Pengaruh Senyawa Prebiotik Dari Bawang Mearah (Allium cepa) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Probiotik. Idha Kusumawati, Noor Cholies Zaini
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
One of the most documented used of probiotics was for the treatment of diarrhea, especially that which was caused by antibiotics. Researchers in Baltimore found that infants receiving formula supplemented with probiotics showed significant decrease in the incidence of diarrhea. The decrease in occurrence and duration of diarrhea was well-established benefit probiotics. Dairy foods fermented by probiotics are prebiotics. Popular prebiotics used in food products are fructooligosaccharides (FOS) and inulin. In this experiments, prebiotics was isolated from Allium cepa (red onion). The effect of the isolate to grow the probiotics is characterized by the total colony of the Lactobaccilus casei on the Plumbia Agar and by the adsorbance of the Triptose Phosphate Broth, were analized by One Way Anova and then significant differences were subsequently examined by HSD. These results expressed that the isolate increased the growth of Lactobaccilus casei on the two of the media.
Keywords: Allium cepa, Prebiotics, Probiotics, Inulin, FOS PENDAHULUAN
Diare masih menjadi masalah serius, terutama di negara-negara berkembang. Menurut prakiraan Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), di tahun 2000 terjadi sekitar 150 juta kasus diare pada anak-anak di seluruh dunia. Hal itu telah menyebabkan 3-4 juta anak meninggal. Di negara berkembang 25 persen dari jumlah total kematian anak disebabkan oleh diare. Di Indonesia diare sering menimpa anak usia 6 bulan sampai 2 tahun (Brady, 2000).
Berdasarkan penelitian dari Gibson and Robertfroid (1995), probiotik adalah pangan/suplemen pangan yang berisi mikroba hidup yang dapat memberikan efek menguntungkan bagi saluran pencernaan. Menurut Guarner dan Schaafsma (1998) mikroorganisme hidup tersebut dapat memberikan efek yang menguntungkan bagi kesehatan jika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (Brady, 2000).
Konsep probiotik tersebut, dikembangkan dari sebuah teori autointoksikasi yang dikemukakan oleh seorang ilmuwan Rusia penerima Nobel Biologi tahun 1908 yaitu Elie Metchnikoff. Menurutnya, secara perlahan pembusukan (putrefeksi) oleh bakteri dalam usus besar menghasilkan senyawa-senyawa beracun yang memasuki peredaran darah, yang disebut sebagai proses ‘autointoksikasi’. Proses inilah yang menyebabkan penuaan dan beberapa penyakit-penyakit degeneratif. Dia meyakini bahwa panjangnya usia warga suku-suku pegunungan di Bulgaria merupakan akibat dari mengkonsumsi produk susu fermentasi. Bakteri yang ikut terkonsumsi bersama produk tersebut dan kemudian mampu tinggal di usus, berpengaruh positif terhadap mikroflora di kolon dengan cara menurunkan efek toksik dari mikroorganisme yang merugikan di kolon (Roberfroid, 2000).
Mikroflora dalam saluran pencernaan manusia sehat relatif stabil, tetapi bervariasi bergantung dari kondisi fisiologis, pangan yang dikonsumsi, pengobatan yang sedang dijalani, stress dan umur (Brady, 2000). Berangkat dari fenomena ini, dapat dilakukan
manajemen mikroflora usus : proporsi ‘bakteri baik’ ditingkatkan, dan ‘bakteri jahat’ ditekan jumlahnya. Caranya, dengan mengkonsumsi bakteri probiotik, dan menyediakan nutrisi sesuai untuk bakteri probiotik agar dalam usus berkembang lebih pesat.
Oligosakarida adalah karbohidrat sederhana, banyak dikonsumsi dalam bentuk minuman ringan, biskuit, gula-gula dan produk susu. Oligosakarida fungsional adalah polisakarida pendek dengan struktur kimia yang unik sehingga tidak dapat dicerna oleh enzim-enzim pada percernaan manusia. Jadi, akan sampai di dalam usus besar. Dengan demikian, akan merupakan media yang baik untuk pertumbuhan bakteri bifidobacteria yang menguntungkan di dalam usus besar (kolon), sehingga oligosakarida disebut sebagai prebiotik (Tomomatsu; 1994; Bird, 1999)
Manfaat dari konsumsi oligosakarida ialah karena oligosakarida dapat meningkatkan populasi bifidobacteria dalam kolon. Peningkatan jumlah bakteri ini, akan menekan pertumbuhan bakteri pembusuk yang merugikan, yakni Escherichia coli dan Streptococcus faecalis. Efek yang sama juga dapat dicapai dengan mengkonsumsi produk makanan yang mengandung bakteri asam laktat dalam keadaan hidup seperti yogurt, yang disebut probiotik. Bakteri asam laktat dan sejenisnya relatif tahan terhadap asam lambung sehingga dapat sampai di kolon, dan selanjutnya akan menekan pertumbuhan bakteri yang merugikan. (Tomomatsu, 1994; Bird, 1999).
Beberapa makanan secara alamiah mengandung oligosakarida. Misalnya frukto oligosakarida (FOS) dapat ditemukan dalam bawang merah, bawang putih, asparagus, dan kacang kedelai. Akan tetapi, melalui makanan setiap hari tidak mungkin dapat memenuhi jumlah oligosakarida yang dianggap berkhasiat untuk mencegah penyakit seperti diuraikan di atas, maka konsumsi tambahan diperlukan untuk dapat berfungsi mencegah penyakit dan meningkatkan kesehatan (Tomomatsu, 1994; Bird, 1999)
Bahan yang mendapat banyak perhatian dan sukses dipakai sebagai prebiotik adalah ‘non-digestible oligosaccharide’ yang salah satunya adalah fructo-oligosakarida (FOS). Bahan ini di alam banyak terdapat pada tanaman-tanaman sebagai berikut : Hellanthus tuberosus (15-20%), Cichorium intybus (13-20%), Asparagus (2-3%), Allium cepa (2-6%). Dari data yang diambil dari Food Resource, Oregon State University ini, dapat diketahui bahwa Allium cepa yang dikenal di Indonesia dengan nama brambang atau bawang merah merupakan salah satu sumber dari senyawa prebiotik (Spiegel, 1994).
Untuk itu dalam penelitian ini senyawa prebiotik diisolasi dari bawang merah, kemudian dilakukan uji aktivitas untuk melihat pengaruhnya dalam meningkatkan pertumbuhan bakteri probiotik.
Penelitian mengenai penerapan konsep prebiotik fructo-oligosakarida dari Allium cepa pada formula untuk pemeliharaan ekosistem mikrobiota normal usus untuk terapi diare pada bayi dan anak-anak merupakan suatu rangkaian penelitian dalam rangka pendayagunaan bahan alam, bawang merah, yang melimpah, murah dan mudah diperoleh sebagai sumber senyawa prebiotik dalam penerapan strategi pengobatan yang tidak melibatkan antibiotik dan obat antidiare.
BAHAN DAN METODE
Bahan uji. Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah umbi bawang merah (Allium cepa) yang diperoleh dari Surabaya.
Bahan kimia. Bahan kimia yang digunakan : aquadest, alkohol 96%, normal salin, agarosa, darah domba, media cair Triptosa Phosphate Brooth Oxoid CM 283, media padat Plumbia Agar Base Oxoid CM 331, Lactobaccilllus casei FNCC: 0090 NRRL: B.1922, larutan Fehling’s, alkohol 70%
Isolasi Fruktooligosakarida dari Brambang. Bawang merah segar diblender lalu diperas. Cairannya ditambah etanol 96% sampai menjadi 70% yang ditandai dengan terjadinya endapan, kemudian didekantasi, lalu disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm. Endapan yang diperoleh kemudian dilakukan analisis kualitatif dan uji aktivitas in vitro.
Pembuatan larutan uji. Dibuat larutan steril dari isolat. Larutan induk dibuat dengan melarutkan 50 mg isolat dengan normal salin sampai 5,0 ml dengan pemanasan, kemudian larutan tersebut diencerkan dengan double dilution sebanyak lima tahap pengenceran
Penyiapan Lactobaccillus casei. Lactobaccillus casei diperoleh dari PAU UGM dalam keadaan beku kering sehingga perlu dilakukan thawing dengan menggunakan normal salin 1,0 ml secara aseptis. Suspensi yang diperoleh diinokulasi pada media cair kemudian diinkubasi pada suhu 35-37 0C selama 18-24 jam.Untuk sediaan Lactobaccillus casei uji digunakan 0,1 ml suspensi yang kemudian diencerkan 1000 kali dengan menggunakan normal salin.
Uji aktivitas dengan menggunakan media cair. Media cair steril sebanyak 2,5cc ditambah dengan 100 µl suspensi Lactobaccillus casei uji dan ditambah dengan 200 µl sediaan uji secara aseptis, kemudian dikocok sampai homogen. Diinkubasi pada suhu 35-37
0C selama 24 jam. Diukur absorban pada panjang
gelombang maksimum
Uji aktivitas pada media padat. Dibuat campuran 100 µl suspensi Lactobaccillus casei uji dengan 200 µl sediaan uji dan ditambah dengan normal salin ad 500 µl secara aseptis. Kemudian campuran tersebut dituang pada media padat steril lalu digoyang sampai merata di atas permukaan media. Diinkubasi pada suhu 35-37 0C selama 24 jam. Dihitung koloni Lactobaccillus casei pada media.
Analisis Hasil. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Anova Completely Randomized Design (Anova CRD) / Anova One Way pada tingkat kepercayaan 95%. Dari hasil perhitungan, apabila didapatkan F hitung lebih besar dari F tabel atau signifikansi kurang dari 0,05 maka menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna antar kelompok perlakuan. Perhitungan dilanjutkan dengan uji Honestly Significant Difference (HSD) untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan efek antar pasangan kelompok perlakuan (Daniel, 1983).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Bawang merah segar sebanyak 1 kg diblender lalu diperas. Cairannya ditambah etanol 96% sampai menjadi 70% yang ditandai dengan terjadinya endapan. Kemudian didekantasi, lalu disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm. Diperoleh endapan putih sebanyak 20,28 gram. Terhadap endapan ini kemudian dilakukan analisis kualitatif dan uji aktivitas in vitro.
Pada uji organoleptis dapat diketahui bahwa endapan isolat berwarna putih, tidak berbau, tidak larut dengan air, tetapi segera larut dengan pemanasan membentuk larutan kental yang jernih, dan segera mengendap setelah didinginkan. Tidak menunjukkan perubahan warna setelah ditambah dengan larutan yodium, tidak mereduksi larutan Fehling’s.
Fruktooligosakarida adalah gula polimer yang tidak dapat dicerna oleh tubuh. Fruktooligosakarida adalah termasuk dalam kelas karbohidrat sederhana yang terdapat secara alami pada tanaman ’jerussalem artichoke’. Oligo-fiber adalah golongan dari fruktooligosakarida (FOS) yang termasuk inulin tipe fruktan. Inulin adalah karbohidrat alami yang terdapat pada beberapa tanaman seperti ’chicory’, ’artichoke’, bawang prei, brambang, asparagus, gandum, ’barley’, bawang, dan pisang. Oligo fiber adalah FOS yang diekstraksi dari akar ’chicory’ yang tersusun dari unit fruktosa yang berikatan glikosida pada rantai 1-2 dan diakhiri oleh unit glukosa.
Formula umum dari FOS yang diisolasi dari ’chicory’ adalah GFn dimana G adalah Glukosa, F adalah Fruktosa dan n adalah jumlah polimer antara 2 – 60.
Inulin adalah serat pangan yang dibuat larut, yang tidak dicerna di saluran pencernaan atas, dan difermentasi oleh mikroflora khususnya bakteri asam laktat pada saluran pencernaan bawah atau usus besar.
Oligo-fiber adalah famili dari molekul FOS dengan panjang rantai atau tingkat polimerisasi yang berbeda yang didasarkan pada unit fruktosa. Inulin alam yang diisolasi dari akar chicory mempunyai rantai 2–60 polimer, rata-rata 8-0 polimer (Bird, 1999).
Inulin merupakan kelompok polisakarida yang dapat meleleh pada suhu 178 0C setelah dikeringkan pada suhu 130 0C. Tidak larut dalam air, tapi segera larut setelah dipanaskan menimbulkan larutan yang jernih, namun mengendap setalah didinginkan. Tidak mereduksi larutan Fehling’s dan tidak berwarna dengan larutan iodine (Stark, 1994).
Dari uji kualitatif yang telah dilakukan diduga isolat yang diperoleh adalah inulin atau fruktooligosakarida karena mempunyai sifat-sifat yang mirip. Namun perlu
dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan standar inulin dan pengujian lainnya seperti uji kromatografi lapis tipis dan lainnya pada isolat dan hasil hidrolisanya, untuk memastikan susunan gulanya.
Untuk uji aktivitas, dibuat larutan 10.000 ppm dengan menggunakan normal salin, lalu dilakukan pengenceran double dilution sebanyak 5 tahap pengenceran. Pembuatan larutan dan pengenceran ini dilakukan secara aseptis di dalam ‘laminar air flow cabinet’.
Kemudian rangkaian pengenceran sediaan uji tersebut digunakan untuk pengujian aktivitas in vitro dengan menggunakan media cair. Sebanyak 2,5 ml media cair ditambah dengan 100 µl suspensi Lactobaccillus casei dan 200 µl sediaan uji, kemudian diinkubasi pada suhu 35-37 0C selama 24 jam. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang maksimum dari suspensi Lactobaccilus casei, yaitu 434 nm, hasilnya tertera pada tabel 1.
Tabel 1. Absorban masing-masing kelompok pengenceran yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 434 nm
Kontrol Kel I Kel II Kel III Kel IV Kel V Kel VI
0,061 0,127 0,109 0,079 0,065 0,073 0,070 0,070 0,120 0,119 0,075 0,070 0,069 0,066 0,066 0,129 0,108 0,080 0,077 0,065 0,072 0,072 0,114 0,105 0,074 0,067 0,069 0,067 0,065 0,127 0,105 0,073 0,065 0,069 0,065 X =0,0668 X=0,1234 X=0,1092 X=0,0762 X=0,0688 X=0,0690 X=0,0680 Keterangan. Kontrol: media cair + suspensi bakteri + normal salin (tanpa isolat); Kel I: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 10.000 ppm; Kel II: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 5.000 ppm; Kel III: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 2.500 ppm; Kel IV: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 1.250 ppm; Kel V: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 625 ppm; Kel VI: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 312,5 ppm
Dari data di atas dilakukan analisa statistik menggunakan Anova Completely Randomized Design (Anova CRD)/Anova One Way pada tingkat kepercayaan 95% yang hasilnya seperti tertera pada tabel 2 dan tabel 3.
Tabel 2. Ringkasan hasil statistik Anova Satu Arah dari data absorban masing-masing kelompok pengenceran Sumber Variasi Jumlah Kuadrat (SS) Derajat Bebas (df) Kuadrat Rata-rata (MS) F Hitung Signifikansi Antar Dosis 0,016 6 0,003 132,943 0.000 Antar Perlakuan 0,001 28 0,000 Total 0,017 34
Tabel 3. Ringkasan hasil perhitungan HSD dari data absorbansi masing-masing kelompok pengenceran K I II III IV V VI K ---- -0,05660* -0,04240* -0,00940* -0,00200 -0,00200 -0,00120 I --- 0,01420* 0,04720* 0,05460* 0,05440* 0,05540* II --- 0,03300* 0,04040* 0,04020* 0,04120* III --- 0,00740* 0,00720* 0,00820* IV --- -0,00020 0,00080 V --- 0,00100 VI ---
(*). Ada perbedaan bermakna antar kelompok
Keterangan. Kontrol: media cair + suspensi bakteri + normal salin (tanpa isolat); Kel I: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 10.000 ppm; Kel II: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 5.000 ppm; Kel III: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 2.500 ppm; Kel IV: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 1.250 ppm; Kel V: media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 625 ppm; Kel VI= media cair + suspensi bakteri + larutan isolat 312,5 ppm
Dari perhitungan Anova diatas diketahui bahwa signifikansi 0,00 berarti lebih kecil dari 0,05, sehingga dapat disimpulkan bahwa minimal ada satu pasang kelompok yang mempunyai perbedaan bermakna. Perhitungan dilanjutkan dengan uji HSD yang hasilnya dapat dilihat pada tabel 3.
Dari hasil analisa statistik di atas dapat diketahui bahwa terdapat perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dengan kelompok yang diberi larutan uji dengan konsentrasi 10.000 ppm, 5.000 ppm dan 2.500 ppm, sehingga dapat disimpulkan ketiga konsentrasi ini mampu meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus casei. Dari hasil perhitungan konsentrasi isolat dalam media cair diketahui bahwa kelompok yang ditambahkan 200 µl larutan isolat 10.000 ppm setara dengan 714,3 ppm isolat, sedangkan kelompok yang ditambahkan 200µl larutan isolate 5.000 ppm setara dengan 357,15 ppm isolat dan kelompok yang ditambahkan 200µl larutan isolat 2.500 ppm setara
dengan 178,575 ppm isolat. Jadi bisa disimpulkan bahwa dengan konsentrasi isolat sebesar 178,575 ppm dalam media cair mampu meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus casei.
Kemudian rangkaian pengenceran sediaan uji juga digunakan untuk pengujian aktivitas in vitro dengan menggunakan media padat yaitu blooth agar. Darah yang digunakan adalah darah domba. Dibuat campuran 100µl suspensi Lactobacillus casei dengan sediaan uji yang konsentrasinya sama dengan yang digunakan pada media padat, sebanyak 500µl dalam normal salin. Campuran ini dituangkan secara merata pada media padat dalam cawan Petri yang mempunyai ketebalan 1cm, kemudian diinkubasi pada suhu 35-37 0C selama 24 jam. Setelah itu dihitung koloni Lactobacillus casei. Koloni Lactobacillus casei berbentuk bulat berwarna putih, sehingga tampak jelas dan memudahkan penghitungan koloni. Hasilnya tertera pada tabel 4.
Tabel 4. Jumlah koloni Lactobacillus casei pada masing-masing kelompok pengenceran Kontrol Kel I Kel II Kel III Kel IV Kel V Kel VI
12 59 37 23 17 17 12 9 70 41 30 19 12 19 10 64 50 19 27 7 20 13 51 30 20 15 30 21 10 67 57 23 24 21 13 12 73 43 17 30 19 9 X = 11 X= 64 X= 43 X= 22 X= 22 X=17,67 X=15,67
Dari data di atas dilakukan analisa statistik menggunakan Anova Completely Randomized Design (Anova CRD)/Anova One Way pada tingkat kepercayaan 95%. yang hasilnya tertera pada tabel 5.
Tabel 5. Ringkasan hasil statistik Anova Satu Arah dari data Jumlah koloni Lactobacillus casei pada masing-masing kelompok pengenceran
Sumber Variasi Jumlah Kuadrat (SS) Derajat Bebas (df) Kuadrat Rata-rata (MS) F Hitung Signifikansi Antar Dosis 12844,952 6 2140,825 49,930 0.000 Antar Perlakuan 1500,667 35 42,876 Total 14345,619 41
Tabel 6. Ringkasan hasil perhitungan HSD dari Jumlah koloni Lactobacillus casei padamasing-masing kelompok pengenceran K I II III IV V VI K ---- -53,0000* -32,0000* -11,0000* -11,0000* -6,6667 -4,6667 I --- 21,0000* 42,0000* 42,0000* 46,3333* 48,3333* II --- 21,0000* 21,0000* 25,3333* 27,3333* III --- 0,00000 4,3333 6,3333 IV --- 4,3333 6,3333 V --- 2,0000 VI ---
(*): Ada perbedaan bermakna antar kelompok
Keterangan. Kontrol: suspensi bakteri dan normal salin (tanpa isolat); Kel I = suspensi bakteri dan larutan isolat 10.000 ppm; Kel II: suspensi bakteri dan larutan isolat 5.000 ppm; Kel III: suspensi bakteri dan larutan isolat 2.500 ppm; Kel IV: suspensi bakteri dan larutan isolat 1.250 ppm; Kel V: suspensi bakteri dan larutan isolat 625 ppm; Kel VI: suspensi bakteri dan larutan isolat 312,5 ppm
Dari perhitungan Anova diatas diketahui bahwa signifikansi 0,00 berarti lebih kecil dari 0,05, sehingga dapat disimpulkan minimal ada satu pasang kelompok yang mempunyai perbedaan bermakna. Perhitungan dilanjutkan dengan uji HSD yang hasilnya dapat dilihat pada tabel 6.
Dari hasil analisa statistik di atas dapat diketahui bahwa terdapat perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dengan kelompok yang diberi larutan uji dengan konsentrasi 10.000 ppm, 5.000 ppm, 2.500 ppm dan 1250 ppm, sehingga dapat disimpulkan keempat konsentrasi ini mampu meningkatkan pertumbuhan lactobacillus. Konsentrasi isolat yang dituangkan di atas media padat secara merata setara dengan konsentrasi isolat dalam media cair sehingga diketahui bahwa kelompok larutan isolat 10.000 ppm setara dengan 714,3 ppm isolat, kelompok larutan isolat 5.000 ppm setara dengan 357,15 ppm isolat, kelompok larutan isolat 2.500 ppm setara dengan 178,575 ppm isolat dan kelompok larutan isolat 1250 ppm setara dengan 89,2875 ppm. Jadi bisa disimpulkan bahwa dengan konsentrasi isolat sebesar 89,2875 ppm mampu meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus casei.
Kesimpulan. Berdasarkan hasil uji analisis kualitatif yang telah dilakukan, diduga senyawa hasil isolasi
adalah fruktooligosakarida. Isolat yang diperoleh dari bawang merah (Allium cepa) mampu meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus casei baik pada media padat maupun pada media cair.
DAFTAR PUSTAKA
Brady, LJ, Gallaher, DD. and Busta, FF, 2000. The role of probiotic cultures in the prevention of colon cancer. J. Nutr. 130: 410S-414S
Bird, A R.. Prebiotics: A role for dietary fibre and resistant starch. Asia Pacific J. Clin Nutr.: 1999: 8(Suppl.): S32-S36.
Roberfroid MB. 2000. Prebiotics and Probiotics: Are They Functional Foods ?. Am J Clin Nutr 71 (6 Suppl): 1682S - 1687S
Spiegel JE, et al. 1994. Safety and Benefits of Fructo-oligosaccharides as food ingredients. Food Technology. 85-90
Stark, A, Madar, Z. 1994. Dietary fibre. In: Goldberg, I (ed). Functional Foods: Designer Foods, Pharmafoods, and Nutraceuticals. Chapman &Hall. New York.: p. 183-201.
Tomomatsu, H., 1994, Health Effects of Oligosaccharides. Food Technology, Oct: 61-64.
