1 PRODUKSI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIOKSIDAN HASIL FERMENTASI KAPANG ENDOFIT K.Cl.Sb.R9 DARI KUNYIT (Curcuma
longa L.) PADA MEDIA YANG BERBEDA
Resi Fauziah 1), Husain Nashrianto 1), Bustanussalam 2) 1)
Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Pakuan, Bogor
2)
Pusat Penelitian Bioteknologi - LIPI, Jl. Raya Bogor Km. 46, Cibinong 16911.
ABSTRAK
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan, yang dapat menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas. Kunyit mengandung senyawa kurkumin yang memiliki efek farmakologis salah satunya sebagai antioksidan. Pada penelitian ini dipergunakan kapang endofit isolat K.Cl.Sb.R9 dari rimpang kunyit asal Sukabumi yang bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa antioksidan yang difermentasikan pada media Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Sucrose Broth (PSB).
Hasil fermentasi menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat filtrat PSB memiliki aktivitas antioksidan lebih tinggi. Ekstrak filtrat kemudian di fraksinasi dengan kromatografi kolom dengan SiO2 sistem elusi gradient dengan menggunakan fase gerak kloroform : metanol (15:1 ~ 1:1). Diperoleh 3 fraksi gabungan dan diuji aktivitas antioksidannya dengan metode peredaman radikal bebas menggunakan DPPH. Fraksi paling aktif yaitu fraksi 2 dengan persen hambat 25,45 % yang dimurnikan lebih lanjut dengan KLT preparatif sehingga diperoleh isolat senyawa untuk diidentifikasi struktur kimianya. Berdasarkan data spektra spektrofotometri UV-Vis, FTIR, KG-SM, isolat senyawa tersebut diduga merupakan senyawa asam benzena propanoat, 3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroksi atau 3-(2H-Benzotriazol-2-il)-2-(4-hidroksifenil) quinoxalin.
Kata Kunci : Antioksidan, Rimpang Kunyit, Isolat K.Cl.Sb.R9, Potato Dextrose Broth
2 PENDAHULUAN
Para ahli biokimia menyebutkan bahwa radikal bebas merupakan salah satu bentuk senyawa oksigen reaktif, yang secara umum diketahui sebagai senyawa yang memiliki elektron yang tidak berpasangan (Winarsih, 2007). Antioksidan merupakan substansi yang diperlukan tubuh menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas dengan melengkapi kekurangan elektrolit yang dimiliki radikal bebas dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stress oksidatif (Prakash, 2001).
Senyawa bioaktif dapat dihasilkan oleh mikroba endofit spesifik. Mikroba ini hidup bersimbiosis saling menguntungkan, dalam hal ini mikroba endofitik mendapatkan nutrisi dari hasil metabolisme tanaman dan memproteksi tanaman melawan serangga, atau jaringan yang patogen sedangkan tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang diperlukan selama hidupnya (Simarmata dkk, 2007). Pada penelitian ini dipergunakan kapang endofit dari rimpang kunyit yang telah diisolasi dan uji skrining terhadap senyawa
antioksidan oleh Kelompok Peneliti Mikroba Simbiosis Tanaman yang ada di Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong (Bustanussalam dkk, 2015). Kunyit mengandung senyawa kurkumin yang memiliki efek farmakologis yang salah satunya sebagai antioksidan (Kumar et al., 2011).
Fermentasi kapang endofit isolat K.Cl.Sb.R9 dilakukan dalam dua macam media fermentasi, yaitu Potato
Dextrose Broth (PDB) dan Potato
Sucrose Broth (PSB). Medium
fermentasi yang baik harus
menyediakan semua nutrien yang dibutuhkan oleh mikroba untuk memperoleh energi, pertumbuhan, dan bahan pembentuk sel. Senyawa-senyawa sumber karbon dan nitrogen merupakan komponen terpenting dalam medium fermentasi (Kumala dkk, 2008).
Penelitian ini melakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode peredaman radikal bebas DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) (Yen dan Chen, 1995). Metode ini merupakan metode yang sederhana, hanya membutuhkan spektrofotometer uv-vis dalam pengukurannya, serta dapat digunakan
3 untuk menguji aktivitas antioksidan
secara luas (Prior et al., 2005).
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian yaitu kapang endofit isolat K.Cl.Sb.R9 dari rimpang kunyit (Curcuma longa L.) asal Sukabumi, Etil asetat, n-heksana, metanol, kloroform, akuades, Potato Dextrose Agar (PDA),
Potato Dextrose Broth (PDB), Potato
Sucrose Broth (PSB), kentang,
dektrosa, sukrosa, DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil), vitamin C, serium (II) sulfat, asam sulfat, silika gel 60, lempeng KLT silika gel GF254, celite 545, sea sand B, KBr.
Alat -alat yang digunakan yaitu beaker glass, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, gelas ukur, vial, cawan petri, pipet tetes, pipet skala, corong pisah, mikropipiet, pipa kapiler, timbangan analitik (Presica 240A), oven, rotary
shaker (BIG Bill), pompa vakum,
Laminar Air Flaw (H.S. 079S), kapas, lampu spiritus, sedotan steril, jarum ose steril, pinset, kolom kromatografi, incubator air (Grant), homogenizer, pengaduk magnetik, kertas Whatman, indikator pH universal, bejana kromatografi, sonikator (Branson 1510), rotavapor (Janke & Kunkel rv
05-ST), autoklaf (Tomy ES-315),
spektrofotometer Uv-Vis, FTIR dan GC-MS.
METODE PENELITIAN
Penentuan Kurva Pertumbuhan Kapang endofit isolat K.Cl.Sb.R9 diremajakan dalam media Potato Dextrose Agar
(PDA), lalu difermentasikan pada media Potato Dextrose Broth
(PDB) selama 22 hari diatas rotary shaker dengan kecepatan 120 rpm dan pada suhu ruang (± 25°C). Setiap 2 hari, dilakukan pengambilan contoh (sampling) kemudian dilakukan penyaringan, diukur pH dari filtrat dan biomassa dikeringkan dengan oven pada suhu 50°C selama satu hari dan ditimbang.
Bioproduksi Senyawa Skala Laboratorium
Kapang endofit isolat K.Cl.Sb.R9 yang sudah diremajakan selanjutnya diambil dengan menggunakan sedotan steril dan jarum ose steril lalu dimasukkan ke dalam media PDB dan PSB. Fermentasi dilakukan selama 14 hari, suhu ruang (±
4 25°C) pada rotary shaker dengan
kecepatan 120 rpm.
Pengambilan Kultur
Hasil fermentasi disaring dan setiap filtrat yang diperoleh diekstraksi secara partisi dengan etil asetat menggunakan corong pisah. Sementara biomassa yang diperoleh dikeringkan dalam oven pada suhu 50°C, kemudian diekstraksi secara maserasi menggunakan etil asetat.
Analisis secara KLT
Ekstrak etil asetat filtrat dan ekstrak etil asetat biomassa dari media PDB dan PSB masing-masing dianalisis dengan KLT menggunakan fase gerak kloroform : metanol (9:1) dan n-heksana : etil asetat (5:1). Bercak yang timbul
kemudian disemprot dengan
penampak bercak serium sulfat (Ce(SO4)2) 1% dalam H2SO4 10 %, kemudian dipanaskan.
Pengujian aktivitas antioksidan Larutan blanko, larutan uji dibuat deret 5 bpj, 10 bpj, 25 bpj, 50 bpj dan 100 bpj, larutan vitamin C sebagai kontrol positif
ditambahkan 0,4 mM DPPH. Kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Serapan dibaca pada panjang gelombang 517 nm dengan spektrofotometer Uv-Vis. Dihitung % hambat dan nilai IC50.
Fraksinasi
Ekstrak yang memberikan nilai % hambat terbesar difraksinasi dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam SiO2; fase gerak kloroform : metanol (15:1 ~ 1:1). Fraksi yang diperoleh kemudian dianalisis dengan KLT dan disemprot dengan penampak bercak serium sulfat. Fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram yang sama digabungkan yang selanjutnya dianalisis kembali dengan KLT menggunakan fase gerak kloroform : metanol (5:1).
Uji antioksidan Fraksi Gabungan Setiap fraksi gabungan diuji aktivitas antioksidannya dengan menggunakan peredaman radikal bebas menggunakan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) sehingga dapat ditentukan fraksi gabungan
5 mana yang memiliki aktivitas
antioksidan tertinggi.
Pemurnian dengan KLT Preparatif
Fraksi gabungan dengan aktivitas antioksidan terbesar dimurnikan dengan KLT preparatif yang dieluasi menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat (1:1). Masing-masing pita hasil KLT preparatif yang diperoleh dikerok dan dilarutkan dengan pelarut etil asetat pro analisis, kemudian disaring dengan kertas whatman. Filtrat diuapkan sehingga diperoleh isolat senyawa. Isolat senyawa dari masing-masing pita kemudian dianalisis dengan KLT menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat (1:1) dan bercak disemprot dengan DPPH.
Idenifikasi Struktur Kimia (Harborne, 1987).
Analisis Spektrofotometri UV-Vis
Isolat murni diidentifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 200-600 nm.
Analisis spektrofotometri FTIR Isolat murni dicampur dengan KBr diidentifikasi menggunakan spektrofotometer FTIR pada bilangan gelombang 600 – 4000 cm-1.
Analisis Kromatografi Gas-Spektrofotometri Massa (GC-MS)
Sejumlah isolat murni dilarutkan dalam etil asetat pro analisis kemudian diinjeksikan
kedalam GC-MS, lalu di
interpretasikan spektrum massanya dibandingkan dengan data library.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kurva pertumbuhan kapang endofit K.Cl.Sb.R9 memberikan informasi mengenai fase-fase pertumbuhan yang terjadi pada kapang endofit K.Cl.Sb.R9, didapat waktu optimal 14 hari untuk tahap fermentasi. 0 0.2 0.4 0 4 8 12 16 20 24 b ob ot b iom as sa (gr am ) Hari ke- Kurva Pertumbuhan K.Cl.Sb.R9
6 Hasil Fermentasi disaring untuk
memisahkan filtrat dan biomassa, baik filtrat maupun biomassa diekstraksi dengan menggunakan pelarut etil asetat. Bobot ekstrak PDB Filtrat 12,1 mg, ekstrak PDB biomassa 76,4 mg, ekstrak PSB filtrat 69,8 mg, ekstrak PSB biomassa 21,3 mg. Ekstrak selanjutnya di analisis dengan KLT dan di uji aktivitas antioksidan. Dari kromatogram dapat dilihat bahwa senyawa hasil bioproduksi kapang endofit isolat K.Cl.Sb.R9 yang dielusi dengan kloroform : metanol lebih mudah terpisahkan, lebih banyak spot yang muncul dan bisa mengelusi semua senyawa yang ditandai dengan hampir tidak ada yang tertinggal dititik awal penotolan. Maka fraksinasi menggunakan kromatografi kolom digunakan kloroform : metanol sebagai fase geraknya.
Hasil uji aktivitas antioksidan fraksi yaitu ekstrak etil asetat filtrat PDB 9,615 %, ekstrak etil asetat biomassa PDB 8,03 %, ekstrak etil asetat filtrat PSB 17,51 %, ekstrak etil asetat biomassa PSB 10,92 %. ekstrak filtrat PSB memiliki aktivitas antioksidan lebih tinggi
dari ekstrak lainnya, sehingga ekstrak etil asetat filtrat PSB dipilih untuk dilanjutkan pada tahap fraksinasi.
Fraksinasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom sistem elusi gradien dengan fase gerak kloroform : metanol (15:1~1:1). Hasil fraksi dianalisis
dengan KLT untuk mengelompokkan fraksi berdasarkan kromatogram yang
sama, sehingga didapat 3 kelompok fraksi. Aktivitas antioksidan fraksi tersebut yaitu fraksi 1 sebesar 23,53%, fraksi 2 sebesar 25,45% dan fraksi 3 sebesar 23,41%.
Kelompok fraksi 2 memiliki aktivitas antioksidan tertinggi sehingga dimurnikan dengan KLT preparatif menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksan : etil asetat (1:1). Hasil pemurnian didapat dua pita, dan diuji kualitatif dengan disemprot menggunakan DPPH menunjukkan bahwa pita a lebih aktif, sehingga pita a diidentifikasi senyawa kimianya dengan spektrofotometer Uv-Vis, FTIR dan KG-SM. Spektrum Uv-Vis menunjukkan bahwa puncak maksimum yang terdapat pada
7 panjang gelombang 289,50 nm
dengan nilai serapan 0,635. Hasil spektrum Uv-Vis dapat diperkirakan adanya gugus kromofor dan ikatan rangkap dua yang terdapat dalam isolat X.
Spektrum dari FTIR menunjukkan adanya gugus fungsi O-H, C-H, C=O, C-H, C-N, C-O, C-H cincin aromatik. Berikut adalah gambar spektrum FTIR.
Selanjutnya dengan kromatografi gas-spektroskopi
massa dapat diketahui senyawa yang terkandung didalam isolat tersebut berdasarkan hasil interpretasi dari tiga instrumen yang didapat pada spektra Uv-Vis, FTIR dan KG-SM dapat diduga bahwa senyawa tersebut merupakan (a) asam benzena propanoat, 3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroksi atau (b) 3-(2H-Benzotriazol-2-il)-2-(4-hidroksifenil)quinoxalin. Berikut merupakan struktur senyawanya.
KESIMPULAN
Isolat kapang endofit K.Cl.Sb.R9 dari rimpang kunyit (Curcuma
longa L.) asal Sukabumi yang
difermentasikan dalam media
Potato Sucrose Broth (PSB)
memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dari pada media Potato
Dextrose Broth (PDB). Isolat
memiliki aktivitas antioksidan yang meningkat setelah dimurnikan dengan kromatografi kolom, hal ini menunjukkan lebih aktif pada saat senyawa sudah terpisah, tetapi aktivitasnya tetap terlampau kecil yaitu 25,45%. Senyawa antioksidan hasil bioproduksi kapang endofit K.Cl.Sb.R9 yang diidentifikasi dengan spektrofotometri Uv-Vis, FTIR dan KG-SM hasilnya dapat diduga bahwa isolat X tersebut merupakan senyawa asam benzena propanoat, 3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroksi atau (3-(2H-Benzotriazol-2-il)-2-(4-hidroksi fenil) quinoxalin.
8 DAFTAR PUSTAKA
Bustanussalam, Fauzi Rachman, Eris Septiana, Sylvia J.R
Lekatompessy, Tiwi Widowati, Harmastini Sukiman and Partomuan
Simanjuntak. 2015. Screening for Endophytic Fungi From Turmeric Plant (Curcuma
longa L.) of Sukabumi and
Cibinong with Potency as Antioxidant Compounds Producer. Pakistan Journal of Biological Sciences 18 (1) : 42-45.
Kumala, Shirly and F.A. Nur. 2008. Penapisan Kapang Endofit Ranting Kayu Meranti Merah (Shorea balangeran Korth.) sebagai Penghasil Enzim Xilanase. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 6 (1) : 1-6.
Kumar A., D. Jyotsna and S. Anup. 2011. A Review on spice of life Curcuma longa (turmeric). International Journal of Applied Biologi and Pharmaceutical Technology. 3 : 371 – 379. Prakash, A. 2001. Antioxidant Activity. Medallion Laboratories : Analytical Progress. 19 (2) : 1-4.
Prior, R.L., X. Wu and K. Schaich. 2005. Standarized Methods for the Determinan of Antioxidant Capacity and Phenolic in Foods and Dietary Supplement. J. Agric. Food Chem. 53 : 4290-4302.
Simarmata, R., S. Lekatompessy and H. Sukiman. 2007. Isolasi Mikroba Endofitik dari Tanaman Obat Sambung Nyawa (Gynura Procumbens) dan analisis potensinya sebagai antimikroba. Bogor : Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan. Berk. Penel. Hayati. 13 : 85-90.
Winarsih, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas-Potensi Aplikasinya dalam Kesehatan. Yogyakarta : Yanisinus. hal 11-21.
Yen, G.C., and H.Y. Chen. 1995. Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. J. Agric. Food Chem. 43 : 27-37
