, Zohra Fatema Tuj. 2012. Study on isolation and partial purification of lactase (β-Galactosidase) enzyme from Lactobacillus bacteria isolated from yogurt. J. Sci. Res. 4(1):239-249. Natarajan Jayashree et al. 2012. Isolation and Characterization of β-Galactosidase

Producing Bacillus sp. from Diary Effluent. World Appl. Sci. J. 17(11):1466-1474.

Nelson, David L dan Cox Michael M. 2008. Lehninger: Principles of

Biochemistry. New York: W.H Freeman and Company.

Ranciaro Alessia, Tishkoff Sarah A. 2010. Population Genetic: Evolutionary history of lactose tolerance in Africa. NIH Consensus Development

Conference: 2010 Feb 22-24; Maryland. Maryland (US).

Richardson T dan DB Hyslop. 1985. Enzim dalam O.R. New York: Bekker Inc. Rusynyk AR, Still CD. 2001. Lactose intolerance. JAOA 101:10-12.

Scopes RK. 1993. Protein Purification. New York: RR Doneley and Sons.

Sumathy R, Vijayalakshmi M, Deecaraman M. 2012. A study on β-galaktosidase of Lactobacillus sp. from milk product and its applications. International

Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 3:138-148.

Tehuteru Edi Setiawan. 1999. Malabsorpsi laktosa pada anak. J. Kedokter Trisakti 18(3):139-144.

Tossaveinen O. 2003. Losing the lactose. Dairy Industries International 68:23-26. Wang D, Sakakibara M. 1997. Lactose hydrolysis and β-galactosidase activity in sonicated fermentation with Lactobacillus strain. Ultrasonics Sonochem 4:255-261.

Wierzbicki LE, Kosikowski FV. 1973. Lactase potential of various microorganism grown in whey. J Dairy Sci 56:26-29.

Yuanita Leny, Aline Puspita, Suzana Surodjo, Sri Handayati , Farid Al Amin, Arif Budiman. 2005. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Fitase Bacillus subtilis dari Holiwood Gresik. Berk Penel Hayati 12:113-119.

Yuningtyas, Sitaresmi. 2011. Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloaceae serta Potensinya terhadap Susu UHT [tesis]. Indonesia (ID): Institut Pertanian Bogor.

(26)

16

LAMPIRAN

Lampiran 1 Kurva Standar oNP

µmol oNP A 0.000 0.000 0.115 0.013 0.230 0.018 0.460 0.058 0.690 0.087 0.920 0.101 1.150 0.154 2.300 0.306 2.875 0.436 4.600 0.583 5.750 0.721

Lampiran 2 Kurva standar protein

[BSA] (mg/mL) Absorban 0.000 0.000 0.005 0.002 0.010 0.012 0.050 0.055 0.100 0.123 0.200 0.189 0.400 0.399 0.800 0.763 1.000 0.891 y = 0.1290x + 0.0012 R² = 0.9915 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 2 4 6 8 Abs o rba n µmol ONP y = 0.9097x + 0.0112 R² = 0.9969 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.5 1 1.5 Abs o rba n [BSA] (mg/mL)

(27)

17 Lampiran 3 Penentuan inokulum dan keadaan media MRS optimum

Penentuan Konsentrasi Inokulum Isolat BAL strain B134

Inokulum Aktivitas (U) Total protein (mg)

Aktivitas spesifik (U/mg) Aktivitas spesifik rerata ± SD 1 2 1 2 1 2 1% 1.609 1.552 3.038 2.824 0.530 0.550 0.540 ± 0.014 2% 1.243 1.273 0.639 0.635 1.945 2.006 1.976 ± 0.044 5% 1.142 1.142 0.720 0.747 1.585 1.528 1.556 ± 0.041 Penentuan pH Media MRS

pH Aktivitas (U) Total protein (mg)

Aktivitas spesifik (U/mg) Aktivitas spesifik rerata ± SD 1 2 1 2 1 2 5 2.241 2.227 0.031 0.033 72.791 68.497 70.644 ± 3.036 6 1.009 1.009 0.028 0.020 36.283 49.797 43.040 ± 9.555 7 1.373 1.336 0.027 0.020 50.042 66.891 58.466 ± 11.914 8 1.280 1.261 0.054 0.036 23.783 35.489 29.636 ± 8.278

Penentuan Konsentrasi Laktosa dalam Media MRS

[Laktosa] Aktivitas (U) Total protein (mg)

Aktivitas spesifik (U/mg) Aktivitas spesifik rerata ± SD 1 2 1 2 1 2 1% 1.609 1.552 3.038 2.824 0.530 0.550 0.540 ± 0.014 2% 1.243 1.273 0.639 0.635 1.945 2.006 1.976 ± 0.044 3% 1.142 1.142 0.720 0.747 1.585 1.528 1.556 ± 0.041

Lampiran 4 Penentuan waktu produksi optimum

Jam ke- OD Jumlah Sel (sel/mL) [ONP]

µmol Aktivitas (U/mL) Aktivitas (U) 0 0.016 6.1257 10-10 0.000 0.000 0.000 6 0.327 1.2519 10-8 0.452 0.904 0.832 12 1.900 7.2743 10-8 2.960 5.919 6.630 18 1.974 7.5576 10-8 4.902 9.803 9.999 24 1.989 7.615 10-8 8.667 17.333 16.467 30 2.016 7.7184 10-8 7.271 14.543 12.652 36 1.984 7.5959 10-8 5.262 10.524 9.472 42 1.950 7.4657 10-8 4.510 9.020 8.930

Lampiran 5 Optimasi suhu dan pH β-galaktosidase Optimasi suhu β-galaktosidase

Suhu [oNP] (µmol) Aktivitas (U/mL) Aktivitas rerata ±

SD 1 2 1 2 25.0 4.636 4.829 9.271 9.659 9.465 ± 0.27 30.0 7.814 8.085 15.628 16.171 15.899 ± 0.38 35.0 8.357 8.550 16.713 17.101 16.907 ± 0.27 40.0 10.605 10.798 21.209 21.597 21.403 ± 0.27 45.0 12.930 Suhu 25.860 25.473 25.667 ± 0.27 50.0 12.233 24.465 22.992 23.729 ± 1.04 55.0 10.527 10.450 21.054 20.899 20.977 ± 0.11

(28)

18

Optimasi pH β-galaktosidase

pH [oNP] (µmol) Aktivitas (U/mL) Aktivitas rerata ±

SD 1 2 1 2 4.5 4.636 4.829 9.271 9.659 9.465 ± 0.27 5.0 7.814 8.085 15.628 16.171 15.899 ± 0.38 5.5 8.357 8.550 16.713 17.101 16.907 ± 0.27 6.0 10.605 10.798 21.209 21.597 21.403 ± 0.27 6.5 12.930 12.736 25.860 25.473 25.667 ± 0.27 7.0 12.233 11.496 24.465 22.992 23.729 ± 1.04 7.5 10.527 10.450 21.054 20.899 20.977 ± 0.11 8.0 4.636 4.829 9.271 9.659 9.465 ± 0.27 8.5 7.814 8.085 15.628 16.171 15.899 ± 0.38

Lampiran 6 Stabilitas suhu dan pH β-galaktosidase Stabilitas suhu β-galaktosidase

Suhu Aktivitas (U/mL) Aktivitas tersisa (U/mL) Aktivitas tersisa ±

SD 1 2 1 2 25.0 2.605 4.000 10.15 15.58 12.87 ± 3.84 30.0 12.372 12.217 48.20 47.60 47.90 ± 0.43 35.0 12.372 10.667 48.20 41.56 44.88 ± 4.70 40.0 9.116 9.891 35.52 38.54 37.03 ± 2.14 45.0 6.791 6.791 26.46 26.46 26.46 ± 0.00 50.0 2.295 2.295 8.94 8.94 8.94 ± 0.00 55.0 -0.186 -0.186 -0.72 -0.72 -0.72 ± 0.00

Aktivitas kontrol : 25.667 U/mL

Stabilitas pH β-galaktosidase

pH Aktivitas (U/mL) Aktivitas tersisa (%) Aktivitas tersisa

rerata ± SD 1 2 1 2 4.5 10.140 10.062 51.17 50.78 50.98 ± 0.28 5.0 6.171 6.791 31.14 34.27 32.71 ± 2.21 5.5 6.791 7.566 34.27 38.18 36.23 ± 2.77 6.0 7.101 7.876 35.84 39.75 37.79 ± 2.77 6.5 6.481 7.411 32.71 37.40 35.05 ± 3.32 7.0 7.721 8.031 38.97 40.53 39.75 ± 1.11 7.5 8.496 8.341 42.88 42.10 42.49 ± 0.55 8.0 8.651 8.341 43.66 42.10 42.88 ±1.11 8.5 5.860 7.411 29.58 37.40 33.49 ± 5.53

Aktivitas kontrol : 25.667 U/mL

Lampiran 7 Pengaruh Logam terhadap aktivitas enzim kasar

Kation Aktivitas β-galaktosidase (U/mL) Aktivitas β-galaktosidase tersisa (%) Aktivitas β-galaktosidase tersisa rerata ± SD 1 2 1 2 Kontrol 28.341 28.186 100.000 100.000 100.00 ± 0.00 Ca2+ 24.465 24.000 85.738 85.149 85.44 ± 0.42 Co2+ 33.767 33.302 118.651 118.152 118.40 ± 0.35 Zn2+ 32.992 34.233 118.925 121.452 120.19 ± 1.79 Cu2+ 0.803 0.896 3.006 3.179 3.09 ± 0.12 Mn2+ 43.535 44.310 155.403 157.206 156.30 ± 1.27 Hg2+ 0.431 0.478 1.607 1.694 1.65 ± 0.06 Mg2+ 34.078 31.597 116.182 112.101 114.14 ± 2.89

(29)

19 Lampiran 8 Kinetika Kimia Enzim Purifikasi parsial

Dari persamaan y=1.200x+0.305 diperoleh nilai 1/Vmaks = 0.305 dan nilai Km/Vmaks = 1.200. Maka nilai Vmaks = 3.278 µmol/menit dan Km sebesar 3.934 mM. [S] (mg/mL) [S] (mM) 1/S V (µmol/menit) 1/V 0.100 0.332 3.012 0.26 3.846 0.500 1.660 0.602 0.649 1.541 1.000 3.320 0.301 1.884 0.531 2.000 6.639 0.151 3.23 0.310 4.000 13.278 0.075 3.633 0.275

Kurva linier oNP vs waktu

Lampiran 9 Hasil pemurnian β-galaktosidase dengan pengendapan amonium sulfat Fraksi [ONP] µmol Aktivitas (U/mL) Aktivitas (U) [Protein] mg/mL Total Protein (mg) Aktivitas Spesifik (U/mg) 0-10% 1.060 2.121 2.121 0.179 0.179 11.851 10-20% 2.138 4.276 4.148 0.283 0.275 15.089 20-30% 2.247 4.493 5.841 0.294 0.383 15.263 30-40% 2.479 4.958 5.652 0.298 0.339 16.656 40-50% 18.744 37.488 37.488 2.009 2.009 18.656 50-60% 39.597 79.194 79.194 5.978 5.978 13.248 60-70% 6.946 13.891 13.891 3.074 3.074 4.520 y = 0.2601x + 1.2664 R² = 0.9203 y = 0.6494x + 1.6956 R² = 0.9689 y = 1.8443x + 14.47 R² = 0.8305 y = 3.2307x + 10.055 R² = 0.9441 y = 3.633x - 0.8127 R² = 0.9943 -20 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 30 [o N P] (µ m o l) Waktu (menit) oNPGal 0.1 mg/mL oNPGal 0.5 mg/mL oNPGal 1 mg/mL oNPGal 2 mg/mL oNPGal 4 mg/mL

(30)
(31)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Klaten, 7 Januari 1992 dari ayah Lusi Hartono dan Ibu Eny Suwartiningsih. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan menengah atas di SMAN 1 Tambun Selatan tahun 2009. Pada tahun yang sama, penulis meneruskan pendidikan di Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Selama masa perkuliahan, penulis mengikuti organisasi kampus sebagai bendahara umum 1 UKM Gentra Kaheman tahun 2011-2012 dan 2012-2013, dan staff biologi molekuler CREBS (Community of Reasearch and Education in

Biochemistry) tahun 2011-2012. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum

biokimia umum tahun ajaran 2012-2013 dan asisten praktikum pengantar penelitian biokimia tahun ajaran 2013.

Gambar

Gambar 1 Pengaruh Inokulum B134 terhadap aktivitas spesifik   β-galaktosidase dari isolat BAL strain B134
Gambar 3 Pengaruh laktosa terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari  isolat BAL strain B134
Tabel 1 Aktivitas β-galaktosidase pada tahapan purifikasi parsial
Gambar 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase
+3

Referensi

Dokumen terkait

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tingkat minat menonton film Drama Korea, mengetahui tingkat kecenderungan narsistik, dan Untuk menganalisis pengaruh dari

Hipotesis yang akan diuji pada penelitian ini adalah Variabel Kepribadian, Lingkungan, Demografis, Ketersediaan Informasi Kewirausahaan, Kepemilikan Jaringan Sosial,

Sistem Olah Tanah Intensif mampu meningkatkan tinggi tanaman, dan bobot kering berangkasan lebih tinggi dibandingkan dengan Olah Tanah Konservasi, sedangkan sistem olah tanah

Secara umum Laporan Akhir ini memuat rencana kerja yang meliputi; Pendahuluan, Arahan Perencanaan Pembangunan Bidang Cipta Karya, Arahan Perencanaan Pembangunan

Berdasarkan latar belakang permasalahan tersebut diatas, dirasa perlu dilakukan penelitian dengan menganalisa sistem pemilihan Rektor yang selama ini terjadi di

Apabila meninjau dari proses pembelajaran yang diharapkan tersebut, maka salah satu model pembelajaran yang dapat digunakan sehingga berpengaruh positif terhadap hasil

Hasil uji statistik menunjukkan p-valeu <0,05 sehingga dapat disimpulkan terdapat hubungan pengetahuan orang tua dengan perilaku kekerasan verbal pada anak di TK

Selain petugas RED CODE dan HDP masih ada satu tim lagi yang mempunyai kaitan dengan kebakaran yaitu tim K3 RSUD Panembahan Senopati Kabupaten Bantul. Tim ini