Lampiran 1. Alur penelitian
Sampel DNA Aren
Isolasi DNA
Uji Kualitas
Uji Kuantitas
Proses PCR-RAPD
Elektroforesis
Lampiran 2. Koleksi 27 aksesi tanaman aren di Sulawesi Tenggara
No. Kode LONG LAT TUTUPAN LAHAN KELURAHAN/DESA KECAMATAN KABUPATEN/KOTA PROVINSI
1 P2 122.400 -4.099 Semak/Belukar LABOJAYA KONDA KONAWE SELATAN SULAWESI TENGGARA
2 P3 122.400 -4.056 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak LAMOMEA KONDA KONAWE SELATAN SULAWESI TENGGARA
3 P4 122.450 -4.047 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak RANOMETTO KONDA KONAWE SELATAN SULAWESI TENGGARA
4 P5 122.400 -4.118 Hutan Lahan Kering Sekunder AMBOLOLI KONDA KONAWE SELATAN SULAWESI TENGGARA
5 K1 122.500 -3.981 Permukiman ABELI ABELI KENDARI SULAWESI TENGGARA
6 K2 122.590 -3.991 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak PETOAHA ABELI KENDARI SULAWESI TENGGARA
7 K4 122.400 -4.036 Semak/Belukar WATUBANGGA BARUGA KENDARI SULAWESI TENGGARA
8 K5 122.500 -4.015 Pertanian Lahan Kering ANDUONOHU POASIA KENDARI SULAWESI TENGGARA
9 K6 122.513 -3.950 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak ALOLAMA MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA
10 K7 122.517 -3.959 Permukiman ANGGILOWU MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA
11 K8 122.500 -3.932 Semak/Belukar LABIBIA MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA
12 K9 122.510 -3.961 Permukiman MANDONGA MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA
13 K10 122.502 -3.935 Semak/Belukar WAWOMBALATA MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA
14 K12 122.461 -3.969 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak PUUWATU PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA
15 K13 122.483 -3.967 Permukiman WATULONDO PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA
16 K14 122.490 -3.966 Permukiman PUNGGOLAKA PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA
17 K15 122.507 -3.961 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak TOBUUHA PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA
18 K16 122.497 -3.953 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak LALODATI PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA
19 K17 122.505 -3.982 Permukiman KADIA KADIA KENDARI SULAWESI TENGGARA
20 S1 122.446 -3.962 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak ABELI SAWAH SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA
21 S2 122.445 -3.968 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak LAKOMEA SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA
22 S3 122.432 -3.977 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak LASOSO SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA
23 S4 122.410 -3.979 Semak/Belukar BAO-BAO SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA
24 S5 122.414 -3.978 Semak/Belukar ANDAROA SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA
25 S6 122.390 -3.981 Pertanian Lahan Kering BercampurdenganSemak POHARA SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA
26 S7 122.379 -3.979 Semak/Belukar BAINI SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA
Lampiran 4. Pembuatan larutan stok dan bufer A. Pembuatan Larutan Stok
• CTAB 5 % (100 ml): Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB
sebanyak 5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan
ditambahkan 100 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan
stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.
• Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml): Timbang Tris sebanyak 12.114 gram.
Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk
campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas
hote plate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit
sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume
ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
• Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m): Timbang Tris sebanyak 6.057 gram.
Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades. Aduk
campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas
hote plate. Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit
sampai pH mencapai 7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume
ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.
• EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml): Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan
NaOH 2.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan
ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan
stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan HCl
ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan
menjadi 100 ml.
• NaCl 5 M (l00 ml): Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke
dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan
dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.
Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades
hingga volume larutan menjadi 100 ml.
**Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB
5%.
B. Pembuatan Larutan Bufer
• Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml): Campurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml
NaCl 5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml
aquades.
• Buffer TAE 50 X (100 ml): Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7
ml Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga
volume larutan menjadi 100 ml.
• Buffer TAE 1X (500 ml): Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml
aquades.
• Buffer TE (50 ml): Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M PH 8.0, 0.1 ml EDTA
0.5 M PH 8.0 dan 49.4 ml aquades.
• Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml): Campurkan 48 ml Kloroform dan
2 ml Isoamilalkohol.
Lampiran 5. Proses isolasi DNA
Sampel daun aren ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil ditambahkan nitrogen cair dan PVPP
Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 1 ml buffer ekstraksi dan 10 µl β-mercaptoetanol
Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit pada suhu 650C
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu 40C selama semalaman
Tabung disentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit dan dikeringanginkan
Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl
Campuran ditambahkan dengan etanol absolut dingin dan diinkubasi dalam freezer (-200C) selama 30 menit
Campuran disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit
Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringanginkan
Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE
Lampiran 6. Proses uji kualitatif
Agaros 0.28 gram ditambahkan dengan 35 ml bufer TAE 1x
Campuran dipanaskan dengan hot plate
Campuran ditambahkan 0.5 µl EtBr
Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dlam chamber berisi bufer TAE 1x
Sampel dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel dengan perbandingan (5:1)
Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 80 volt
Lampiran 7. Proses PCR-RAPD
Komposisi Master Mix volume 25 µl :
Go Taq PCR 12.5 µl
nuclease free water9.5 µl primer 1 µl DNA sampel 2 µl
RunningPCR sebanyak 45 siklus : Denaturasi awal 94o C 2 menit
Denaturasi 94o C 1 menit
Annealing36o C 1 menit
Extension72o C 2 menit
Post extension72o C 10 menit Kondisi akhir PCR 4o C Tak terbatas
Lampiran 8. Proses elektroforesis hasil PCR-RAPD
Agaros 1.3 gram ditambahkan dengan 130 ml bufer TAE 1x
Campuran dipanaskan dengan hot plate
Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr
Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir
Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dlam chamber berisi bufer TAE 1x
Sampel hasil PCR, marker dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel dengan
perbandingan (8:5:2)
Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 100 volt
