UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA
TETRAHIDROHEKSAGAMAVUNON-5(THHGV-5)
Putri Kharisma Novita Sari
1,*, Ritmaleni
2, dan Sardjiman
21Bagian Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,Indonesia 2Bagian Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia
email: ritmaleni@ugm.ac.id
ABSTRAK
Heksagamavunon-5 (HGV-5) merupakan salah satu senyawa analog kurkumin. HGV-5 memiliki aktivitas sebagai antioksidan sama halnya dengan kurkumin. Senyawa analog kurkumin telah banyak disintesis untuk mendapatkan aktivitas biologis yang lebih poten. Salah satunya sintesis THHGV-5 dari senyawa HGV-5 melalui reaksi hidrogenasi. Hidrogenasi HGV-5 menjadi THHGV-5 diprediksi dapat meningkatkan aktivitas biologisnya. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari efek antioksidan THHGV-5 dibandingkan dengan HGV-5 secara in vitro.
Penelitian dilakukan dengan metode uji daya tangkap radikal DPPH serta daya reduksi terhadap ion feri secara spektroskopi dengan pembanding Vitamin E. Data absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan persen (%) aktivitas antioksidan pada metode DPPH dan data persen (%) FRAP pada metode reduksi ion feri. Kedua data tersebut selanjutnya digunakan untuk mendapatkan nilai IC50.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa THHGV-5 konsentrasi rendah sudah mampu memberikan aktivitas penangkapan radikal DPPH dan mampu mereduksi ion feri (5 mM). Besarnya aktivitas antioksidan yang diberikan berkorelasi positif dengan meningkatnya konsentrasi senyawa, semakin tinggi konsentrasi, semakin besar aktivitas yang diberikan. THHGV-5 mempunyai efikasi dan potensi paling tinggi dibandingkan HGV-5 dan vitamin E dengan nilai IC50 THHGV-5 sebesar 68,95 µM, HGV-5 sebesar 150,44 µM dan Vitamin E
sebesar 226,80 µM pada metode DPPH, serta nilai IC50 THHGV-5 sebesar 11,67 µM, HGV-5
sebesar 17,66 µM dan Vitamin E sebesar 35,21 µM pada metode ion feri.
Kata Kunci: tetrahidroheksagamavunon-5, antioksidan, DPPH, ion feri.
PENDAHULUAN
Saat ini pencarian obat baru yang berkhasiat sebagi antioksidan banyak dilakukan. Hal ini dikarenakan senyawa
antioksidan memiliki banyak fungsi bagi tubuh, diantaranya melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan spesies oksigen reaktif, menghambat
SEMINAR NASIONAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA VII
“Penguatan Profesi Bidang Kimia dan Pendidikan Kimia
Melalui Riset dan Evaluasi”
Program Studi Pendidikan Kimia Jurusan P.MIPA FKIP UNS
Surakarta, 18 April 2015
MAKALAH
terjadinya penyakit degeneratif serta menghambat peroksidase lipid pada makanan [8].
Salah satu senyawa yang telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan adalah kurkumin [7]. Kurkumin merupakan salah satu senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam Curcuma longa L. [2]. Namun dalam pemanfaatannya, kurkumin masih memiliki beberapa kelemahan, diantaranya sukar larut dalam air sehingga menyebabkan kurkumin memiliki bioavailabilitas yang rendah dan membutuhkan dosis yang besar dalam aplikasinya [5,3]. Beberapa peneliti telah berhasil mensintesis senyawa hasil modifikasi struktur kurkumin untuk memperbaiki kelemahan tersebut.
Heksagamavunon-5 (HGV-5) merupakan salah satu senyawa analog kurkumin yang telah berhasil disintesis oleh Sardjiman dan terbukti memiliki aktivitas sebagai antioksidan sama halnya dengan kurkumin [6]. Senyawa analog lain telah banyak disintesis untuk mendapatkan aktivitas biologis yang lebih poten. Salah satunya sintesis THHGV-5 dari senyawa HGV-5 melalui reaksi hidrogenasi [10]. Hidrogenasi HGV-5 menjadi THHGV-5 diprediksi dapat meningkatkan aktivitas biologisnya, khususnya aktivitas sebagai antioksidan.
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari efek antioksidan THHGV-5 dibandingkan dengan HGV-5 secara in vitro.
METODE PENELITIAN
Bahan: HGV-5, THHGV-5 (Fakultas Farmasi UGM), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) (Aldrich, USA), dan vitamin E (Aldrich, USA), metanol absolut p.a (Merck, Germany), o-fenantrolin (Merck, Germany), FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, akuades.
Alat: Neraca analitik kepekaan 0,0001 gram (Mettler Toledo AB204-S, Switzerland), Spektrofotometer UV/VIS (Spectronic 10 GenesysTM, USA), kuvet,
vortex (Thermo Scientific, China), mikropipet.
Jalannya Penelitian
Penelitian dilakukan dengan metode uji daya tangkap radikal DPPH [4] serta daya reduksi terhadap ion feri [1] secara spektroskopi dengan pembanding Vitamin E.
Uji antioksidan metode daya tangkap radikal DPPH
Pembuatan Larutan Senyawa Uji dan Kontrol
Dibuat larutan THHGV-5 seri kadar 5, 10, 50, 75, dan 100 µM Dibuat seri kadar larutan HGV-5 sebesar 10, 50, 75, 100, dan 150 µM.
Dibuat larutan vitamin E seri kadar 100, 150, 200, 250, dan 300 µM.
Dibuat larutan DPPH kadar 0,4 mM. Menentukan Waktu Operasi (OT)
Diambil 500 µL larutan senyawa uji salah satu kadar ditambahkan dengan 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM kemudian ditambahkan metanol absolut sampai volume tepat 5,0 mL. Campuran kemudian divortex dan dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada 517 nm selama 1 jam untuk mendapatkan kurva absorbansi yang stabil. Daerah yang stabil ditetapkan sebagai OT.
Menentukan Panjang Gelombang ( ) Maksimal
Diukur berdasarkan panjang gelombang maksimal DPPH. 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM itambahkan metanol absolut sampai volume tepat 5,0 mL kemudian dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer dengan rentang panjang gelombang 400-600 nm.
Pengukuran Absorbansi Larutan Uji dan Kontrol
Diambil 500 µL larutan sampel (THHGV-5, HGV-5, dan Vitamin E), ditambahkan dengan 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM kemudian ditambahkan metanol absolut sampai volume tepat 5,0 mL. Campuran kemudian divortex dan dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada dan OT maksimum. Dilakukan tiga kali replikasi.
Uji antioksidan metode daya reduksi terhadap ion feri
Penyiapan Larutan Uji
Dibuat larutan THHGV-5 seri kadar 5, 10, 15, 20 dan 25 µM.
Dibuat larutan HGV-5 seri kadar: 5, 10, 25, 40 dan 50 µM.
Dibuat larutan vitamin E seri kadar: 5, 10, 50, 75, dan 100 µM.
Dibuat larutan o-fenantrolin 0,05% Dibuat larutanFeCl3.6H2O1200 µM. Dibuat larutanFeSO4.7H2O 1200 µM.
Menentukan waktu operasi (OT)
Diambil 1,0 mL larutan uji salah satu kadar, ditambahkan 0,5 mL 1,10-fenantrolin 0,05%, ditambahkan 1 mL FeCl3.6H2O 1200 µM.
dicampur homogen (divorteks), dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada λ 510 nm selama 1 jam untuk mendapatkan kurva absorbansi yang stabil. Daerah yang stabil ditetapkan sebagai OT.
Menentukan panjang gelombang (λ) maksimum
Diambil 1,0 mL larutan FeSO4.7H2O 1200
µM ditambahkan 0,5 mL 1,10-fenantrolin 0,05%, ditambahkan 1 mL metanol absolut dicampur homogen (divorteks), discan absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer dengan rentang panjang gelombang 480-580 nm.
Pengukuran absorbansi larutan uji dan kontrol
Diambil 1,0 mL larutan uji (HGV-5, THHGV-5, vitamin E) pada beberapa seri konsentrasi, ditambahkan 0,5 mL 1,10-fenantrolin 0,05%, ditambahkan 1 mL FeCl3.6H2O 1200 µM dicampur homogen
(divorteks), dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer terhadap blanko pada daerah OT dan λ maksimum. Dilakukan tiga kali replikasi. Larutan blanko terdiri dari 1,0 mL metanol absolut, 1,10-fenantrolin 0,05%, 1 mL FeCl3.6H2O 1200
µM dan dicampur homogen. Analisis Hasil
Data yang diperoleh dari uji kuantitatif aktivitas antioksidan dengan metode DPPH adalah persen (%) penangkapan radikal bebas DPPH. Besarnya persen (%) aktivitas penangkapan radikal bebas digunakan rumus :
Konsentrasi dalam sistem vs data (%) penangkapan radikal DPPH tersebut kemudian di analisis dengan regresi linier untuk menentukan nilai IC50.
Data yang diperoleh dari uji kuantitatif aktivitas antioksidan dengan metode daya reduksi ion feri adalah absorbansi sebagai nilai FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). Kemudian dihitung persen (%) FRAP dengan membandingkan nilai FRAP senyawa dengan nilai FRAP FeSO4 1200 µM yang
dianggap sebagai nilai 100% FRAP.
% FRAP= nilai FRAP senyawa nilai FRAP FeSO4 1200µM
×100%
Konsentrasi dalam sistem vs data (%) FRAP tersebut kemudian di analisis dengan regresi linier untuk menentukan nilai IC50.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji daya tangkap radikal DPPH
Senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan yang poten, akan memudarkan warna DPPH secara maksimal, dibuktikan
dengan rendahnya absorbansi DPPH yang terukur.
Pengukuran absorbansai dilakukan pada DPPH yakni 514,5 nm dan pada saat operating time, untuk mendapatkan hasil pengukuran yang stabil. Operating time yang diperoleh adalah berbeda tiap
senyawa yakni HGV-5 selama 25 menit, THHGV-5 selama 26 menit, dan vitamin E selama 20 menit.
Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan data persen (%) aktivitas antioksidan seperti pada tabel 1.
Berdasarkan data tersebut, THHGV-5 dan HGV-5 konsentrasi rendah sudah mampu memberikan aktivitas penangkapan radikal DPPH (5 dan 10 mM). Besarnya aktivitas antioksidan yang diberikan berkorelasi positif dengan meningkatnya konsentrasi senyawa, semakin tinggi konsentrasi, semakin besar aktivitas yang diberikan. THHGV-5 mempunyai efikasi dan potensi paling tinggi dibandingkan HGV-5 dan vitamin E dengan nilai IC50 THHGV-5
sebesar 68,95 µM, HGV-5 sebesar 150,44 µM dan Vitamin E sebesar 226,80 µM (p<0,05).
THHGV-5 memiliki aktivitas antioksidan (menangkap radikal DPPH) yang lebih baik dari HGV-5 dikarenakan tidak adanya ikatan rangkap konjugasi yang menjadikannya lebih reaktif. THHGV-5 juga memiliki jumlah gugus hidroksi yang lebih banyak disertai dengan subtituen berupa gugus pendorong elektron yakni dua gugus
metoksi yang menyebabkan
meningatkatnya densitas elektron pada gugus hidroksi sehingga mampu memberikan aktivitas yang lebih baik dari vitamin E [11].
Uji daya resuksi ion feri
Senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan yang poten, akan membentuk senyawa kompleks dengan intensitas warna merah yang kuat, dibuktikan dengan tingginya absorbansi senyawa kompleks yang terukur. Hal ini dikarenakan semakin banyak terbentuknya ion fero yang berhasil direduksi oleh senyawa uji dan membentuk kompleks dengan ortofenantrolin.
Kadar THHGV-5
Absorbansi (n=3)
% Antioksidan-SD Persamaan Regresi Linier
5 0,678 2,96±0,41 y = 0,717x + 0,583 R² = 0,992 IC50 = 68,95µM 10 0,646 7,49±0,38 50 0,438 37,33±0,97 75 0,293 58,09±0,58 100 0,216 69,12±0,65 Kadar HGV-5 Absorbansi (n=3)
% Antioksidan-SD Persamaan regresi linier
10 0,683 2,20±0,66 y = 0,343x - 1,663 R² = 0,998 IC50 =150,44µM 50 0,587 15,89±0,22 75 0,540 22,67±1,12 100 0,468 32,98±0,86 150 0,347 50,31±1,79 Kadar THHGV-7 HGV-7 Absorbansi (n=3) % Antioksidan-SD Absorbansi (n=3) % Antioksidan -SD 100 0,654 8,27±0,40 0,606 15,05±0,74 150 0,656 8,04±0,72 0,605 15,10±0,49 200 0,652 8,60±0,57 0,595 16,50±0,21 250 0,653 8,42±0,69 0,562 21,13±0,49 300 0,648 9,12±0,16 0,549 23,05±0,08 68.95 150.44 226.80 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 THHGV-5 HGV-5 Vitamin E IC50THHGV-5, HGV-5, VITAMIN E
Pengukuran absorbansai dilakukan pada kompleks fero-fenantrolin yakni 509 nm dan pada saat operating time yakni 1 jam dengan tujuan untuk mendapatkan hasil pengukuran yang stabil.
Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan data persen (%) aktivitas antioksidan seperti pada tabel 2.
Tabel 2. Daya reduksi HGV-5, THHGV-5, dan Vitamin E terhadap ion feri.
Kadar THHGV-5 Kadar HGV-5 FRAP (n=3) % FRAP±SD FRAP (n=3) % FRAP±SD 5 0,259 18,71±1,44 5 0,285 20,59±0,75 10 0,427 30,85±0,38 10 0,375 27,12±2,90 15 0,524 37,89±2,49 25 0,594 42,89±0,55 20 0,607 43,88±5,48 40 0,727 52,53±0,65 25 0,884 63,87±0,56 50 0,892 64,47±2,86
Persamaan Regresi Linier y = 2,067x + 8,037
R² = 0,952 IC50 = 20,30µM
Persamaan Regresi Linier y = 0,934x + 17,22 R² = 0,990 IC50 = 35,10µM Kadar THHGV-7 Kadar HGV-7 FRAP (n=3) % FRAP±SD FRAP (n=3) % FRAP±SD 100 0,240 17,37±0,33 100 0,223 16,11±1,97 200 0,267 19,27±0,68 200 0,217 15,66±1,05 400 0,440 31,79±9,87 400 0,215 15,53±0,51 600 0,609 44,03±1,67 600 0,227 16,40±0,55 800 0,690 49,86±1,04 800 0,242 17,49±1,01 1000 0,689 49,78±0,95 1000 0,250 18,06±0,75 Kadar THC7 Kadar Vitamin E FRAP (n=3) % FRAP±SD FRAP (n=3) % FRAP±SD 100 0,235 17,37±1,21 100 0,247 17,85±0,64 200 0,278 19,27±0,36 150 0,258 18,67±0,11 400 0,424 31,79±4,62 200 0,496 35,84±0,19 600 0,513 44,03±3,67 250 0,693 50,10±0,27 800 0,725 49,86±2,15 300 0,844 60,96±0,48 1000 0,775 49,78±2,73 Persamaan Regresi Linier
y = 0,463x + 14,44 R² = 0,996 IC50 = 76,80µM
Data yang diperoleh mendukung data hasil metode DPPH, yakni pada konsentrasi rendah THHGV-5 dan HGV-5 sudah mampu mereduksi ion feri menjadi ion fero (5 dan 10 mM). Besarnya kemampuan mereduksi berkorelasi positif dengan meningkatnya konsentrasi senyawa, semakin tinggi konsentrasi, semakin besar kemampuan yang diberikan. Dari nilai IC50
yang dimiliki masing-masing senyawa, THHGV-5 mempunyai efikasi dan potensi paling tinggi dibandingkan HGV-5 dan vitamin E yakni dengan nilai IC50 THHGV-5 sebesar 20,37 µM,
HGV-5 sebesar 35,12 µM dan Vitamin E sebesar 76,85 µM pada metode ion feri (p<0,05).
THHGV-5 memiliki dan kemampuan mereduksi yang lebih baik dari HGV-5 dikarenakan tidak adanya ikatan rangkap konjugasi yang menyebabkan efek resonansi karbonil berkurang dan menjadikannya lebih nonpolar, sehingga kelimpahan elektron di gugus fenolik meningkat dan menyebabkan meningkatnya pula kemungkinan untuk mendonorkan elektronnya [9].
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, diperoleh kesimpulan bahwa THHGV-5 memiliki daya tangkap terhadap radikal DPPH
dan daya reduksi terhadap ion feri yang lebih baik dari HGV-5 dan vitamin E.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih diucapkan kepada Penelitian Hibah Multidisiplin DIKTI 2012-2014 yang telah mendanai penelitian ini.
DAFTAR RUJUKAN
[1] Benzie, I.F.F., and Strain J.J., 1996, The ferric reducing ability of plasma as a measure of “antioxidant power” The FRAP assay, Analitycal Biochemitical, 239, 70-76. [2] Goel, A., Kunnumakkara A.B., Aggarwal
B.B., 2008, Curcumin as "Curecumin": from kitchen to clinic, Biochem Pharmacol, 75, 787-809.
[3] Jurenka, J.S., 2009, Anti-inflammatory Properties of Curcumin, a Major Constituentof Curcuma longa: A Review of Preclinical and Clinical Research, Alternative Med. Review, 14 (2), 141-153.
[4] Molyneux, P., 2004, The Use of Stable Free Radikal Diphenilpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, J. Sci. Technol., 26 (2), 211-219.
[5] Ravindranath, V., & Chandrasekhara, N., 1982, Metabolism of Curcumin studies with [3H] Curcumin, Toxicology, 22, 337-344. [6] Sardjiman, 2000, Syntesis of Some New
Series of Curcumin Analouge, Antioxidative, Antiinflammatory, Antibacterial Activities, Qualitative Structure-Activity Relationship, Disertation, Gadjah Mada University, Yogyakarta. 20.37 35.12 76.85 0.00 50.00 100.00 THHGV-5 HGV-5 Vitamin E IC50THHGV-5, HGV-5, VITAMIN E
[7] Sharma, O.P., 1976, Antioxidant activity of curcumin and related compounds, Biochem Pharmacol, 25,1811-1812.
[8] Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa kecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, Jurnal Farmasi Indonesia, 2 (2), 53-61
[9] Utama, D.G.A., 2012, Uji Daya Tangkap Radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil dan Daya
Reduksi Senyawa
Tetrahidropentagamavunon-1 (THPGV-1), Skripsi, Faklutas
[10] Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
[11] Wibowo, H., 2013, Sintesis Tetrahidroheksagamavunon-5 dari Starting Material Heksangamavunon-5 dengan Katalis Paladium Karbon melalui Reaksi Hidrogenasi, Skripsi, Faklutas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. [12] Wuryantoko, J., Supardjan, A.M., 1997,
Daya Reduksi Kurkumin dan Turunannya (4-alkil-kurkumin) terhadap Ion Feri yang diuji dengan Metode Ortho-fenantrolin Kompleks, Majalah Farmasi Indonesia, 8 (4), 171-178.
TANYA JAWAB PENANYA : -
