BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi :
- Rotari Evaporator Heidolph WB 2000
- Gelas ukur Pyrex
- Gelas beaker Pyrex
- Gelas erlenmeyer Pyrex
- Tabung reaksi Pyrex - Rak tabung reaksi - Blender
- Spektrofotometer UV-Visible Spectronic 300
- Lemari pendingin Toshiba
- Pipet mikro Eppendorf
- Jarum ose - Cawan petri
- Inkubator Fiber Scientific
- Jangka sorong
- Autoklaf Yamata SN 20
- Pinset - Kuvet - Labu takar
- Neraca analitik Mettler AE 200
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : - Buah mengkudu
- Etanol - Aquadest
- Nutrient Agar (NA)
- Mueller Hinton Agar (MHA) - Serbuk DPPH
- Biakan Staphylococcus aureus - Biakan Escherichia coli
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang akan diteliti adalah buah mengkudu yang diproleh didaerah jalan krakatau, medan deli, medan. Buah mengkudu diiris tipis tipis setelah itu dikeringkan dibawah terik matahari selanjutnya dihaluskan dengan belender sampai diperoleh serbuk mengkudu sampai diproleh 300 gr.
3.3.2 Ekstraksi Serbuk Buah Mengkudu
3.3.3 Uji Antioksidan
3.3.3.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
Ditimbang serbuk DPPH sebanyak 8mg, dimasukan kedalam labu takar 50 ml, ditambahkan methanol p.a sampai garis batas, dan dihomogenkan.
3.3.3.2 Pembuatan Larutan Blanko
Diukur larutan DPPH 0,3 mM sebanyak 1ml dimasukan kedalam labu takar 25ml ditambahkan methanol p.a sampai garis batas dihomogenkan, dibiarkan selama 30 menit pada ruangan gelap, diukur absorbansi panjang maksimum 516 nm.
3.3.3.3 Pembuatan Variasi Ekstrak Buah Mengkudu
Ditimbang ekstrak mengkudu sebanyak 1 g dimasukan kedalam labu takar 100 ml, ditambahkan methanol p.a sampai baris batas dihomogenkan. Dibuat variasi konsentrasi 100,200,300,400 ppm.
3.3.3.4 Uji Larutan Ekstrak Mengkudu
Diukur 5 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukan kedalam labu takar 25 ml ditambahkan 2,5 ml larutan ekstrak mengkudu 100 ppm dihomogenkan dibiarka selama 30 menit pada ruangan gelap dan diukur absorbansi pada panjang gelombang 516 dilakukan dengan cara yang sama terhadap larutan ekstrak mengkudu 200, 300 dan 400 ppm.
3.3.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Mengkudu
3.3.4.1 Pembuatan Media Nutrien Agar (Na) Dan Inokulasi Bakteri
3.3.4.2 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Sebanyak 3,8 g MHA dimasukan dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan 100 ml akuadest. Lalu panaskan diatas hot plate sampai mendidih dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu121 oC selama 15 menit. Kemudian media dituang kedalam 6 cawan petri dan didinginkan sampai media memadat.
3.3.4.3 Pembuatan Suspensi Bakteri
Masing-masing inokulat escherichia coli dan staphylococcus aureus diambil dengan jarum ose steril dan disuspensi dengan akuades steril lalu dihomogenkan dengan vortex hingga diperoleh suspensi sebanding kekeruhan.
3.3.4.4 Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Buah Mengkudu
Ekstrak mengkudu ditimbang sebanyak 500 mg kemudian dilarutkan dengan 1 ml DMSO, konsentrasi ekstrak sama dengan 500 mg/ml. Kemudian dari konsentrasi 500 mg/ml dengan rumus pengenceran V1 . C1 = V2 . C2 dihitung dengan konsentrasi 400 mg/ml, 300 mg/ml, 200 mg/ml dan 100 mg/ml.
3.3.4.5 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Mengkudu
Dimasukan media mueller hinton agar (MHA) kedakam cawan perti steril dengan suhu 45-50 oC kemudian dibiarkan sampai memadat. Diambil cottom bud steril, lalu dicelupkan kedalam inokulum bakteri, kemudian digoreskan kedalam media MHA yang telah memadat. Dimasukan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak mengkudu dengan berbagai variasi konsentrasi kedalam cawan petri yang telah terisi bakteri, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 oC selama 24 jam. Selanjutnya diukur diameter zona hambat disekitar kertas cakram dengan jangka sorong, dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphyloccus aureus.
3.4 Bagan Penelitian
3.4.1 Pembuatan Ekstrak Buah Mengkudu
Dimaserasi dengan etanol 70% sebanyak 1 L
Didiamkan selama ± 24 jam Disaring
Dipekatkan dengan rotari evaporator
3.4.2 Uji Antioksidan Terhadap Ekstrak Buah Mengkudu 3.4.2.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
Dimasukan kedalam labu takar 50 ml Ditambahkan etanol p.a sampai garis batas
Dihomogenkan 300 gr Serbuk Buah Mengkudu
Larutan etanol Residu
Ekstrak pekat Mengkudu
8 mg Serbuk DPPH
3.4.2.2 Pembuatan Variasi Larutan Ekstrak Buah Mengkudu
Dimasukan kedalam labu takar 50 ml Ditambahkan etanol p.a sampai garis batas
Dihomogenkan
Dipipet 2,5 ml dengan pipet volum
Dimasukan kedalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a sampai garis batas Dihomogenkan p.a sampai garis batas Dihomogenkan
Dipipet 7,5 ml dengan pipet volum
Dimasukan kedalam labu takar 25 ml Ditambahkan etanol p.a sampai garis batas Dihomogenkan
Dilakukan hal yang sama untuk konsenrasi larutan 400 ppm dengan penambahan larutan induk sebanyak 10 ml.
0,05 g Ekstrak Buah Mengkudu
50 ml larutan induk 1000 ppm
25 ml larutan
3.4.2.3 Pembuatan Larutan Blanko
Dimasukan kedalam tabung reaksi Ditambahkan 2,5 ml etanol p.a Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan gelap Diukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum 516 nm
3.4.2.4 Uji Larutan Variasi Konsentrasi Sampel
Dimasukan kedalam tabung reaksi
Ditambahkan 2,5 ml larutan sampel sesuai konsentrasi
Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan gelap Diukur absorbansi pada panjang gelombang maksimum 516 nm
1 ml larutan DPPH 0,4 mM
Hasil
1 ml larutan DPPH 0,4 mM
3.5.4. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Buah mengkudu 1. Pembuatan Media Mueller Hinton (MHA)
Dilarutkan dengan 250 ml aquadest didalam labu erlenmeyer
Dipanaskan dan diaduk hingga larut dan mendidih
Disterilkan didalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit
8,5 gram media MHA (Mueller Hinton Agar)
2. Pembuatan Stok Kultur Bakteri
Dilarutkan dengan 250 ml aquadest kedalam gelas erlenmeyer
Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit
Dimasukan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml Dibiarkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut 30-45 o
Diambil biakan bakteri S.aureus dari strain utama dengan jarum ose lalu digoreskan pada media NA yang telah memadat
Diinkubasi pada suhu 35oC selama 18-24 jam
Dilakukan hal yang sama untuk bakteri E.coli 1,3 gram Media NA (Nutrien Agar)
Media NA (Nutrient Agar) steril
3.5.4.1 Uji Aktivitas Ekstrak Buah mengkududengan Metode Kirby Bauer
Biakan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
disuspensi dalam akuades steril dihomogenkan dengan vortex dibandingkan dengan kekeruhan Suspensi bakteri
diencerkan dengan akuades
Steril sampai kekeruhan Media MHA
106 CFU/ml di inkubasi di
Suspensi Bakteri atas media MHA
di inkubasi di atas media MHA
Media MHA Cakram
Sampel
diletakkan cakram Sampel diatas media MHA di inkubasi secara terbaik dalam inkubator pada suhu 32-34ºC selama 24 jam
di ukur diameter zona antibakteri
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
4.1.1 Hasil Pengukuran Absorbansi Ekstrak Buah Mengkudu
Pada ekstrak buah mengkudu dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH radikal bebas untuk diperoleh nilai IC50 dengan dilakukan pengamatan secara spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang maksimum 516 nm. Kemampuan antioksidan diukur sebagai penurunan serapan larutan DPPH (perendaman warna ungu DPPH) dapat dilihat pada tabel 4.1.
Tabel 4.1.1 Hasil Pengukuran Absorbansi Ekstrak Buah Mengkudu Sampel Absorbansi% Peredaman
Blanko 0,770 0 100ppm 0,35753,63
200 ppm 0,167 78,31 300 ppm 0,059 92,33
Dari persamaan regresi linier diproleh nilai IC50 = 33,93 mg/ml
Gambar 4.1.1 Grafik % Perendaman Vs Konsentrasi Ekstrak Buah Mengkudu
4.1.2 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Buah Mengkudu Dengan Metode Kirby Baurer
Pada ekstrak buah mengkudu dilakukan uji aktivitas antibakteri dengan menggunakan Metode Kirby Bauer.Aktivitas antibakteri ekstrak buah mengkudu menunjukkan memiliki zona hambat pada pertumbuhan bakteri patogen yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
a b
Gambar 4.1.2.1 Zona Hambat Pada a Larutan BlankoStaphylococcus aureus
a b
Gambar 4.1.2.2 Zona Hambat pertumbuhan a bakteri Staphylococcus aureus dan b bakteriEscherichia coli
a b
Gambar 4.1.2.3 Zona Hambat Pertumbuhan a bakteri Staphylococcus aureusdan b bakteriEscherichia coli
Tabel 4.1.2 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Buah Mengkudu No Spesies Bakteri Konsentrasi Diameter
Zona Hambat 2 Staphylococcus aureus
Gambar 4.1.2 Grafik Diameter Zona Bening Ekstrak Buah Mengkudu 4.2 Pembahasan
4.2.1 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Mengkudu
Berdasarkan tabel 4.1.1 menunjukan bahwa adanya penurunan absorbansi DPPH dengan penambahan ekstrak buah mengkudu pada larutan DPPH dibandingkan dari larutan blanko tanpa penambahan ekstrak buah mengkudu. Penurunan absorbansi yang semakin besar menunjukan aktivitas antioksidan yang semakin besar pula. Hal ini menunjukan adanya aktivitas antioksidan dalam rendaman radikal bebas DPPH. Jika semua elektron pada DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi pada panjang gelombang maksimumnya akan hilang. Penurunan nilai absorbansi terjadi karena larutan uji merendam DPPH dan rendaman terjadi karena adanya transfer elektron atom hidrogen antioksidan kepada DPPH. DPPH merupakan suatu molekul radikal bebas yang distabilkan oleh bentuk resonansi.
0
100 mg/ml 200 mg/ml 300 mg/ml 400 mg/ml 500 mg/ml
Gambar 4.2.1. Reaksi Penangkapan Radikal Bebas DPPH oleh Antioksidan
Nilai IC50 diperoleh berdasarkan persamaan regresi linier yang didapatkan dengan cara memplot konsentrasi larutan uji dan persen peredaman DPPH sebagai parameter aktivitas antioksidan, dimana konsentrasi larutan uji (ppm) sebagai basis (sumbu X) dan nilai persen peredaman sebagai ordinat (sumbu Y)
Hasil persamaan regresi linier yang diperoleh untuk ekstrak buah mengkudu memiliki hasil analisis IC50 diperoleh 33,93 mg/ml.
Dari literatur dapat diketahui bahwa jika nilai IC50 yang dihasilkan lebih dari 100, maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan yang Sangat Kuat.Tingkat kekuatan senyawa antioksidan menggunakan metode DPPH dapat digolongkan sebagai berikut :
Tabel 4.2.1 Tingkatan Kekuatan Senyawa Antioksidan
No Intensitas Nilai IC50
1 Sangat kuat < 50 mg/ml
2 kuat 50-100 mg/ml
3 4
Sedang Lemah
4.2.2 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Buah Mengkudu Dengan Metode Kirby Baurer
Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak buah mengkudu dapat dilihat tabel 4.1.2 terhadap bakteri staphylococcus aureus dan escherchia coli menunjukkan hasil yang positif, ini ditandai dengan terbentuknya zona bening disekitar cakram. Senyawa antimikroba dapat menyebabkan kerusakan sel bakteri dengan beberapa cara. Secara umum mekanisme kerja antimikroba dalam menghambat mikroba adalah : (1) bereaksi dengan membran sel, (2) inaktivasi enzim esensial, dan (3) mendetstruksi atau mengaktivasi fungsi materi genetik. Dari ekstrak buah mengkudu yang mengandung senyawa antimikroba yaitu senyawa Acubin, Asperuloside, Alizarin dan beberapa zat Antraquinon yang telah terbukti sebagai zat anti bakteri sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Ekstrak buah mengkudu yang dihasilkan mampu menghambat fungsi membran sel dimana membran sel dibatasi oleh sitoplasma yang berperan aktif sebagai barier permeabilitas selektif, membawa fungsi transpor aktif, dan mengontrol komposisi internal sel. Ketika fungsi integrasi membran sitoplasma dirusak, maka makromolekul dan ion keluar dari sel, kemudian sel bakteri rusak.
Berdasarkan Clinical and Laboratory Standarts Institute (2012) menyatakan bahwa batas daerah hambatan bakteri yaitu dengan diameter zona
hambatan ≥ 20 memiliki zona hambatan yang sangat efektif, antara 15 sampai 19 mm memiliki zona hambatan efektif, ≤ 14 memiliki zona hambatan kurang
efektif.
ekstrak, dan daya antibakteri zat berkhasiat. Makin besar inokulum maka semakin kecil hambatnya sehingga semakin kecil zona yang terbentuk. Konsentrasi yang mempengaruhi kecepatan difusi zat berkhasiat. Semakin besar konsentrasi ekstrak semakin cepat difusi akibatnya semakin besar daya antibakteri dan makin luas diameter zona hambat yang terbentuk (jawetz, 2005)
Dari hasil penelitian menunjukan bahwa ektrak buah mengkudu lebih mudah menghambat pertumbuhan bakteri gram positif yaitu Staphylococcus Aureusdibandingkan dengan bakteri gram negatifyaitu Escherichia Coli. hal ini disebakan oleh perbedaan komposisi dan struktur dinding sel pada bakteri gram positif dan gram negatif. Struktur dinding sel bakteri gram positif berlapis tunggal dengan kandungan lipid yang rendah (1-4%), sedangkan bakteri gram negatif memiliki kandungan lipid tinggi yaitu (11-12%) dan membran terluar terdiri dari 3 lapisan yaitu lipopolisakarida, lipoprotein, dan pospolipid (fardiaz, 1992)
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Hasil uji aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol buah mengkudu dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus Aureus dan Escherichia Coli memperlihatkan bahwa ekstrak etanol buah mengkudu memiliki aktivitas antibakteri pada konsentrasi 500 mg/ml dengan zona hambat masing masing 12 mm dan 14 mm dikategorikan kurang efektif terhadap bakteri Staphylococcus Aureus dan Escherichia Coli.
2. Hasil persamaan regresi linier yang diperoleh untuk ekstrak etanol buah mengkudu memiliki hasil analisis IC50 diperoleh 33,93 mg/ml.Dari literatur dapat diketahui bahwa jika nilai IC50 yang dihasilkan lebih dari 100, maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan yang Sangat Kuat.
5.2 Saran
