18 UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MINYAK BUAH MERAH (Pandanus conoideus
LAM.) SECARA in Vitro DAN In Vivo PADA TIKUS YANG DIBERI BEBAN AKTIVITAS FISIK MAKSIMAL
1Ni Made Dwi Sandhiutami, 2Ngatidjan, 2Erna Kristin 1 Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila
2 Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada Email: dwi_sandhiutami@yahoo.com
Abstract
Increasing oxygen consumption during intensive physical exercise may increase production of free radicals, and if it exceeds physiological capacity may cause oxidative stress as shown as chance of MDA level. Buah merah oil contains high betacarotene and tocopherol, as well as fatty acid such as oleic acid, linoleic acid, linolenic acid and decanoic acid. Tocopherol is major biological lipid-soluble antioxidant, protecting structures and function of cell membranes from free radicals. The objective of this study was to know in vitro antioxidant activity and the effect of buah merah oil on MDA level in blood during maximum physical activity treatment. In vitro antioxidant activity test was conducted using DPPH method (2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl). In vivo antioxidant activity test was done by using 24 male Wistar rats in pre - post test control group design. The rats were grouped into 4 groups. The control group was given destillated water and three treatment groups were given buah merah oil in the dose of 0,15 ml/kgBW; 0,3 ml/kgBW; 0,6 ml/kgBW respectivelyfor 10 days. Before buah merah oil was given, level of MDA was measured. Ten days later, the four group were given maximum physical activity mean of swimming until the sign of fatigue occurred (nearly drowned) and the blood was taken for blood MDA examination. In vitro, the IC50 of buah merah oil was 451,51 μg/ml. In vivo test, dosage 0,15 ml/kgBW could decrease MDA 5,22% Dosage 0,3 ml/kgBW could decrease MDA 11,96% and dosage 0,6 ml/kgBW could decrease MDA 8,19% . Buah merah oil showed antioxidant activity in vitro. In vivo experiment, all dosage of buah merah oil decreased blood MDA level but in the dose of 0,3 ml/kgBW decreased MDA level more than dose of 0,15 ml/kgBW and 0,6 ml/kgBW.
Key words: red fruit oil, antioxidant,DPPH, physical exercise, MDA Pendahuluan
Pada latihan fisik konsumsi oksigen tubuh akan meningkat 10 sampai dengan 15 kali lebih tinggi dibanding waktu istirahat (Metin et al., 2002). Meningkatnya konsumsi oksigen selama latihan fisik yang intensif, dapat meningkatkan produksi radikal bebas (Clarkson & Thompson, 2000). Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan di orbit terluarnya (Murray et al.,1996). Radikal bebas yang diproduksi pada latihan fisik dapat melebihi kapasitas
pertahanan antioksidan sehingga mengakibatkan stres oksidatif (Allesio, 1993). Vittala et al.(2004), mengemukakan bahwa latihan fisik dengan intensitas sedang dan berat akan menghasilkan radikal bebas oksigen yang dapat menyebabkan kerusakan pada membran lipid, protein, DNA, dan komponen sel lainnya.
Kerusakan pada membran lipid yang dikenal sebagai peroksidasi lipid, merupakan kerusakan oksidatif dari lemak tidak jenuh rantai panjang pada membran lipid yang disebabkan oleh radikal bebas
2 oksigen (Gutteridge, 1995). Penemuan dan
pengukuran peroksidasi lipid merupakan bukti yang paling sering digunakan untuk mendukung peranan reaksi radikal bebas dalam timbulnya penyakit (Gutteridge, 1995). Pendekatan yang paling umum digunakan untuk mengukur produk akhir yang menyertai peroksidasi lipid adalah pengukuran malondialdehid (MDA) (Janero, 1990).
Tubuh mempunyai sistem pertahanan terhadap radikal bebas yaitu komponen antioksidan endogen seperti superoxide dismutase (SOD), glutation peroksidase (GPX), dan katalase yang dapat menghilangkan radikal bebas secara enzimatik dan antioksidan eksogen yang besarnya tergantung pada masukan diet. Meskipun tubuh secara alami dapat mengatasi peningkatan radikal bebas tetapi pada kondisi tertentu seperti pada latihan fisik yang relatif berat, antioksidan endogen tidak mencukupi, sehingga tubuh memerlukan antioksidan dari luar (Clarkson & Thompson, 2000).
Eksplorasi senyawa antioksidan dari bahan alam kini banyak dilakukan. Salah satu tanaman obat yang cukup menarik perhatian dan banyak diteliti sejak akhir 2004 adalah buah merah (Pandanus conoideus Lam.). Penelitian kandungan senyawa aktif dalam minyak buah merah yang berkhasiat obat telah dilakukan dan pada awalnya ditujukan untuk menggungkap kandungan gizinya. Minyak buah merah mengandung zat-zat gizi bermanfaat atau senyawa aktif dalam kadar tinggi, diantaranya betakaroten, tokoferol, serta asam lemak seperti asam oleat, asam linoleat, asam linolenat, dan asam dekanoat. Kandungan tokoferol dalam minyak buah merah tinggi dan memiliki aktivitas biologi sebagai antioksidan (Budi & Paimin, 2004). Minyak buah merah yang mengandung tokoferol sebagai antioksidan, dapat mencegah dampak
buruk peroksidasi lipid yang timbul pada pemberian beban aktivitas fisik maksimal yang ditunjukkan dengan perubahan kadar MDA.
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan berbagai metode. Meskipun suatu senyawa uji menunjukkan aktivitas antioksidan yang tinggi dengan salah satu metode, tidak selalu akan memberikan hasil yang sama baiknya dengan menggunakan metode lainnya sehingga disarankan untuk mengukur aktivitas antioksidan dengan berbagai macam metode (Takaya et al.,2003). Sehingga pada penelitian ini dilakukan secara in vitro dan in vivo.
Apabila diketahui bahwa pemberian minyak buah merah dapat sebagai antioksidan melalui pengujian in vitro dan mampu meredam peroksidasi lipid yang ditunjukkan dengan penurunan kadar MDA, maka pemberian suplemen buah merah dapat direkomendasikan sebagai antioksidan untuk mengurangi efek negatif akibat latihan fisik dan mencegah terjadinya penyakit-penyakit degeneratif. Selain itu penelitian ini dapat meningkatkan pemeliharaan dan pengembangan pengobatan tradisional sebagai antioksidan yang secara medis dapat dipertanggungjawabkan.
Metodologi Penelitian
Uji aktivitas antioksidan merupakan penelitian eksperimental laboratoris murni. Uji aktivitas antioksidan secara in vitro dilakukan dengan menggunakan DPPH (Zou et al., 2004). Sedangkan uji aktivitas antioksidan secara in vivo dilakukan dengan pre test- post test control group design dengan tiga kelompok eksperimen dan satu kelompok kontrol (Campbell & Stanley, 1972).
3 1.Bahan utama
Bahan yang digunakan adalah minyak buah merah yang diperoleh dari Drs. I Made Budi, dosen Fakultas MIPA, Universitas Cendrawasih, Irian Jaya. Drs. I Made Budi merupakan orang pertama yang membudidayakan tanaman buah merah. Bagian buah yang digunakan adalah daging buah merah yang diolah menjadi minyak buah merah
2. Bahan penunjang
Bahan penunjang yang digunakan adalah
DPPH (2,2-difenil-1-pikril
hidrazil)(Sigma.Co), etanol, akuades, EDTA, TBA, 4,1,3,3-tetrametoksi propane, asam fosfowalframat, asam asetat glasial, BHT, heksan, dan dl-α- tochopherol.
3. Subyek penelitian in vivo
Penelitian ini menggunakan tikus putih galur Wistar jantan sebagai subyek penelitian yang didapat dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada dalam kondisi yang terkontrol. Penelitian stres oksidatif dengan menggunakan model binatang mempunyai keuntungan dari sisi teknis, yaitu prosedur pengukuran parameter stres oksidatif yang dipakai bisa lebih invasif. (Nakao et al., 2000)
4. Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah timbangan untuk tikus, bak untuk aktivitas berenang, sonde untuk memasukkan bahan uji, mikrohaematokrit, alat gelas dan alat laboratorium standar antara lain: timbangan elektronik, vortex mixer, magnetic stirer, PH meter, dispenser, mikropipet dari berbagai macam ukuran, sentrifuge, water bath, spektrofotometer UV-VIS (Spektronik 20-Genesys) dan spektrofluorometer Shimadzeu RF 510.
5. Jalannya Penelitian
a. Pengujian aktivitas antioksidan secara in vitro
Satu mililiter DPPH 0.5 mM dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 50 μl minyak buah merah atau vitamin E dengan berbagai konsentrasi. Kemudian ditambahkan 3,95 ml etanol dan divortex hingga tercampur merata dan didiamkan selama 30 menit. Besarnya konsentrasi minyak buah merah yang diperoleh dibuat hingga memberikan nilai IC50 yaitu konsentrasi yang memberikan persentase penangkapan radikal sebanyak 50% dibanding kontrol melalui suatu persamaan garis regresi linier. Setelah itu, serapan larutan dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Dilakukan pula pembacaan serapan larutan kontrol yakni tanpa penambahan bahan uji atau vitamin E. Besarnya aktivitas antiradikal atau penangkapan radikal (radical scavenging) dihitung dengan rumus :
% aktivitas = (Absorbansi kontrol–Absorbansi sampel)x 100% antioksidan Absorbansi kontrol
b. Pengujian aktivitas antioksidan secara in vivo
Sampel darah diambil dari seluruh subyek penelitian, yaitu tikus putih galur Wistar sebelum diberi perlakuan dari medial canthus sinus orbitalis ± sebanyak 2 ml. Darah disentrifuse untuk mendapatkan plasma dan dilakukan pengukuran kadar MDA pada plasma. Kemudian masing-masing kelompok perlakuan diberikan sediaan uji dengan dosis 0,15 ml/kgBB per hari; 0,3 ml/kgBB per hari; dan 0,6 ml/kgBB per hari, selama 10 hari. Pada hari ke-10, tikus dibuat stres oksidatif dengan diberi beban aktivitas fisik maksimal yaitu dibuat berenang sampai terjadi tanda-tanda kelelahan berupa hampir tenggelam (Nakao et al., 2000). Setelah itu sampel darah segera diambil, kemudian dilakukan kembali pengukuran kadar MDA pada plasma.
4 c. Cara mengukur kadar malondialdehid
(MDA)
Duaratus limapuluh mikroliter plasma ditambah 100 μl sodium duodesil (SDS) 8,1%, 750 μl HCl 0,5 M, 750 μl thiobarbituric acid (TBA) 20 M, dan 125 μl aquabidest (DDW ), divortex. Lalu dilakukan pemanasan selama 15 menit pada suhu 90 °C. Kemudian dinginkan selama 10 menit. Tambahkan aquabidest (DDW) 500 μl dan 2,5 ml n Butanol pir, divortex, lalu disentrifuge 3000x g selama 15 menit. Supernatan dibaca pada eksitasi fluorometer 520 nm, emisi 550 nm, lalu dilihat absorbansinya(Yagi K, 1987). 6. Analisis data
Analisis statistik menggunakan program SPSS 11. Pada penelitian ini dilihat uji beda tiap kelompok sebelum dan sesudah perlakuan dengan uji t terhadap kadar MDA. Kemudian dilakukan uji
ANOVA satu jalur dengan P<0,05 untuk melihat perbedaan antar-kelompok terhadap kadar MDA. Bila pada uji ini ditemukan perbedaan yang bermakna, maka dilakukan tes Post hoc untuk variabel yang bermakna tersebut.
Hasil dan Pembahasan
Penentuan Aktivitas Antioksidan secara In Vitro dengan DPPH
Aktivitas antioksidan minyak buah merah dengan DPPH disertai dengan nilai IC50 -nya (suatu konsentrasi bahan uji yang mempunyai aktivitas antioksidan sebanyak 50%) disajikan dalam tabel 1. Sebagai pembanding digunakan vitamin E yang sudah diketahui sebagai antioksidan. Data penentuan aktivitas antioksidan vitamin E dengan metode DPPH beserta nilai IC50 -nya dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 1. Aktivitas antioksidan minyak buah merah dengan metode DPPH Absorbansi kontrol 0,770 ± 0,010
Kadar minyak buah merah (μg/ml) Absorbansi sampel pada λ 517 nm Aktivitas antioksidan (%) Rata-rata aktivitas ± SD (n=3) 0,547 28,96 173,00 0,556 27,79 28,40 ± 0,59 0,551 28,44 0,502 34,81 259,50 0,516 32,99 33,99 ± 0,92 0,507 34,16 0,460 40,26 346,00 0,459 40,39 40,74 ± 0,72 0,450 41,56 0,391 49,22 432,50 0,395 48,70 48,74 ± 1,02 0,398 48,31 0,357 53,64 519,00 0,340 55,84 55,76 ± 2,08 0,325 57,79
Persamaan garis regresi liniernya : y = 0,0803 x + 13,738 r = 0,9982
IC50 = 451,51 μg/ml
x = kadar minyak buah merah
2 Tabel 2. Aktivitas antioksidan vitamin E dengan metode DPPH
Absorbansi kontrol 0,75 ± 0,006 Kadar Vitamin E (μg/ml) Absorbansi sampel pada λ 517 nm Aktivitas antioksidan (%) Rata-rata aktivitas ± SD (n=3) 0,634 15,47 4,01 0,639 14,80 15,29 ± 0,43 0,633 15,60 0,557 25,73 6,02 0,551 26,53 25,60 ± 1,01 0,566 24,53 0,473 36,93 8,02 0,483 35,60 36,09 ± 0,73 0,482 35,73 0,330 56,00 12,04 0,346 53,87 54,76 ± 1,11 0,342 54,40 0,180 76,00 16,05 0,176 76,53 76,49 ± 0,47 0,173 76,93
Persamaan garis regresi liniernya : y = 5,036 x – 4,822 r = 0,9997
IC50 = 10,89 μg/ml
x = kadar vitamin E
y = aktivitas antioksidan rata-rata vitamin E
Untuk lebih jelasnya, pada gambar 1 dan 2 dilukiskan kurva yang menyatakan hubungan antara kadar minyak buah merah dan vitamin E dengan rata-rata aktivitas antioksidan (%)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 173,00 259,50 346,00 432,50 451,51 519,00 ka da r minya k bua h me ra h (μg/ml) ak tiv ita s ant iok si da n (% )
Gambar 1. Grafik hubungan antara kadar minyak buah merah dengan rata-rata aktivitas antioksidan(%)
3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4,01 6,02 8,02 10,89 12,04 16,05 kadar vit E (μg/ml) ak tiv ita s ant iok si da n (% )
Gambar 2. Grafik hubungan antara kadar vitamin E dengan rata-rata aktivitas antioksidan (%) Dari hasil regresi linier, diperoleh IC50
vitamin E sebesar 10,89 μg/ml, sedangkan minyak buah merah mempunyai nilai IC50 sebesar 451,51 μg/ml. Dari harga IC50 dapat diketahui bahwa minyak buah merah memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kecil daripada vitamin E.
DPPH merupakan radikal sintetik yang larut dalam pelarut polar seperti metanol dan etanol. DPPH merupakan radikal yang stabil yang dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang 515 nm (Pokorni et al., 2001).
Adanya senyawa yang bereaksi sebagai antioksidan akan mereduksi radikal DPPH menurut reaksi: DPPH• + AH DPPH-H + A• N N. O2N O2N NO2 + ROH N HN O2N O2N NO2+RO. Radikal DPPH (ungu) Flavonoid DPPHH (kuning) Radikal Fenoksi Flavonoid
Gambar 3. Reaksi antara DPPH dengan senyawa antioksidan (Molyneux, 2004) Sebagai akibatnya, maka penambahan senyawa yang bereaksi sebagai antiradikal akan menurunkan konsentrasi DPPH ini. Adanya penurunan konsentrasi DPPH ini
akan menyebabkan penurunan
absorbansinya dibandingkan dengan absorbansi kontrol yang tidak diberi senyawa uji yang diduga mempunyai aktivitas antioksidan (Molyneux, 2004).
Adanya aktivitas antioksidan minyak buah merah ditunjukkan oleh menurunnya absorbansi larutan DPPH yang ditambah dengan minyak buah merah dibandingkan dengan absorbansi larutan kontrol (larutan DPPH yang tidak ditambah dengan minyak buah merah). Hal ini disebabkan adanya senyawa antioksidan, yaitu tokoferol dan beta karoten dalam minyak buah merah yang mampu mereduksi radikal DPPH. Parameter yang digunakan untuk aktivitas antioksidan dengan metode penangkapan radikal DPPH ini adalah IC50 yaitu konsentrasi senyawa (ekstrak) uji yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar 50% (Zou et al., 2004). Harga IC50 didefinisikan sebagai konsentrasi efektif zat uji yang dapat menurunkan 50% intensitas serapan dibandingkan dengan kontrol. Nilai IC50 diperoleh dengan menggunakan persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji (x) dengan aktivitas antioksidan rata-rata (y) dari suatu seri replikasi pengukuran. Semakin kecil nilai IC50, maka senyawa uji tersebut mempunyai keefektifan sebagai antioksidan yang lebih baik.
Dari hasil regresi linier pada penelitian ini, dapat diketahui bahwa minyak buah merah memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kecil daripada vitamin E. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh bentuk
2 sediaan uji (minyak buah merah) yang
masih berupa ekstrak kasar.
Efek Pemberian Minyak Buah Merah pada Kadar MDA
Subyek dalam penelitian adalah 24 ekor tikus putih galur Wistar yang dibagi menjadi 4 kelompok, yaitu 6 ekor untuk kelompok plasebo sebagai kontrol; 6 ekor untuk kelompok dosis 0,15 ml/kgBB; 6 ekor untuk kelompok dosis 0,3 ml/kgBB; dan 6 ekor untuk kelompok dosis 0,6 ml/kgBB sebagai kelompok perlakuan. Seluruh subyek penelitian diberi beban aktivitas fisik maksimal yaitu dibuat berenang sampai terjadi tanda-tanda kelelahan berupa hampir tenggelam. Aktivitas tersebut dilakukan selama 60 menit. Karakteristik subyek penelitian diperlihatkan pada tabel 3.
Karakteristik subyek tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna. Hal ini menunjukkan bahwa kondisi awal ketiga kelompok sama sehingga diharapkan hasil yang diperoleh benar-benar merupakan hasil dari perlakuan. Sebelum melakukan pengukuran kadar MDA dalam plasma, telah ditentukan nilai CV (Coeffisient of Variant) dari pemeriksa sehingga variasi hasil yang mungkin terjadi bukan karena kesalahan pemeriksa. Syarat nilai CV adalah < 5%. Nilai CV yang diperoleh pada pengujian in vitro adalah 2,07% pada kadar 173 μg/ml. Nilai CV untuk pengukuran MDA pada kadar 0,99 nmol/ml adalah 3,23%.
Pada penelitian ini, telah dilakukan penelitian pendahuluan dengan satu
kelompok plasebo dan beberapa kelompok variasi dosis. Dosis yang digunakan pada penelitian pendahuluan ini adalah dosis lazim yaitu 0,3 ml/kgBB; dosis yang ditingkatkan dua kali dari dosis lazim yaitu 0,6 ml/kg BB; dosis yang ditingkatkan empat kali dari dosis lazim yaitu 1,2 ml/kgBB; dan dosis yang ditingkatkan sepuluh kali dari dosis lazim yaitu 3 ml/kgBB.
Pada kelompok plasebo terjadi peningkatan kadar MDA darah sebesar 21,84% sedangkan pada kelompok dosis 0,3 ml/kgBB terjadi penurunan kadar MDA darah sebesar 18,64%; pada kelompok dosis 0,6 ml/kgBB terjadi penurunan kadar MDA darah sebesar 8,45%; dan pada kelompok dosis 1,2 ml/kgBB terjadi penurunan kadar MDA darah sebesar 7,53%. Tetapi kembali terjadi peningkatan kadar MDA darah pada dosis 3 ml/kgBB sebesar 16,98%. Berdasarkan hasil penelitian pendahuluan, variasi dosis yang digunakan pada penelitian ini adalah 0,15 ml/kgBB; 0,3 ml/kgBB; dan 0,6 ml/kgBB untuk melihat bagaimana pengaruh minyak buah merah pada dosis lebih rendah dan lebih tinggi dari dosis lazim.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terjadi peningkatan kadar MDA plasma sebesar 23,64% pada kelompok plasebo. Sementara pada kelompok dosis 0,15 ml/kgBB terjadi penurunan kadar MDA sebesar 5,22 %; pada kelompok dosis 0,3 ml/kgBB terjadi penurunan kadar MDA sebesar 11,96% dan pada kelompok dosis 0,6 ml/kgBB, kadar MDA plasma mengalami penurunan sebesar 8,19%. Tabel 3. Karakteristik subyek penelitian
Variabel Plasebo Dosis 0.15
ml/kgBB Dosis 0.3 ml/kgBB Dosis 0.6 ml/kgBB BB(kg) 149,67 ±5,04 148±0,75 148,83±6,04 149,83±3,13 Umur (bln) 2 2 2 2 Jumlah sampel 6 6 6 6
2 Perubahan kadar MDA plasma pada penelitian ditampilkan pada tabel 4 dan pada gambar 4. Tabel 4. Kadar MDA plasma (nmol/ml) sebelum dan sesudah perlakuan
Kelompok Sebelum perlakuan (mean ± SD) Sesudah perlakuan (mean ± SD) Perubahan kadar MDA (%) p Placebo 2,37 ± 0,32 2,90 ± 0,20 Peningkatan 23,64% 0,000 Kelompok dosis 0,15 ml/kgBB 2,65 ± 0,31 2,51 ± 0,30 Penurunan 5,22% 0,000 Kelompok dosis 0,3 ml/kgBB 2,59 ± 0,18 2,28 ± 0,13 Penurunan 11,96% 0,001 Kelompok dosis 0,6 ml/kgBB 3,05 ± 0,12 2,80 ± 0,13 Penurunan 8,19% 0,000 100% 123,64% 100% 94,78% 100% 88,03% 100% 91,81% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 140%
plasebo dosis 0,15 ml/kgBB dosis 0.3 ml/kgBB dosis 0.6 ml/kgBB
awal akhir
Gambar 4. Persentase perubahan kadar MDA
Pada kelompok plasebo, terjadi peningkatan kadar MDA darah yang bermakna secara statistik (p<0,05). Sedangkan pada ketiga kelompok dosis, terjadi penurunan kadar MDA yang bermakna secara statistik (p<0,05).
Dari ketiga variasi dosis, pemberian dosis 0,3 ml/kgBB menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan dosis 0,15 ml/kgBB dan dosis 0,6 ml/kgBB. Dosis 0,3 ml/kgBB merupakan dosis lazim dalam masyarakat yang secara empiris digunakan sebagai pengobatan tradisional. Dosis 0,15 ml/kgBB menunjukkan persentase penurunan kadar MDA yang lebih kecil jika dibandingkan dengan dosis lazim karena kadar yang diberikan lebih rendah. Sehingga jumlah antioksidan tidak cukup banyak untuk meredam radikal bebas yang terbentuk.
Dosis 0,6 ml/kgBB juga menunjukkan persentase penurunan kadar MDA yang lebih kecil jika dibandingkan dengan dosis 0,3 ml/kgBB. Hal ini karena antioksidan potensial dapat menjadi suatu pro-oksidan. Tokoferol (Toc H) karena keberadaannya dalam membran, dapat bereaksi dengan radikal lipid (L•) dan radikal peroksilipid (LOO•).
Toc-H + L• Toc• + LH
Toc-H + LOO• Toc• + LOOH
Radikal tokoferil (Toc•) tidak terlalu reaktif karena terjadinya resonansi. Meskipun demikian radikal tokoferil harus dihilangkan. Setelah berinteraksi dengan radikal lipid (L•), tokoferol berubah menjadi radikal tokoferil (Toc•). Tokoferol dapat diregenerasi jika bereaksi dengan vitamin C. Setelah berinteraksi dengan radikal tokoferil, vitamin C kemudian
2 berubah menjadi bentuk radikal bebas
vitamin C. Glutation (GSH) membantu regenerasi vitamin C dan menjadi radikal thyil (GS•). (GS•) bereaksi menjadi Glutation oksidasi (GSSG) (Kontush et al., 1996)
Oleh karena itu pemberian buah merah dalam dosis yang lebih tinggi dapat meningkatkan kadar radikal tokoferil (Toc•) dalam darah. Jika tidak terdapat vitamin C dalam jumlah yang cukup untuk meregenerasi radikal tokoferil, maka jumlah radikal bebas akan kembali meningkat dan kemungkinan terjadi peroksidasi lipid kembali.
Dari hasil uji t-test antara sebelum dan sesudah perlakuan, terlihat bahwa pada kelompok plasebo yang tidak mendapat buah merah tetapi diberi beban aktivitas maksimal, terjadi peningkatan kadar MDA. Peningkatan kadar tersebut menunjukkan terjadinya stres oksidatif. Viitala et al. (2004), dalam penelitiannya melaporkan bahwa aktivitas fisik yang berat signifikan meningkatkan terjadinya peroksidasi lipid. Beberapa studi melaporkan bahwa aktivitas fisik maksimal yang sifatnya akut dapat meningkatkan peroksidasi lipid (Clarkson & Thompson, 2000; Alesio,1993). Cooper (2002), juga melaporkan bahwa kadar MDA pada plasma dan eritrosit meningkat pada latihan fisik akut. Stres oksidatif tidak terukur kecuali jika latihan fisik dilakukan dengan intensitas mendekati maksimal.
Dalam penelitian in vivo, yang termasuk penanda stres oksidatif adalah peroksidasi lipid, oksidasi protein dan kerusakan DNA serta antioksidan endogen termasuk asam askorbat, tokoferol, GSH, GSSH dan GSSG, ubiquinone, ubiquionol, cysteine, dan cystine (Liu, 2000). Dalam penelitian ini penanda stres oksidatif yang digunakan sebagai parameter adalah perubahan kadar MDA dalam darah. Karena darah mengandung antioksidan dan mudah diambil dari tubuh, sehingga pemeriksaan pada darah sering digunakan pada studi in vivo respon antioksidan pada stres oksidatif (Clarkson & Thompson, 2000). Beberapa studi yang menggunakan MDA sebagai penanda produksi radikal bebas karena latihan fisik menemukan hasil yang
bervariasi. Meskipun teknik
pemeriksaannya mudah untuk digunakan dan diinterpretasikan, menurut Clarkson & Thompson (2000), penggunaan MDA masih problematik untuk beberapa alasan. (1) aldehid selain MDA dapat bereaksi dengan asam tiobarbiturat untuk
menghasilkan komponen yang
mengabsorbsi dengan rentang yang sama dengan MDA; (2) dekomposisi lipid peroksida selama tes sendiri dapat menutupi kandungan MDA sebenarnya; (3) ada atau tidaknya ion logam atau radikal lain mempengaruhi laju dekomposisi lipid peroksida.
Respon sistem pertahanan antioksidan terhadap latihan fisik tergantung pada banyak faktor (Selman et al., 2002).
Radikal Lipid Tokoferol Radikal Vit C
L• Toc H Vit C• GSH
LH Radikal Tokoferil Vit C GS•
(Toc•)
GS•
GSSG Gambar 5. Regenerasi tokoferol (Kontush et al., 1996)
1 Faktor-faktor tersebut diantaranya adalah
durasi latihan, intensitas latihan, paparan latihan sebelumnya, umur subyek, dan teknik analisis yang digunakan Variabilitas hasil mungkin juga disebabkan oleh perbedaan model latihan yang digunakan, waktu pengambilan sampel, status latihan subyek (terlatih atau tidak), dan faktor lingkungan, misal ketinggian.
Kesimpulan
Dari Penelitian ini dapat disimpulkan bahwa minyak buah merah memiliki aktivitas antioksidan pada pengujian in vitro dengan nilai IC50 451,51 μg/ml. Pada pengujian in vivo, minyak buah merah dosis 0,15 ml/kgBB; 0,3 ml/kgBB dan 0,6 ml/kgBB dapat menurunkan kadar MDA dalam darah, tetapi minyak buah merah dosis 0,3 ml/kgBB menurunkan kadar MDA dalam darah lebih banyak dibandingkan dosis 0,15 ml/kgBB dan dosis 0,6 ml/kgBB.
Saran yang dapat disampaikan adalah perlunya dilakukan standarisasi bahan baku dan sediaan jadi minyak buah merah dengan menggunakan standar dan metode penetapan karakteristik mutu yang disesuaikan sehingga dapat memberikan jaminan perlindungan terhadap keamanan dan kesehatan masyarakat serta perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang keamanan pemberian antioksidan dalam dosis tinggi dan jangka waktu pemberian yang lama.
Ucapan terima kasih
Terima kasih kepada rekan-rekan di Bagian Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada dan di Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada atas ijin dan fasilitas yang diberikan selama berlangsungnya penelitian ini.
Daftar Pustaka
Allesio, H.M. 1993. Exercise-induced
Oxidative Stress. Med Sci Sports Exerc. 25:218-224.
Budi, M. dan Paimin, F.R. 2004. Buah Merah.
hal.3-26, 47-56, 67-68. Penebar
Swadaya. Jakarta.
Campbell, D.T., and Stanley, J.C. 1972. Experimental and Quasi-experimental Designs for Research. Rand Menally & Company, Chicago.
Clarkson, P.M., and Thompson, H.S. 2000. Antioxidants : What Role Do They Play in Physical Activity and Health. Am J Clin Nutr. 72:637-646.
Cooper, C.F., Vollaard, N.B.J., Choueri, and Wilson, M.T. 2002. Exercise, Free
Radicals and Oxidative Stress.
Biochem. J. 30:280-286
Gutteridge, J.M.C. 1995. Lipid Peroxidation and Antioxidants as Biomarkers of Tissue Damage. Clin Chem. 41(12): 1819-1828.
Janero, D.R. 1990. Malondialdehyde and
Thiobarbituric Acid Reactivityas
Diagnostic Indices of Lipid
Peroxidation Tissue Injury. Free Rad Biol Med. 9 : 515-540.
Kontush, A., Finckh, B., Karten, B.,
Kohlschutter, A., and Beisiegel, U. 1996. Antioxidant and Prooxidant Activity of α-tocopherol in Human Plasma and Low Density Lipoprotein. J Lipid Res. 37: 1436-1448
Liu, J., et al. 2000. Chronically and Acutely Exercised Rats: Biomarkers Oxidative Stress and Endogenous Antioxidant. J Appl Physiol. 89: 21-28
Metin, G., Atukeren, P., Gumustas, M.K., Belce, A., and Kayserilioglu, A. 2002. The Effect of Vitamin E Treatment on Oxidative Stress Generated in Trained Rats. Tohoku J. Exp. Med. 198(1):47-53.
Molyneux, P. 2004. The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrilhidrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. J. Sci. Technol. 26(2): 211-219
Murray, R.K., Granner, D., Mayes, P.A., and
Rodwell, V.W. 1996. Harper’s
2
156-157, 618-620, 730, 731, 750, 798, 816. Appleton & Lange.
Nakao, C., Ookawara, T., Kizaki, T., Oh-Ishi, S., Miyazaki, H., Haga, S., Sato, Y., Ji, Li., and Ohno, H. 2000. Effects of
Swimming Training on Three
Superoxide Dismutase Isoenzymes in Mouse Tissues. J Appl Physiol. 88: 649-654.
Pokorni,J.,Yanishlieva, N., and Gordon, M.
2001. Antioxidant in Food; Practical;
Applications. CRC Press, New York Selman, C., Mclaren, J.S., Collins, A.R., and
Speakman, J.R. 2002. Voluntary Exercise Has Only Limited Effect on Activity of Antioxidant Enzym and Does Not Cause Oxidative Damage in Small Mammal.J.Nutr. 132: 1784S-1786S.
Takaya, Y., Kondo, Y., Furukawa, T., and
Niwa, M. 2003. Antioxidant
Constituents of Redish Sprout (Kaiware-daikon), Raphanus sativus L. J.Agric.Food Chem. 51: 8061-8066 Viitala, P.E., Newhouse, I.J.,LaVoie, N., and
Gottardo, C. 2004. The Effect of Antioxidant Vitamin Supplementation on Exercise Induce Lipid Peroxidation in Trained and Untrained Participants. Lipid in Health and Disease. 3:14 Yagi, K. 1987. Lipid Peroxides and Human
diseases. Chemistry and Physic of Lipids. 45: 337-351.
Zao, Y., Lu, Y., and Wei, D. 2004. Antioxidant Activity of a Flavonoid-Rich Extract of Hypericum perforatum L. in vitro. J. Agric. Food Chem. 52:5032-39
