POTENSI ISOLAT LACTOBACILLUS DARI SALURAN PENCERNAAN AYAM SEBAGAI AGENSIA PROBIOTIK: TOLERANSI DAN KETAHANANNYA TERHADAP GARAM EMPEDU

POTENSI ISOLAT

LACTOBACILLUS

DARI SALURAN

PENCERNAAN AYAM SEBAGAI AGENSIA PROBIOTIK:

TOLERANSI DAN KETAHANANNYA TERHADAP

GARAM EMPEDU

(The Potency of

Lactobacillus

Isolated from Chickens Digestive Tracts as

Probiotics Agents: Its Tolerance and Resistance Towards Bile Salt)

ZAHIROTUL HIKMAH HASSAN

Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Kalimantan Selatan Jl. Panglima Batur Barat No. 4, Banjarbaru 70711

ABSTRACT

The objective of this research was to know the potency of Lactobacillus isolated from chickens digestive

tracts as probiotic agents. The research was conducted by inoculating the isolates of Lactobacillus in GYP

(glucose-yeast extract-peptone) liquid media, added with bile salt in various concentrations, 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0% (w/v), and the media without bile salt as the control. The isolates in this liquid media was inoculated in GYP agar media using pour plate method. Incubation was carried out at 37ºC for 24 hours. The test to know its tolerance towards bile salt was done by observing its growth, that was by measuring the OD (Optical Density) of the media after incubation. The production of lactic acid was known by measuring the pH of the growth media after incubation, and the volume of 0.1 N NaOH needed for titration the media. The resistance of the isolates towards bile salt was done by counting the amount of the colony which was inoculated on GYP

agar, before and after incubation, using total plate count (TPC) method. 9 isolates of Lactobacillus which

were isolated from chicken digestive tracts were tested. These 9 isolates consists of 4 isolates from caecum

were identified as Lactobacillus murinus, while 5 isolates from crop were identified as 1 isolate of

Lactobacillus acidophilus and 4 isolates of Lactobacillus murinus. All isolates can grow in the media

containing bile salt up to the concentration of 1.0%, but the result for the test of its resistance towards bile salt showed that the amount of the viable cell went into a decline after incubation for 24 hours. The decline of viable cell for isolate 6, 8, 9 was 1 log cycle, isolate 7 was 2 log cycle, while isolate 1-5 did not decline.

Key Words: Isolate, Lactobacillus, Probiotic, Digestion

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi isolat Lactobacillus yang diperoleh dari saluran

pencernaan ayam sebagai agensia probiotik. Penelitian dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat

Lactobacillus pada media cair GYP (glucose-yeast extract-peptone) yang ditambah garam empedu dengan

variasi konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0% (b/v). Sedangkan sebagai kontrol digunakan media GYP tanpa penambahan garam empedu. Kultur pada media cair ini kemudian diinokulasikan pada media GYP agar

dengan metode pour plate. Inkubasi dilakukan pada suhu 37ºC selama 24 jam. Toleransi isolat terhadap

garam empedu dilakukan dengan mengamati pertumbuhan isolat, yaitu dengan cara mengukur OD (Optical

Density) media pertumbuhan. Sedangkan produksi asam laktat diketahui dengan cara mengukur pH akhir

media pertumbuhan dan kebutuhan 0,1 N NaOH untuk titrasi media pertumbuhan tersebut. Ketahanan isolat terhadap garam empedu dilakukan dengan cara menghitung jumlah koloni isolat yang ditumbuhkan pada

media agar, pada jam ke-0 dan setelah 24 jam. Perhitungan koloni dilakukan dengan metode total plate count

(TPC). Dari organ pencernaan ayam kampung telah berhasil diisolasi 9 isolat Lactobacillus, yang dari hasil

identifikasi diketahui bahwa 4 isolat dari bagian caecum adalah L. urinus, serta 5 isolat dari bagian crop

terdiri dari 1 isolat L. cidophilus dan 4 isolat L. murinus. Dari pengujian toleransi isolat terhadap garam

empedu diperoleh hasil bahwa semua isolat mampu hidup hingga konsentrasi garam empedu 1,0%. Namun dari pengujian ketahanannya, ternyata sebagian isolat tidak tahan dengan adanya garam empedu. Hasil ini ditunjukkan dengan adanya penurunan jumlah sel hidup setelah inkubasi selama 24 jam. Isolat 6, 8, dan 9

mengalami penurunan jumlah sel hidup sebesar 1 siklus log, isolat 7 sebesar 2 siklus log dan isolat 1-5 tidak mengalami penurunan jumlah sel hidup.

Kata Kunci: Isolat, Lactobacillus, Probiotik, Pencernaan

PENDAHULUAN

Salah satu bahan pangan sumber protein hewani tinggi yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia adalah daging dan telur ayam. Namun demikian ternyata ayam merupakan salah satu hewan yang sangat peka terhadap infeksi, terutama infeksi saluran pencernaan. Banyak upaya telah dilakukan sehubungan dengan pencegahan infeksi tersebut, antara lain dengan pemberian antibiotika seperti kloramfenikol, klortetrasiklin, ampisilin, yang biasanya diberikan melalui campuran pakan maupun minum. Namun kini penggunaan antibiotika pada ternak termasuk ayam, banyak mendapat larangan akibat efek berbahaya yang ditimbulkannya. Tidak hanya bagi ternak yang bersangkutan tapi juga bagi manusia yang mengkonsumsinya, karena terdapatnya akumulasi residu antibiotika tersebut dalam daging maupun telur.

Pemberian pakan yang seimbang, yaitu pakan yang memenuhi semua kebutuhan senyawa bagi ayam, merupakan salah satu cara yang tepat untuk mengusahakan agar ayam selalu berada dalam kondisi yang sehat. Pakan yang seimbang ini dapat dipenuhi dengan menambahkan probiotik pada pakan ayam. Salah satu sumber probiotik yang paling efektif untuk digunakan adalah bakteri asam laktat (HADDADIN et al., 1996).

FULLER (1989) mendefinisikan probiotik sebagai suplemen makanan yang mengandung mikrobia hidup yang memiliki efek yang menguntungkan bagi host dengan cara memperbaiki keseimbangan mikrobia. Sedang definisi probiotik yang lazim digunakan adalah kultur tunggal maupun campuran dari mikrobia hidup yang dikonsumsi manusia maupun hewan, dan memiliki efek menguntungkan bagi host (manusia dan hewan) dengan cara menjaga keseimbangan mikroflora alami yang ada dalam tubuh (HAVENAAR et al., 1992).

Bakteri asam laktat yang digunakan sebagai agensia probiotik harus tetap hidup selama melewati saluran pencernaan, sebab efek probiotik yang ditimbulkan berasal dari

senyawa-senyawa hasil aktivitas metabolik yang dilakukannya. Meskipun belum diketahui dengan pasti mekanisme yang berkaitan dengan keberadaan mikroflora dalam saluran pencernaan ayam, namun faktor-faktor yang mempengaruhinya antara lain pakan, umur dan kondisi kimia dan fisik lingkungan pencernaan (kecepatan pencernaan dalam perut, pH dan potensial reduksi-oksidasi (Eh)) (CUNNINGHAM, 1987; HADDADIN et al., 1996).

Keberadaan bakteri dalam saluran pencernaan ayam antara lain disebabkan karena adanya interaksi bakteri dari lingkungan sekitar yang mengkontaminasi tubuh ayam melalui pakan. Perbedaan umur ayam juga akan memberikan pengaruh pada perbedaan jenis bakteri yang ada. Hasil penelitian BABA

et al. (1991) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan komposisi populasi bakteri yang ada pada ayam berumur 2 hari dan ayam dewasa, yaitu adanya dominasi bakteri lactobacilli pada ayam dewasa. Pada ayam, kecepatan pencernaan terbesar terdapat pada bagian anterior usus halus. Sebagian besar organ pencernaan ayam bersifat asam, dengan pH berkisar antara 3-4, dan mengandung garam empedu, sehingga mikrobia yang digunakan sebagai probiotik harus tahan terhadap kondisi asam dan garam empedu. Potensial reduksi-oksidasi akan berpengaruh pada ketersediaan oksigen, sehingga akan turut menentukan jenis bakteri yang mampu hidup, jenis aerob ataupun anaerob (DRASAR danBARROW, 1985).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi isolat Lactobacillus yang diperoleh dari saluran pencernaan ayam sebagai agensia probiotik, yaitu toleransi dan ketahanannya terhadap garam empedu.

MATERI DAN METODE Sumber isolat

Isolat yang diuji dalam penelitian ini adalah isolat bakteri asam laktat Lactobacillus yang berhasil diisolasi dari organ pencernaan ayam, dari jenis ayam kampung, sehat, usia ± 8 bulan,

yang diambil dari Fakultas Peternakan UGM Yogyakarta. Sebanyak 9 isolat Lactobacillus berhasil diisolasi, yang dari hasil identifikasi diketahui bahwa 4 isolat (1,2,3,4) dari caecum adalah Lactobacillus murinus, sedang 5 isolat dari crop terdiri dari 1 isolat Lactobacillus acidophilus (5) dan 4 isolat Lactobacillus murinus (6, 7, 8, 9).

Komposisi media pertumbuhan

Media yang digunakan adalah media GYP (glucose-yeast extract-peptone) dengan komposisi: glukosa 1%(b/v), yeast ekstrak 1%(b/v), peptone 0,5%(b/v), Na-asetat 0,2%(b/v), natrium azida 10 ppm (b/v), larutan garam/salt solution 0,5%(v/v), Tween 80 1%(v/v).

Pengujian toleransi isolat terhadap garam empedu

Untuk mengetahui toleransi isolat terhadap garam empedu, dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat pada media cair GYP dengan variasi konsentrasi garam empedu, yaitu 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0%(b/v). Sedangkan sebagai kontrol, isolat ditumbuhkan pada media GYP tanpa penambahan garam empedu. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 24 jam. Penentuan toleransi isolat terhadap garam empedu dilakukan dengan mengamati pertumbuhan isolat, yang dapat diketahui dari kekeruhan media dengan cara mengukur OD (Optical Density) media pertumbuhan pada λ = 660 nm. Sedangkan produksi asam laktat diketahui dengan cara mengukur pH akhir media pertumbuhan dan kebutuhan 0,1 N NaOH untuk titrasi media pertumbuhan, setelah 24 jam.

Pengujian ketahanan isolat terhadap garam empedu

Untuk megetahui ketahanan isolat terhadap garam empedu dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat pada media GYP agar. Ketahanan isolat diketahui dengan cara menghitung jumlah koloni isolat yang hidup pada konsentrasi garam empedu 0,2 dan 1,0%, pada jam ke-0 dan setelah 24 jam. Perhitungan

koloni dilakukan dengan metode total plate count (TPC).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Untuk dapat digunakan sebagai agensia probiotik untuk ayam, isolat bakteri asam laktat yang telah berhasil diisolasi harus diuji kemampuannya, antara lain ketahanan terhadap garam empedu (ARIHARA et al., 1998;

GILLILAND et al., 1984; KLAVER dan MEER, 1993), ketahanan terhadap kondisi asam (ARIHARA et al., 1998; HOOD dan ZOTTOLA,

1988), kemampuan menghambat bakteri patogen (RAHAYU et al., 1996), daya tahan

terhadap antibiotik, kemampuan menghambat absorbsi dan sintesa kolesterol (BUCK DAN

GILLILAND, 1994), serta kemampuan menempel

pada sel epitel dinding saluran pencernaan (HOOD dan ZOTTOLA, 1987; HOOD dan ZOTTOLA, 1988).

Pada penelitian ini telah dilakukan pengujian toleransi dan ketahanan 9 isolat Lactobacillus yang berhasil diisolasi dari organ saluran pencernaan ayam terhadap garam empedu. Uji toleransi dan ketahahan terhadap garam empedu perlu dilakukan mengingat isolat Lactobacillus yang akan digunakan sebagai agensia probiotik akan dicampurkan dalam pakan yang nantinya akan melewati saluran pencernaan ayam. Sedangkan pada organ-organ tersebut terkandung garam empedu. Sehingga diharapkan isolat masih tetap dapat hidup dan mampu memberikan efek probiotiknya. Pada uji toleransi akan dapat diketahui sampai pada konsentrasi berapa isolat masih mampu tumbuh. Sedangkan pada uji ketahanan akan dapat diketahui sampai berapa lama isolat mampu hidup pada kondisi dengan konsentrasi garam empedu tertentu. Untuk dapat digunakan sebagai probiotik, suatu isolat harus mampu hidup pada kondisi dengan konsentrasi garam empedu sebesar 0,1% pada pH netral (GOHRAN, 1994).

Diharapkan isolat yang berpotensi sebagai probiotik dapat digunakan pada pakan ayam.

Gambar 1 menunjukkan bahwa isolat 1,2, dan 3 relatif lebih toleran terhadap garam empedu dibanding isolat-isolat yang lain. Seiring dengan kenaikan konsentrasi garam empedu sampai 0,4% pertumbuhan isolat mengalami penurunan. Pada konsentrasi garam

empedu sebesar 0,4% pertumbuhan isolat paling kecil. Sedangkan pada konsentrasi yang lebih besar lagi yaitu 0,6; 0,8; dan 1,0% pertumbuhannya naik kembali meskipun kenaikannya sangat kecil, bahkan dapat dikatakan hampir sama dengan pada media dengan konsentrasi 0,4%. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa isolat Lactobacillus yang diuji hanya mampu memiliki toleransi terhadap garam empedu sampai pada konsentrasi 0,4%.

Gambar 2 menunjukkan pH akhir media, yaitu pH media setelah inokulasi isolat selama 24 jam. Penurunan pH ini menunjukkan jumlah produksi asam laktat oleh isolat. Isolat 1,2, dan 3 mengalami penurunan pH yang relatif lebih besar bila dibanding isolat-isolat yang lain. Hal

ini kemungkinan disebabkan karena pertumbuhan isolat 1,2, dan 3 relatif lebih tinggi dari isolat-isolat lain, sehingga jumlah produksi asam laktat yang dihasilkan juga lebih besar. Isolat dengan tingkat pertumbuhan yang sama namun berbeda dalam hal penurunan pH media mengindikasikan adanya perbedaan dalam hal kemampuan memproduksi asam laktat. Ini dapat dilihat pada isolat 6 dan 7, pada media dengan konsentrasi garam empedu sebesar 0,4%. Pertumbuhan kedua isolat pada konsentrasi ini hampir sama, namun pH akhir media pada isolat 6 lebih rendah daripada isolat 7. Ini berarti bahwa kemampuan memproduksi asam laktat isolat 6 lebih besar daripada isolat 7.

Gambar 1. Pertumbuhan isolat pada media GYP cair dengan berbagai konsentrasi garam empedu pada jam ke-24

Gambar 2. pH media pertumbuhan setelah inokulasi isolat selama 24 jam 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 [0] [0,2] [0,4] [0,6] [0,8] [1,0] [garam empedu] K enai kan O D Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3 Isolat 4 Isolat 5 Isolat 6 Isolat 7 Isolat 8 Isolat 9 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 [0] [0,2] [0,4] [0,6] [0,8] [1,0] [garam empedu] pH Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3 Isolat 4 Isolat 5 Isolat 6 Isolat 7 Isolat 8 Isolat 9

Gambar 3. Volume 0,1 N NaOH untuk titrasi media pertumbuhan setelah 24 jam

Tabel 1. Jumlah mikrobia hidup pada uji ketahanan terhadap garam empedu Jumlah koloni (cfu/ml)

Sumber Kode Isolat _Awal (jam ke-0) [garam empedu]= 0,2% (jam ke-24) [garam empedu] = 1,0% (jam ke-24) Caecum 1 2 3 4 3,3.106 7,9.106 2,4.106 4,7.106 1,3.106 1,3.106 1,2.106 8,9.105 2,9.106 2,5.106 5,6.106 1,0.107 5 1,5.106 _4,3.103 _6,5.106 Crop 6 7 8 9 1,6.106 1,7.106 1,2.106 9,4.106 1,1.104 1,4.105 2,7.104 1,4.104 2,2.105 6,3.104 2,0.105 5,2.105

Gambar 3 menunjukkan volume 0,1 N NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi media pertumbuhan setelah inokulasi isolat selama 24 jam. Pengujian ini juga digunakan untuk mengetahui produksi asam laktat oleh isolat. Perbedaannya adalah bahwa pH akhir media berbanding terbalik dengan pertumbuhan isolat, sedang volume 0,1 N NaOH berbanding lurus dengan pertumbuhan isolat.

Untuk mengetahui ketahanan isolat terhadap garam empedu, dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat dari media cair pada jam ke-0 dan jam-24 ke media agar, dengan cara spread plate, kemudian dilakukan penghitungan jumlah koloni hidup dengan

metode total plate count (TPC). Kultur yang dipilih adalah kultur pada konsentrasi garam empedu terendah dan tertinggi, yaitu 0,2% dan 1,0%. Hasil penghitungan jumlah koloni hidup dapat dilihat pada Tabel 1. Dari penghitungan jumlah koloni hidup diperoleh hasil bahwa ternyata sebagian isolat mengalami penurunan jumlah sel hidup setelah inkubasi selama 24 jam. Pada media dengan konsentrasi garam empedu sebesar 0,2%, isolat 4 dan 7 mengalami penurunan jumlah sel hidup sebesar 1 siklus log, isolat 6,8, dan 9 sebesar 2 siklus log, isolat 5 sebesar 3 silus log, sedang isolat 1-3 tidak mengalami penurunan jumlah sel hidup. Sedang pada media dengan konsentrasi

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 [0] [0,2] [0,4] [0,6] [0,8] [1,0] [garam empedu] V ol um e 0. 1 N N aO H ( m l) Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3 Isolat 4 Isolat 5 Isolat 6 Isolat 7 Isolat 8 Isolat 9

garam empedu sebesar 1,0%, isolat 6,8, dan 9 mengalami penurunan jumlah sel hidup sebesar 1 siklus log, isolat 7 sebesar 2 siklus log dan isolat 1−5 tidak mengalami penurunan jumlah sel hidup.

Terlihat bahwa ada pertumbuhan bakteri pada pengujian toleransi isolat terhadap garam empedu, tapi mengalami penurunan jumlah sel hidup pada pengujian ketahanan. Hal ini mungkin disebabkan karena bakteri-bakteri tersebut hanya mampu hidup dalam beberapa jam, dan setelah itu mengalami kematian. Isolat 1, 2 dan 3 relatif lebih stabil dan tahan terhadap garam empedu dibanding isolat-isolat yang lain. Penambahan kultur Lactobacillus acidophilus sebagai agensia probiotik pada pakan ayam yang paling efektif adalah pada konsentrasi 106 _{cfu/g diet (J}

IN et al., 1998).

KESIMPULAN

Dari sembilan isolat Lactobacillus yang berhasil diisolasi dari organ pencernaan ayam dan diuji toleransi dan ketahanannya terhadap garam empedu, ternyata isolat 1,2,3 relatif paling tahan. Ketiga isolat itu adalah Lactobacillus murinus yang berasal dari organ cecum.

DAFTAR PUSTAKA

ARIHARA, K., H. OTA, M. ITOH, Y. KONDO, T.

SAMESHIMA,H.YAMANAKA,M.AKIMATO,S.

KANAI and T. MIKI. 1998. Lactobacillus

acidophilus group lactic acid bacteria applied

to meat fermentation. J. Food Sci. 63:

544−547.

BABA, E., S. NAGAISHI, T. FUKATA and A. ARAKAWA. 1991. The role of intestinal on the

prevention of Salmonella colonization in

gnotobiotic chickens. Poult. Sci. 70:

1902−1907.

BUCK,L.M.andS.E.GILLILAND. 1994. Comparison

of freshly isolated strain of Lactobacillus

acidophilus of human intestine origin for

ability to assimilate cholesterol during growth. J. Dairy Sci. 77: 2925−2933.

CUNNINGHAM, F.E. and N.A. COX. 1987. The

Microbiology of Poultry Meat Products. Academic Press Inc, San Diego, California. DRASAR, B.S. and P.A. BARROW. 1985. Intestinal

Microbiology. American Society for Microbiol.

FULLER,R. 1989. Probiotic in man and animals. J.

Applied Bacteriol. 66: 365−378.

GILLILAND,S.E.,T.E.STALEY andL.J.BUSH. 1984.

Important of bile tolerance of Lactobacillus

acidophilus used as a dietary adjunct. J. Dairy

Sci. 67: 3045−3051.

GOHRAN,M. 1994. Lactobacillus with the ability of

colonization and establishing in the intestinal tracts. Japan Patent. 6−501624.

HADDADIN, M.S.Y., S.M. ABDULRAHIM, E.A.R. HASHLAMOUN and R.K.ROBINSON. 1996. The

effect of Lactobacillus acidophilus on the

production and chemical composition on hen’s eggs. Poult. Sci. 75: 491−494.

HAVENAAR, R., B.T. BRINK and J.H.J. HUIS IN’T

VELD. 1992. Selection of Strains for

Probiotics Use. In: Probiotics the Scientific

Bases. R. FULLER (Ed). Chapman & Hall,

London. pp. 209−224.

HOOD, S.K. and E.A. ZOTTOLA. 1987. Election

microscopic study of the adherence properties of Lactobacillus acidophilus. J. Food Sci. 52: 792−805.

HOOD,S.K.andE.A.ZOTTOLA. 1988. Effect of low

pH on the ability Lactobacillus acidophilus to

survive and adhere to human intestinal cells. J.

Food Sci. 53: 1514−1516.

JIN,L.Z.,Y.W.HO,N.ABDULLAH andS.JALALUDIN.

1998. Probiotic in poultry: modes of action. World’s Poult. Sci. J. 53: 351−368.

KLAVER,F.A.M.andREOLOF VAR DER MEER. 1993.

The assumed assimilation of cholesterol by

Lactobacillus and Bifidobacterium Bifidum is

due to their bile salt-deconjugating activity. App. Environ. Microbiol. 59: 1120−1124. RAHAYU, E.S., T.F. DJAFAAR, D. WIBOWO and S.

SUDARMADJI. 1996. Lactic acid bacteria from

indigenous fermented foods an their

antimicrobial activity. J. Indones. Food and