MENGINDUKSI MUTAGENESIS PADA TANAMAN

1

MENGINDUKSI MUTAGENESIS PADA TANAMAN

Dr. Ir. I Gede Ketut Susrama, MSc

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS UDAYANA

Juli 2017

2 KATA PENGANTAR

Mutagenesis pada manusia akibat terpapar mutagen adalah sesuatu yang berbahaya tetapi mutagenesis pada tanaman menjanjikan suatu keberhasilan dalam memproduksi tanaman unggul atau tanaman lebih berkualitas. Tulisan ini membahas dalam bentuk yang paling sederhana mengenai pendekatan dengan pemanfaatan mutagen untuk memodifikasi genetik tanaman dalam upaya membuat tanaman mutan dengan karakteristik menguntungkan bagi kehidupan manusia.

Berbagai hambatan telah dilewati dalam proses penulisan tulisan ini dan berkat rahmat Tuhan Yang Maha Esa dan berkat asung kerta wara nugraha Ida Sanghyang Widhi Wasa serta atas bantuan/dukungan banyak sahabat yang masih mau berbaik hati kepada penulis, tulisan ini bisa diselesaikan.

Ucapan terimakasih penulis sampaikan kepada semuanya termasuk kepada anda pembaca yang sedang membaca tulisan ini. Antusiasme pembaca yang terbayang pada saat menulis memberi semangat untuk bisa menulis sesuatu yang bermanfaat untuk sebanyak mungkin orang dan dengan berbekal itikad baik dan ketulusan hati rasa sakit pada bahu, pinggang dan lutut pada saat harus duduk berlama-lama untuk menulis tulisan ini seperti agak terlupakan.

Semoga kebenaran, kebaikan dan kewajaran berangkat dari ketulusan hati nurani bisa selalu dinikmati sebagai keindahan lahir bathin dalam kehidupan sekejap yang fana ini. Astungkara.

Denpasar, Juli 2017 Penulis

3 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ...2

DAFTAR ISI ...3

I. PENDAHULUAN ...4

II. MUTAGEN DAN MUTAGENESIS ...10

2.1 Mutagen ...10

2.1.1Mutagen analog basa ...11

2.1.2Alkilator ...12

2.1.3Deaminator oksidatif ...13

2.1.4Kolkisin ...14

2.2 Mutagenesis ...15

2.3 Penelitian mutagenesis di Indonesia ...18

III. MENGINDUKSI MUTAGENESIS PADA TANAMAN ...20

3.1 Mutagenesis untuk pembuatan tanaman resisten ...20

3.2 Pengaruh EMS pada tanaman ...23

3.3Pengaruh sinar gamma pada tanaman ...24

3.4Pengaruh kolkisin pada tanaman ...25

3.5Pengaruh natrium azida pada tanaman ...26

KESIMPULAN ...27

SARAN ...28

DAFTAR PUSTAKA ...29

4 I. PENDAHULUAN

Untuk mengimbangi peningkatan jumlah penduduk mengharuskan upaya terus menerus meningkatkan ketersediaan pangan. Apabila upaya meningkatkan ketersediaan pangan gagal atau tidak mampu mengimbangi tingkat pertambahan penduduk maka akan terjadi bencana kelaparan seperti yang terjadi di Etiopia dan negara lainnya. Malthus seorang ahli ekonomi sejak berabad lalu sudah menyampaikan kemungkinan resiko dunia kekurangan bahan pangan dengan pernyataan matematis bahwa peningkatan produksi pangan dunia mengikuti pertambahan deret hitung sedangkan pertumbuhan penduduk dunia mengikuti pertambahan deret ukur. Untuk meningkatkan produksi pangan berbagai pendekatan perlu dilakukan mengingat permasalahan yang dihadapi untuk meningkatkan produksi pangan sangat kompleks, multi dimensi atau saling terkait dengan berbagai bidang kehidupan dan melibatkan banyak pemangku kepentingan baik klasifikasi maupun jumlah. Memperluas lahan pertanian ke depannya akan semakin sulit mengingat sebagian dari lahan pertanian yang ada sekarang akan terus berkurang untuk memenuhi kebutuhan akan pemukiman. Hal yang sama terjadi pada berkurangnya air irigasi karena harus dialihkan peruntukkannya dipakai sebagai air baku untuk penyediaan air minum. Ini berarti bidang pertanian harus terus mampu meningkatkan produksi pangan dalam kondisi lahan yang akan terus berkurang dan ketersediaan air irigasi yang juga akan terus berkurang.

Salah satu upaya yang mungkin dilakukan adalah meningkatkan kualitas tanaman. Apabila kualitas tanaman meningkat maka otomatis produktivitas lahan akan bertambah. Dulu produksi padi per hektar di tingkat petani hanya 3-4 ton.

Sekarang sudah menjadi 5-6 ton bahkan ada yang lebih dari itu. Walaupun bukan

5 seluruhnya hanya karena varietas yang unggul karena kontribusi peningkatan kualitas budidaya juga sangat penting. Peningkatan kualitas tanaman tidak hanya mengangkut peningkatan produksi tanaman per satuan luas lahan. Peningkatan kualitas tanaman juga termasuk peningkatan kandungan nutrisi dalam bagian tanaman yang dikonsumsi baik jenis maupun besar kandungannya, penambahan kandungan vitamin dan mineral serta akhir-akhir ini sudah berhasil dibuat produk pertanian dengan kandungan antibiotik di dalamnya. Walaupun ada catatan bahwasanya produk pertanian yang baru yang bisa mengandung nutrisi, vitamin atau antibiotik termasuk produk rekayasa genetik atau GMO (Genetically Modified Organism) yang memang masih ada pro kontranya. GMO merupakan hasil aplikasi bioteknologi modern yakni hasil aplikasi teknik asam nukleat in vitro dan teknik fusi sel. Jadi selain produk pertanian hasil aplikasi kedua teknik tersebut diatas tidak termasuk dalam produk rekayasa genetik. Banyak pihak yang masih belum jelas atau ragu produk rekayasa genetik dan penjelasan ikutannya walaupun sebenarnya hal tersebut sudah diterbitkan dalam bentuk peraturan perundang-undangan untuk menghentikan perdebatan berlanjut antar pihak di masyarakat. Perdebatan tentang GMO yang cenderung tidak jelas ujung pangkalnya, selama ini terjadi disamping karena kekhawatiran akan terjadinya kontaminasi genetik, kemungkinan juga karena ketidakpahaman tentang topik yang didebatkan.

Berbagai cara sudah dilakukan untuk meningkatkan kualitas tanaman seperti yang diawali oleh Mendel dengan penyilangan bunga untuk membuat varietas baru yang merupakan cikal bakal pengembangan bidang ilmu pemuliaan tanaman (Plant Breeding). Penyilangan bunga hanya mungkin dilakukan antar tanaman tertentu saja sehingga kemudian dikembangkan pengembangan varietas baru untuk peningkatan

6 kualitas tanaman dan sekaligus untuk pengkayaan keanekaragaman hayati dengan mengkombinasikan DNA (DNA rekombinan) yang memungkinkan pengkombinasian antar tanaman dan binatang sekalipun. Teknik DNA rekombinan memerlukan sarana dan prasarana memadai supaya bisa dijalankan dan relatif mahal.

Diantara kedua teknik peningkatan kualitas tanaman diatas ada teknik peningkatan tanaman yang ketiga yaitu membuat tanaman mutan dengan bantuan mutagen. Walaupun ada resiko bahaya yang cukup besar kalau bekerja dengan mutagen dalam jangka waktu lama yakni kemungkinan melakukan kecerobohan yang sering terjadi apabila bekerja dengan zat kimia tetapi resiko bahaya itu bisa dibuat sekecil mungkin dengan pemahaman tentang zat kimia khususnya mutagen dengan baik, dengan membiasakan diri bekerja dengan zat berbahaya sehingga tidak tegang dan tentu saja dengan bekerja sehati-hati mungkin pada saat bekerja dengan mutagen serta dengan selalu berdoa sebelum memulai pekerjaan supaya selamat.

Penelitian menginduksi mutagenesis yang mulai gencar dilakukan sejak kolkisin ditemukan bisa menginduksi mutasi menguntungkan yakni menggandakan kromosom pada tanaman pada tahun 1940. Sampai sekarang masih banyak diminati baik untuk penelitian di berbagai bidang ilmu dasar maupun terapan dan untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi, pemuliaan tanaman dan bioteknologi pertanian dalam upaya memperkaya keanekaragaman hayati dan meningkatkan kualitas tanaman dan sudah menghasilkan banyak sekali varietas tanaman unggul baru baik untuk meningkatkan tingkat produksi tanaman maupun peningkatan ketahanan tanaman terhadap hama dan penyakit tanaman dan juga untuk meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman faktor abiotik seperti kekeringan

7 dan salinitas. Ukuran kacang-kacangan misalnya sudah berhasil ditingkatkan ukuran bijinya seperti ukuran biji kedelai misalnya sekarang sudah menjadi 2-3 kali ukuran kedelai varietas asal. Beberapa buah-buahan yang dulunya berbiji, sekarang sudah bisa dibuat tidak berbiji dengan aplikasi teknik poliploidi. Setelah kolkisin berbagai jenis mutagen kimia lain dipakai untuk menginduksi mutagenesis pada tanaman seperti misalnya etil metan sulfonat (EMS) dan sodium azida (SA) yang menghasilkan lebih banyak lagi tanaman dengan karakteristik lebih unggul dari varietas yang sudah ada.

Peningkatan kualitas ternak misalnya tidak mungkin dilakukan dengan perlakuan mutagen atau ternak mutan tidak diperbolehkan dibuat melalui mutagenesis berbeda dengan tanaman. Untuk mengingatkan kekejaman kepada mahluk hidup sudah diciptakan ungkapan “peri kemanusiaan” dan juga kadang- kadang ada yang mengucapkan “peri kebinatangan” tetapi sepertinya belum pernah ada ungkapan “peri ketanaman”, yang menunjukkan untuk sementara tanaman bisa diperlakukan seenaknya dengan mutagentanpa harus berurusan dengan aparat hukum untuk menjadikannya tanaman mutan yang mempunyai karakteristik fenotif yang lebih menguntungkan untuk kehidupan dibanding varietas asalnya.

Keberhasilan membuat tanaman mutan yang mempunyai karakteristik berbeda dengan tanaman varietas asal dan diantara karakteristik itu ada yang masuk katagori kriteria yang menjadikan tanaman berkualitas tinggi yaitu diantaranya memberi tingkat produksi tinggi, tahan terhadap hama penyakit tumbuhan, jenis nutrisi lebih lengkap dengankandungan per satuan bahan lebih tinggi,meningkatkan nilai estetika dan lainnya. Hal itu dimungkinkan karena tanaman berbeda dengan mahluk hidup lain untuk sementara diperbolehkan diperlakukan dengan mutagen dan hasil

8 mutagenesisnya ada yang menguntungkan misalnya seperti perubahan warna petala pada bunga tanaman ornamental menjadi lebih menarik dan memberi variasi lebih indah serta diameter dan panjang polong pada tanaman kacang-kacangan bertambah dan peningkatan ukuran biji pada tanaman sereal. Kolkisin sebagai salah satu mutagen yang sering digunakan untuk melipatgandakan kromosom tanaman dimana tanaman yang tadinya 2n diubah menjadi 4n kemudian menjadi 8n dan seterusnya akan menambah ukuran tanaman baik bagian vegetatif maupun reproduktif. Untuk buah-buahan maka peningkatan ukuran buah tentu saja akan meningkatkan secara langsung volume daging buahnya dan meningkatkan nilai ekonomi karena buah yang besar lebih disukai dibanding buah yang kecil.

Penciptaan tanaman mutan dengan perlakuan mutagen secara in vivo maupun seara in vitro baik modifikasi genetik random maupun modifikasi genetik terarah disamping merupakan bagian dari upaya peningkatan kualitas tanaman juga sangat bermanfaat untuk upaya peningkatan keanekaragaman hayati khususnya keanekaragaman tumbuhan baik tumbuhan budidaya (tanaman) maupun tumbuhan non budidaya agar mempunyai karakteristik fenotif yang lebih baik. Banyak zat kimia mutagen sudah dicoba selama ini bisa memberi tingkat mutasi relatif tinggi.

Teknik perlakuan mutagen pada bagian tanaman atau pada biji dengan ditetesi atau direndam sudah dilakukan atau perlakuan mutagen pada tanaman dengan cara diinjeksi belum banyak dilakukan tetapi perlakuan mutagen dengan variasi pelarut masih sangat terbatas padahal demikian banyak pelarut tersedia.

Tujuan menginduksi mutasi adalah untuk meningkatkan tingkat mutasi supaya dalam waktu singkat atau lebih singkat dalam upaya membuat varietas baru.

Berbagai keberhasilan sudah bisa dicapai melalui mutagenesis dengan berbagai jenis

9 mutagen khususnya mutagen kimia akan tetapi mutasi yang menguntungkan pada bagian tanaman yang dikonsumsi masih harus terus dilakukan. Pada kacang- kacangan tentunya perlu fokus pada ukuran polong, ukuran biji dan ketahanan tanaman terhadap hama dan penyakit tumbuhan.

Setelah perlakuan mutagen, parameter yang diukur pada tanaman mutan M1, tanaman mutan M2, dan tanaman mutan seterusnya selama ini lebih banyak fokus pada data-data unik seperti kekerdilan, perubahan bentuk daun, dan polong mutan yang bernilai secara akademis saja tapi kurang bernilai secara ekonomis. Seharusnya lebih fokus pada hasil mutasi yang menguntungkan atau menghasilkan karakteristik tanaman yang masuk katagori karakteristik lebih baik dari tanaman varietas asal seperti daun menjadi lebih tebal, butiran sereal menjadi lebih besar, kandungan nutrisi menjadi lebih lengkap dengan konsentrasi per satuan bahan lebih tinggi atau biji tanaman buah seperti mangga atau wani misalnya menjadi lebih kecil dan lainnya. Mengapa tanaman tahan hama penyakit tanaman tidak begitu banyak bisa dibuat selama ini?. Salah satu penyebabnya adalah umumnya teman-teman yang bekerja di bidang pemuliaan berangkat dari bidang ilmu agronomi. Jarang atau tidak ada dari bidang ilmu hama penyakit tanaman. Supaya bisa membuat tanaman tahan hama dan penyakit tanaman haruslah mempunyai penguasaan dan penghayatan yang luas dan dalam pada hama dan penyakit tanaman sehingga sudah saatnya tanaman tahan hama dan penyakit tanaman bisa dibuat di laboratorium-laboratorium hama dan penyakit tanaman.

10 II. MUTAGEN DAN MUTAGENESIS

2.1. Mutagen

Mutagen adalah substansi fisik atau kimia yang mampu mengubah materi genetik baik DNA, kromosom maupun genom atau bisa meningkatkan frekuensi mutasi dan umumnya merupakan substansi yang berbahaya bagi kesehatan manusia, ternak dan hewan piaraan. Mutagen yang berbahaya bagi manusia, binatang dan hewan piaraan dicobakan pada tanaman untuk upaya peningkatan kualitas tanaman.

Ada tiga katagori mutagen kimia yang selama ini dipakai untuk menginduksi mutagenesis pada tanaman yaitu mutagen analog basa, alkilator dan deaminator.

Disamping ketiga katagori mutagen tersebut diatas terdapat berbagai mutagen lain dengan cara kerja berbeda-beda. Berikut dibawah ini adalah daftar mutagen kimia yang sudah pernah dicoba efektivitasnya pada tanaman.

Sodium azida Kolkisin EMS Hidrogen

peroksida

Hidrazid maleat 2-aminopurin MMS Talidomida

Asam nitrit Akridin dye Etidium bromida Etilen oksida Akridin Akridin oranye Akriflavin Hidrazid malik Campuran

formaldehid dan asam nitrit

5-bromo-

dioksiuridin Hidroksilamin hidroklorid

Hidroksilamin Bromouracil Strepto-

zotocin dES Proflavin

Formal-

dehid NH2OH 1-3 Butadiene Dimetil

nitrosamin

Selain mutagen kimia, mutagenesis dengan mutagen fisik seperti sinar ultra violet, sinar laser dan nuklir juga sudah banyak diteliti. Penulis pernah mencoba perlakuan sinar rontgen dan juga sinar laser, masing-masing diperlakukan secara terpisah pada biji/benih tanaman cabai dan tomat, sayangnya waktu itu hasilnya tidak signifikan atau tidak terjadi perubahan secara fenotif.

11 2.1.1. Mutagen analog basa

Mutagen analog basa yang diklasifikasikan menjadi dua katagori yaitu analog purin dan analog pirimidin merupakan zat kimia berupa basa yang bisa masuk ke dalam sistem genetik tanaman dan mampu mengubah susunan basa DNA karena struktur kimianya sangat mirip dengan basa yang biasa ada pada DNA. Seperti timin, 5-bromouracil bisa berpasangan dengan adenin karena oleh sistem metabolisme tanaman 5-bromouracil ini dianggap timin oleh tanaman.

5-BromouracilTimin

Mutagen analog basa akan efektif menginduksi mutagenesis kalau tersedia pada saat terjadinya sintesis DNA khususnya pada tahapan replikasi DNA atau dengan kata lain paparan mutagen analog basa baru menimbulkan efek mutagenesis apabila paparan terjadi pada saat di dalam bagian tanaman yang diperlakukan sedang terjadi proses sintesis DNA. Terdapat berbagai jenis mutagen analog basa, salah satu mutagen analog basa yang umum dipakai dalam menginduksi mutagenesis pada tanaman adalah 5-bromo-dioksiuridin.

2.1.2. Mutagen alkilator

Seperti mutagen analog basa, mutagen alkilator juga menyebabkan kekeliruan dalam proses berpasangan antar basa dimana terjadi “mispairing”, hanya saja mutagen alkilator tidak harus bekerja pada saat terjadinya sintesis DNA. Itulah merupakan kelebihan dari mutagen alkilator dibandingkan dengan mutagen analog basa. Mutagen alkilator mempunyai kinerja kuat dan banyak dipakai untuk

12 menginduksi mutagenesis. Alkilator merupakan proses penambahan hidrokarbon pada suatu senyawa kimia atau disebut proses alkilasi. Alkilasi dengan penambahan satu karbon disebut metilasi (penambahan gugus metil). Proses alkilasi yang secara medis merusak sel kanker dalam upaya peningkatan kualitas tanaman dipakai untuk memodifikasi genetik tanaman melalui proses penginduksian mutagenesis pada tanaman.

Berbagai alkilator sudah ada saat ini seperti: 1) Etil metan sulfonat (EMS), 2) metan metil sulfonat (MMS) dan 3) dietilsulfat (DES). EMS bisa perubahan basa nitrogen timin menjadi guanin dan sebalikya.

Struktur kimia Etil Metan Sulfonat 2.1.3. Mutagen deaminator oksidatif

Mutagen deaminator oksidatif adalah merupakan mutagen yang dapat menyebabkan deaminasi yang bersifat oksidatif terhadap basa tertentu seperti asam nitrit (HNO2) yang melepaskan gugus amina dari adenin dan sitosin.Mutagen deaminator oksidatif juga mempunyai kemampuan menginduksi mutagenesis dengan cara mengubah adenin menjadi hipoksantin (adenin berpasangan dengan timin dan hipoksantin dengan sitosin), sitosin menjadi urasil (sitosin berpasangan dengan guanin dan urasil berpasangan dengan timin), dan mengubah guanin menjadi santin (keduanya berpasangan dengan sitosin). Asam nitrit langsung mengganggu proses penyandian jadi tidak perlu bekerja pada proses sintesis protein.

13 Deaminasi Sitosin menjadi Urasil

2.1.4. Kolkisin

Dalam bahasa Inggris zat ini mempunyai cukup banyak nama seperti:

colchicine, colchicina, colchicin, colchicum, colchique, condylon, colchicinum, dan colsaloid. Kemudian dibuat padanannya dalam bahasa Indonesia menjadi kolkisin, kolkhisin atau kolkisina. Dalam tulisan ini penulis memakai padanan yang paling sederhana yaitu kolkisin. Kolkisin dengan rumus molekul C₂₂H₂₅NO₆ mempunyai berat molekul 399, 437 gram/mol. Kolkisin merupakan alkaloid utama dari hasil ekstraksi tanamanColchicum autumnaleatau dari spesies Colchicum yang lain atau dari Gloriosa superba dan dari tanaman Coleus forskohlii. Kelarutan kolkisin adalah larut dalam air 10 mg/ml.

Colchicum autumnale (Sumber: Acta plantaraum)

14 Colchicum luteum (Always Ayurveda)

Gloriosa superba (Sumber: Wikipedia)

Coleus forskohlii (Sumber: Natural Stack)

Kolkisin merupakan senyawa alami yang bersifat toksik dan diproduksi oleh metabolisme tanaman dalam bentuk metabolit sekunder. Kolkisin yang dipasarkan

15 berbentuk tepung berwarna kuning pucat. Setelah dilarutkan dalam akuades warna larutannya akan bertambah gelap atau kelihatan keruh apabila kena sinar matahari langsung. Masa paruh waktu 3-5 tahun dan disarankan untuk disimpan dalam wadah kedap udara dan tidak terkena sinar matahari langsung. Kolkisin akan bersifat toksik bila tertelan, terhirup atau mengenai lensa mata (Sigma). Di Bidang pertanian, kolkisin banyak dipakai dalam membuat tanaman poliploid. Kolkisin menghambat segregasi kromosom pada saat meiosis berlangsung pada berbagai jenis tanaman (Borisy and Taylor, 1967).

Struktur kimia kolkisin

Tanaman poliploid setelah diperlakukan dengan kolkisin akan mempunyai ukuran organ vegetatif dan generatif lebih besar dan pertumbuhan lebih cepat (Ade and Rai, 2010). Di bidang pengobatan, kolkisin secara emperis dipakai sebagai obat komplementer dan dipercaya bisa membantu penyembuhan penyakit gout yang disebabkan oleh kandungan asam urat tinggi dalam darah dalam jangka waktu lama.

2.2. Mutagenesis

Mutagenesis merupakan pendekatan yang sangat menjanjikan keberhasilan dalam upaya menciptakan variabilitas genetik tanaman. Banyak negara tetap mengerjakan dengan serius upaya peningkatan kualitas tanaman dengan

16 menginduksi mutagenesis dengan mutagen dengan pertimbangan pengerjaannya sederhana dan tidak memerlukan biaya besar (Oladosu et al, 2016). Berbagai keberhasilan sudah dicapai dengan berhasil disebarluaskannya banyak varietas tanaman baru yang tidak bisa dibuat dengan teknik pemuliaan klasik. Hasil review yang dikemukakan oleh Parry et al., 2009 bahwa mutagenesis sangat potensial untuk upaya peningkatan kualitas tanaman dan hal senada juga disampaikan oleh Roychoduwry and Tah, 2016.

Aplikasi mutagenesis di bidang pertanian tidak hanya untuk upaya peningkatan kualitas tanaman saja. Parry et al., 2009 menyatakan bahwa manfaat mutagenesis yang juga sangat penting adalah untuk meningkatkan variabilitas yang novelty untuk meningkatkan biodiversitas tanaman budidaya. Kemajuan teknologi di bidang bioteknologi memungkinkan mengubah hanya karakteristik tertentu saja dari tanaman sesuai keinginan peneliti dan tujuan penelitian dengan teknik “site-directed mutagenesis” in vitro. Diperlukan fasilitas yang memadai untuk melakukan teknik itu dan memerlukan dukungan aplikasi teknik kultur jaringan. Ditemukannya teknik

“site-directed mutagenesis” in vitro bukan berarti teknik mutagenesis in vivo tidak diperlukan lagi, Chopra, 2005 mengingatkan bahwa teknik mutagenesis in vivo juga memberi banyak keuntungan seperti bisa memberi alil mutan dengan berbagai tingkatan modifikasi karakteristik. Hasil mutagenesis berupa mutasi terlihat (“viable mutation”) menurut Dhanavel et al., 2012 dibedakan menjadi dua yaitu mutasi makro dan mutasi mikro. Pada studi variabilitas kacang komak Parmar, 2013 disamping mendata parameter standar yang biasa didata pada penelitian mutagenesis, pada penelitiannya didata umur tanaman pada saat 50% tanaman sudah berbunga. Data ini mudah dikerjakan dan bisa dipakai untuk membandingkan umur

17 matang atau dewasa suatu tanaman disamping waktu munculnya bunga pertama kali pada setiap batang tanaman sampel.

Mutagenesis bisa menghasilkan mutasi frameshift dimana terjadi penambahan atau pengurangan basa pada rantai DNA satu atau lebih. Disebut mutasi frameshift karena penambahan atau pengurangan DNA terjadi pada potongan DNA yang akan ditranslasi membentuk protein.

Mutasi secara umum bisa diklasifikasikan menjadi dua grup yaitu mutasi makro dan mutasi mikro (Gananamurthy and Danavel, 2014). Mutasi makro adalah mutasi yang dengan mudah bisa dideteksi pada tanaman, perubahan fenotif yang terlihat sangat jelas, secara morfologis berbeda dengan varietas asal, dan secara kualitatif bersifat menurun (baka) serta perubahan gen yang menyebabkan mutasi makro terjadi pada gen mayor (utama). Mutasi mikro adalah sebaliknya hanya berupa perubahan kecil yang tidak signifikan hanya bisa dideteksi dengan bantuan statistic, dan perubahan gen terjadi pada gen minor.

2.3. Penelitian mutagenesis di Indonesia

Penelitian peningkatan kualitas tanaman di Indonesia banyak dilakukan di Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN). Soeranto dkk., 2001 menyimpulkan bahwa mutagenesis dengan mutagen fisik yaitu sinar gamma lebih efektif dan efisien dibandingkan dengan mutagen kimia (EMS). Syaifudin dkk, 2013 memperlakukan kolkisin pada kecambah cabai dengan teknik perendaman dan menemukan bahwa perlakuan kolkisin dengan konsentrasi 15 ppm optimal untuk meningkatkan jumlah buah dan berat buah basah. Pada kacang hijau, perlakuan kolkisin dengan kisaran konsentrasi 0,04%-0,16% menunjukkan pengaruh nyata negatif terhadap jumlah polong dan jumlah biji per polong (Sinaga, 2014). Hasil polong tertinggi pada

18 kontrol dan hasil polong terendah pada perlakuan kolkisin 0,16%. Hasil ini menunjukkan perlakuan kolkisin tidak selalu memberi pengaruh positif pada bagian reproduktif tanaman. Lebih lanjut penelitian pembuatan anggrek bulan poliploid dengan cara penetesan kolkisin pada pucuk bibit yang dilakukan oleh Rahayu dkk, 2015 menunjukkan bahwa penetesan 0,01 ml kolkisin 5000ml L^-1bisa menghasilkan 50% bibit tetraploid.

19 III. MENGINDUKSI MUTAGENESIS PADA TANAMAN

3.1. Mutagenesis untuk pembuatan tanaman resisten terhadap hama penyakit Tanaman

Tanaman resisten atau tanaman tahan hama penyakit tanaman merupakan satu aspek yang sangat penting dalam upaya pengendalian hama penyakit tumbuhan ramah lingkungan dan ketersediaan tanaman resisten akan sangat membantu petani dalam berkontribusi dalam mewujudkan dan kemudian mempertahankan ketahanan pangan. Pengendalian hama penyakit tanaman dengan memilih membudidayakan tanaman resisten merupakan pilihan yang sangat ramah lingkungan, pilihan murah dan tidak memerlukan keterampilan khusus, waktu dan tenaga banyak seperti pengendalian dengan pestisida misalnya. Tanaman yang tidak benar-benar resistenpun, tanaman yang hanya toleran saja terhadap hama dan penyakit tanaman tertentu pengaruhnya akan cukup besar membantu upaya menurunkan pemakaian pestisida mengingat membuat pestisida tersedia memerlukan biaya besar dan resiko penggunaannya sebagai racun terhadap manusia, ternak, hewan peliharaan, dan lingkungan abiotik sangat tinggi dan biaya yang diperlukan seandainya terjadi kasus keracunan dan kerusakan alam karena kontaminasi bahan aktif pestisida jauhlebih besar lagi.

Pembudidayaan tanaman resisten dan tanaman toleran terhadap hama dan penyakit tanaman tidak memberantas populasi hama sampai ke zero poin atau tidak ada sama sekali hanya akan menjaga supaya populasi hama berada dibawah garis ambang ekonomi. Menurut Kavitha and Reddy, 2012 tanaman resisten yang ada sekarang masih sangat kurang yang mempunyai ketahanan horizontal dan Khan et

20 al., 2009 menyatakan saat ini sodium azida banyak dipakai untuk memproduksi

tanaman tahan hama penyakit tanaman dari tanaman yang sebelumnya peka.

Skrining untuk menemukan tanaman tahan hama dan penyakit tanaman umumnya dilakukan di rumah kaca tetapi untuk mempercepat proses mendapatkan hasil berupa tanaman tahan skrining langsung di lapangan juga di lapangan untuk selanjutnya kemudian dilakukan “site tests” di beberapa lokasi oleh peneliti di bidang agronomi dan terakhir diuji di tingkat petani. Skrining di lapangan memang menyebabkan infestasi hama atau patogen tidak bisa dilakukan secara seragam tetapi di lapangan peningkatan jumlah tanaman yang diskrining bisa dilakukan atau ulangan bisa dibuat lebih banyak dibandingkan di rumah kaca dan kondisinya jauh lebih mendekati kondisi sebenarnya apabila tanaman uji ditanaman oleh petani.

Untuk meningkatkan keseragaman dan untuk meningkatkan reliabilitas uji beberapa upaya bisa dilakukan seperti:

1) Interplanting satu baris tanaman peka dengan 2 baris tanaman uji 2) Melakukan skrining di daerah endemi

3) Melakukan skrining pada musim serangan

3.2. Pengaruh Etil Metil Sulfonat (EMS) pada tanaman

Pada umumnya respon mahluk hidup terhadap zat kimia termasuk terhadap mutagen berbeda-beda dari individu ke individu lain, dari varietas ke varietas lain dan dengan demikian maka pengaruh mutagen akan berbeda-beda pada setiap individu tanaman dan pengaruh mutagen tentu saja juga dipengaruhi oleh banyak kondisi diluar tanaman. Shah et al., 2011 menyampaikan kesimpulan dari hasil penelitian perlakuan sinar gamma dan EMS secara sendiri-sendiri pada kacang arab (Cicer arietinum) bahwa antar kedua mutagen dan antar dosis dari mutagen masing-

21 masing menunjukkan frekuensi mutasi morfologis yang berbeda. Hal yang sama juga disimpulkan oleh Wani, 2011 hasil pengamatannya juga pada kacang arab yang diperlakukan dengan sinar gamma dan EMS dengan berbagai dosis perlakuan.

Jabeen and Mirza, 2004 melaporkan dengan EMS bisa membuat mutan cabai dengan perubahan morfologis seperti perubahan bentuk daun, perubahan luas daun, simetri bunga, tanaman kerdil, biji steril, pembungaan lebih cepat atau pembungaan lebih lambat dibanding varietas asal. Gnanamurthy and Dhanavel, 2014 berdasarkan pada hasil penelitiannya menyampaikan pengaruh EMS pada kacang tunggak adalah mutan morfologis seperti tanaman kerdil, tanaman lebih tinggi dari normal, matang lebih awal, matang terlambat, mutan klorofil, mutan daun, mutan bunga, dan mutan polong. Perlakuan biji kacang tunggak masing-masing dengan sinar gamma atau EMS menunjukkan hasil dengan frekuensi terbaik berupa perubahan warna bunga dan perubahan ukuran biji pada konsentrasi 25mM (Girija et al., 2013). Pada umumnya semakin tinggi konsentrasi perlakuan mutagen akan menyebabkan efektivitas dan efisiensinya menurun. Penelitian yang membandingkan efektivitas antar tiga mutagen yaitu EMS, Diethyl Sulphate (DES), dan natrium azida dilakukan oleh Dhanavel, 2008 dengan kesimpulan bahwa EMS menunjukkan efektivitas tertinggi. Perlakuan dengan dosis 4mM, 8mM, dan 16mM EMS pada tomat menurut Akhtar, 2014 tidak berpengaruh letal dan tomat mutan bisa tumbuh sampai menghasilkan buah. Tentu saja berbagai pertimbangan perlu dipakai acuan dalam memutuskan pilihan mutagen yang hendak dipakai tetapi pada prinsipnya harus dicoba satu-satu dan berlanjut sampai mendapat karakteristik tanaman yang diinginkan.

22 Menurut Mba et al., 2010 dari pengalamannya bekerja dengan EMS bahwa semakin tinggi konsentrasi EMS yang diperlakukan akan menghasilkan lebih banyak mutasi tetapi efek letal dan kerusakan sel atau jaringan bagian tanaman yang diperlakukan juga sangat banyak. Pada wijen, LD50 EMS 1% dan LD50 kolkisin 0,6% (Anbarasan et al., 2014) menunjukkan secara umum EMS lebih toksik terhadap benih wijen dibandingkan dengan kolkisin. Dinyatakannya juga bahwa EMS lebih efektif membentuk tanaman mutan dibanding kolkisin dan Gnanamurthy et al., 2012 berdasarkan hasil penelitiannya menginformasikan bahwa pada jagung

LD50 EMS adalah 50mM sedangkan LD50 DES dan SA sama yaitu 40mM.

Kombinasi mutagen fisik dan mutagen kimia yaitu sinar gamma dan EMS bisa memberikan ferekuensi yang lebih tinggi dan spektrum mutasi yang lebih lebar dibanding kalau diperlakukan sendiri-sendiri secara terpisah (Bind and Dwivedi, 2014). Perlakuan EMS untuk menginduksi mutagenesis secara umum lebih banyak menghasilkan mutasi morfologis dibandingkan dengan menggunakan sinar gamma (Sri Devi and Mullainathan, 2011). Disampaikannya bahwa perlakuan dengan EMS 30mM efektif menginduksi mutan yang diinginkan dan frekuensinya tertinggi dibandingkan konsentrasi lain diantara konsentrasi 10mM sampai 50mM.

3.3. Pengaruh sinar gamma pada tanaman

Penelitian mutagenesis pada kacang tunggak lebih banyak memakai sinar gamma yang sekarang lagi ngetren dan etil metan sulfonat (EMS) karena variasi pengaruhnya pada semua bagian tanaman lebih bervariasi, serta ada juga sedikit penelitian memakai mutagen natrium azida. Perlakuan sinar gamma dan EMS pada biji kacang tunggak bisa mengubah warna bunga, ukuran, bentuk dan warna biji serta frekuensi mutasi tertinggi diperoleh dengan perlakuan 25mM EMS. Adekola

23 and Oluleye, 2007 sudah mencoba perlakuan sinar gamma di Nigeria dengan hasil mutan polong berwarna hijau tua, polong bengkok, dan polong berbulu.

Monica and Seetaraman, 2016 melakukan penelitian mutagenesis pada kacang komak ungu Lablab purpureus var. typicus. dengan sinar gamma dan kolkisin secara terpisah serta menginformasikan hasilnya bahwa LD50 sinar gamma adalah 25 Kilo Rontgen dan kolkisin 30 mM. Jabeen and Mirza, 2004 menyampaikan EMS menginduksi mutasi morfologis pada cabai dengan perubahan seperti mutan kerdil, biji steril, matang awal, dan matang terlambat. Mullainathan and Aruldoss, 2015 meneliti pengaruh sinar gamma pada cabai dan menemukan pengaruhnya yaitu tanaman kerdil, tinggi, bercabang banyak (“bushy”), biji steril dan polong mutan pada M2. Sinar gamma juga bisa meningkatkan jumlah polong dan jumlah biji kacang hijau (Khan and Goyal, 2009). Hasil mutagenesis dengan mutagen fisik sinar gamma pada ginseng India (Withania somnifora) yang dilakukan oleh Bharathi et al., 2013 menunjukkan bahwa perlakuan dengan dosis 5KR memberi jumlah buah

tertinggi dan terendah pada dosis 50KR. Demikian juga pengaruh perlakuan sinar gamma pada biji, perlakuan dosis lebih rendah menghasilkan biji lebih banyak.

Seperti perlakuan mutagen pada umumnya perlakuan dosis tinggi akan menghasilkan lebih banyak mutan dan dosis lebih rendah menghasilkan tanaman mutan lebih sedikit tetapi lebih banyak mempunyai karakteristik yang menguntungkan. Pada tomat hanya perlakuan dengan dosis sinar gamma rendah (5KR) tidak berpengaruh letal dan menghasilkan buah (Akhtar, 2014).

Gunasekaran and Pavadai, 2015 berdasarkan pada hasil penelitiannya menyatakan bahwa perlakuan 10, 20, 30, 40, 50 dan 60KR sinar gamma menurunkan semua parameter morfologis tanaman kacang tanah yang diperlakukan

24 kecuali waktu pembungaan pada M1 tetapi kemudian meningkatkan komponen hasil pada M1, M2 dan M3. Makeen and Suresh Babu, 2010 mengkombinasikan sinar gamma dan sodium azide pada tanaman kacang mungo menemukan bahwa dengan kombiansi kedua mutagen fisik dan mutagen kimia tersebut, frekuensi mutasi meningkat dibanding apabila diperlakukan satu demi satu. Hasil kombinasi dua mutagen ini merupakan suatu petunjuk berarti bagi penelitian mutagenesis selanjutnya bahwa pengkombinasian dua mutagen atau lebih kemungkinan akan bisa meningkatkan keberhasilan upaya meningkatkan kualitas tanaman melalui induksi mutagenesis.

3.4. Pengaruh kolkisin pada tanaman

Penelitian mutagenesis pada tanaman dengan kolkisin sudah dimulai sejak tahun 1940, tahun pada mana kolkisin ditemukan dan kemudian diketahui mempunyai pengaruh menggandakan kromosom atau menjadikan tanaman poliploid. Berbagai penelitian dengan kolkisin untuk peningkatan kualitas tanaman kemudian dilakukan di seluruh belahan dunia sejak saat itu dan sampai sekarang masih terus dilakukan.

Poliploidi bisa menyebabkan reorganisasi genom skala besar dan selanjutnya menyebabkan terjadinya berbagai perubahan fenotif baik pada bagian tanaman vegetatif maupun generatif (Amiri et al., 2010) atau lebih detailnya dari hasil penelitiannya dinyatakan bahwa perlakuan trifluralin dan kolkisin menurunkan tinggi tanaman dan jumlah daun per cabang tetapi meningkatkan jumlah cabang, jumlah daun per tanaman, berat daun kering dan kandungan klorofil. Penelitian peningkatan kualitas pada berbagai jenis tanaman termasuk selama ini lebih banyak berkutetan pada perlakuan benih sampai menjadi bibit atau perlakuan bibit untuk kemudian diamati sel, stomatanya dan atau kromosomnya. Penelitian sampai pada

25 tahapan bibit saja memang lebih cepat dan resiko kegagalan pelaksanaan penelitian lebih rendah. Waktu dan tenaga yang diperlukan juga lebih sedikit. Penelitian perlakuan mutagen pada serangan hama dan penyakit tanaman sampai panen dan fokus pada bagian tanaman dan hasil akhir yang dikonsumsi, tidak begitu banyak.

Pengaruh perlakuan kolkisin pada kacang tunggak menurut publikasi hasil penelitian Dheer et al., 2014 yang mana dilakukan pada kacang komak polong hijau (Lablab purpureusvarietas Purpureus) pengamatan sitomorfologis pada bibit kacang tunggak setelah diperlakukan kolkisin dengan pelarut air metode “cotton swab”

adalah daun kacang tunggak mutan lebih lebar, lebih panjang dan lebih tebal dan menurutnya tantangan utama yang dihadapi adalah menemukan teknik yang tepat yaitu efektif dan efisien untuk menginduksi mutagenesis dan bisa menghasilkan tanaman mutan dengan karakterisik yang diinginkan. Selanjutnya disampaikannya juga bahwa karakteristik mutan setelah perlakuan kolkisin tidak sepenuhnya diwariskan. Hal ini merupakan sesuatu yang menjadi tantangan ke depan. Essel et al, 2015 menyampaikan hasil penelitiannya memperlakukan mutagen kolkisin dengan konsentrasi 0,05g/dl, 0,1g/dl, dan 0,2g/dl pada kacang tunggak di Kanada dengan mendata karakter kuantitatif seperti persentase perkecambahan, tinggi tanaman, jumlah daun, panjang cabang terpanjang, jumlah cabang primer, jumlah polong dan biji. Disimpulkannya bahwa dengan perlakuan kolkisin, tanaman menjadi bertambah besar, percabangan dan jumlah daun menjadi bertambah banyak. Ketiga konsentrasi menyebabkan terjadinya mutasi dan berbeda nyata. Itu berarti uji dengan perlakuan kolkisin dengan konsentrasi dibawah 0,05g/dl masih perlu dilakukan. Hasil penelitian perlakuan mutagen kolkisin pada anggrek bulan atau anggrek ngengat (“moth orchid”) oleh Azmi et al., 2016 menunjukkan hasil bahwa perlakuan kolkisin

26 50mg/L dan 500mg/L menghasilkan masing-masing 60% dan 100% bibit mutan.

Pengaruh perlakuan kolkisin pada polong kacang tunggak dipublikasikan oleh Egbadzor et al., 2012 yang menyatakan terjadi perubahan warna polong menjadi ungu pada bagian ujung polong.

3.5. Pengaruh natrium azida pada tanaman

Perlakuan natrium azida untuk menginduksi mutagenesis pada tanaman umumnya menyebabkan terjadinya mutasi titik yaitu perubahan pada basa nitrogen dalam variasi pasangan basa nitrogen kombinasi A-TG-C (Al-Qurainy and Khan, 2009). Perlakuan natrium azida dan kolkisin pada wijen dilakukan oleh Mensah et al., 2007 melaporkan LD50 natrium azida dan kolkisin masing-masing adalah

0,0776% dan 0,0473%. Disampaikannya juga bahwa perlakuan natrium azida menurunkan persentase perkecambahan, tinggi tanaman, jumlah daun per tanaman tetapi meningkatkan luas daun, pembungaan pertama dan ukuran buah. Disamping itu dinyatakannya perlakuan kolkisin memperpendek jarak antar buku, perubahan bentuk daun dan mutan klorofil.

27 KESIMPULAN

1) Pemahaman tentang mutagen sangat perlu sebelum memulai penelitian mutagenesis pada tanaman

2) Kegiatan penelitian mutagenesis pada tanaman sangat banyak dilakukan di negara lain tapi di Indonesia masih perlu ditingkatkan baik frukuensi maupun kualitasnya.

3) Mutagenesis pada tanaman sangat menjanjikan untuk menghasilkan tanaman mutan dengan karakteristik yang unggul

4) Bekerja dengan mutagen memang mempunyai resiko bahaya tetapi apabila sudah mempunyai latar belakang keilmuan yang sesuai dan sudah terbiasa bekerja dengan zat kimia maka resiko tersebut akan terminimasi.

28 SARAN

1. Penelitian mutagenesis pada tanaman dengan memakai ekstrak bahan tanaman yang kemungkinan bisa menginduksi mutagenesis masih belum banyak dilakukan dan merupakan cara untuk menanggulangi harga yang relatif mahal dan proses pembeliannya perlu waktu.

2. Mengingat masih ada ketidakjelasan atau pengakuan tentang apakah bidang ilmu lain selain konsentrasi Agronomi dan Hortikultura berhak melakukan kegiatan peningkatan kualitas tanaman seperti konsentrasi Bioteknologi Pertanian atau Fakultas MIPA Biologi maka perihal tersebut perlu dituangkan dalam bentuk tertulis supaya semuanya bisa bekerja dengan nyaman.

29 DAFTAR PUSTAKA

Adekola O.F. and F. Oluleye. 2007. Induction of genetic variation in Cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) by gamma radiation. Asian J. Plant. Sci. 6(5): 689-873.

Ade Ravindra and Mahendra Kumar Rai. 2010. Review: Colchicine, current advances and future prospects. Bioscience 2(2): 90-96.

Akhtar Naheed. 2014. Effect of physical and chemical mutagens on morphological behavior of tomato (Lycopersicon esculentum L.) CV. “Rio Grande” under heat stress conditions. Scholarly J. Agric. Sci. 4(6): 350-355.

Al-Qurainy Fahad and Salim Khan. 2009. Mutagenic effect of sodium azide and its application in crop improvement. World App. Sci. J. 6(12): 1589-1601.

Amiri S., S. K. Kazemitabahaar, G.Ranjbar and M.Azadbakht. 2010. The effect of trifluralin and colchicine treatments on morphological characteristics of jimsonweed (Datura stramonium L.). Trakia J. Sci 8(4): 47-61.

Ambavane A. R., S.V. Sawardekar, S. A. Sawantdesai and N. B. Gokhale. 2014.

Studies on mutagenic effectiveness and efficiency of gamma rays and its effect on quantitative traits in finger millet (Eleucine coracana L. Gaertn). J. Rad. Res. and App. Sci.:121-124.

Anbarasan K., R. Rajendran, D. Sivalingam and AL. C. Chidambaram. 2014.

Studies on the effect of EMS and colchicine in M1 generation of sesame (Sesamum indicum L.) var. TMV3. Intern. Letter Nat. Sci. 11(2): 209-214.

Auti G. Sanjay. 2012. Induced morphological and quantitative mutation in mungbean. Bioremediation, Biodiversity and Bioavailability 6:27-39.

Azmi T.K.K., D. Sukma, S.A. Aziz and M. Syukur. 2016. Polyploidy induction of moth orchid (Phalaenopsis amabilis (L.) Blume) by colchicine treatment on pollinated flowers. J. Agric. Sci. 11(2): 62-73.

Borisy G.G. and E.W. Taylor. 1967. The mechanism of action of colchicine. J. Cell Bio 34: 525-533.

Bharathi T., Gnanamurthy S., D. Dhanavel, S. Murugan and M. Ariraman. 2013.

Induced physical mutagenesis on seed germination, lethal dosage and morphological mutans of ashwagandha (Withania somnifera L. Dunal). Intern. J. Adv. Res. 1(5):

136-141.

Bind Devmani and V. K. Dwivedi. 2014. Effect of mutagenesis on germination, plant survival and pollen sterility in M1 generation of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp). Indian J. Agric. Res. 48(5): 398-401.

Chopra V. L. 2005. Mutagenesis; Investigating the process and processing the outcome for crop improvement. Current Science 89(2).

Dhanavel D., P. Pavadai, L. Mullainathan, D. Mohana, G. Raju, M. Girija and C.

Thilagavathi. 2008. Effectiveness and efficiency of chemical mutagens in cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) (Short Communication). African J. Biotechnology 7(22): 4116-4117.

30 Dheer Meenaksi, Ram Avatar Sharma, Ved Prakas Gupta and Sumer Singh Punia.

2014. Cytomorphological investigation in colchicine-induced poliploids of Lablab purpureus (L) Sweet. Indian J. Biotech13:347-355.

Egbadzor, K.F., I. Amoako-Attah, E.Y. Danquah., S.K. Offei, K. Ofori, and Ofopu- Agyeman, M.O. 2012. Relationship between flower, immature pod pigmentation and seed testa of cowpea. Int. J.Biodivers. Conserv. 4(12): 411-415.

Essel Eunice, Issac K. Asante and Ebenezer Laing. 2015. Effect of colchicine treatment on seed germination, plant growth and yield traits of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp). Canadian J. Pure App. Sci. 9(3):3573-3576.

Girija M., Dhanavel D. and Gnanamurthy S. 2013. Gamma rays and EMS induced flower color and seed mutants in cowpea (Vigna unguiculata L. Walp). Adv. Appl.

Sci. Res. 4(2): 134-139.

Gnanamurthy S. and D. Dhanavel. 2014. Effect of EMS on induced morphological mutants and chromosomal variation in cowpea (Vigna unguiculata L. Walp). Intern.

Let. Nat.sci.22:33-43.

Gnanamurthy S., Dhanavel D., Girija M., Pavadai P. and Bharathi T. 2012. Effect of chemical mutagenesis on quantitative traits of maize (Zea mays L.). Intrn. J. Res.

Bot. 2(4):34-36.

Gunasekaran A. and P. Pavadai. 2015. Effect of gamma rays on germination, morphology, yield and biochemical studies in groundnut (Arachis hypogaea L.).

World scientific news 23:13-23.

Jabeen Nyla and Bushra Mirza. 2004. Ethylene methane sulfonate induced changes in Capsicum annuum. Int. J. Agric., Biol. 6(2).

Jain S. Mohan. 2010. Mutagenesis in crop improvement under the climate change.

Romanian biotechnological letters 15(2).

Kavitha K. and K. Dharma Reddy. 2012. Screening techniques for different insect pests in crop plants. Intern. Bio. Resc.Stress Manag. 3(2):18-195.

Khan Salim, Fahad Al-Qurainy and Firoz Anwar. 2009. Sodium azide: a chemical mutagen for enhancement of agronomic traits of crop plants. Environ. We. Int. J.

Sci. Tech. 4: 1-21.

Khan Samiullah and Sonu Goyal. 2009. Improvement of mungbean varieties through induced mutations. African J. Plant. Sci. 3(8):174-10.

Mba Chikelu, Rownak Afza, Souleymane Bado and Shri Mohan Jain. 2010. Induced mutagenesis in plants using physical and chemical agents (Chapter 7) in Plant cell culture: essential methods (Eds: Michael R. Davey and Paul Anthony). Jhon Wiley and Sons, Ltd.

Makeen Kousar and G. Suresh Babu. 2010. Mutageneic effectiveness and efficiency of gamma rays, sodium azide and their synergic effects in urd bean (Vigna mungo L.). World J. Agric. Sci. 6(2): 234-237.

31 Mensah J.K., Obadoni B.O., Akomeah P.A. Ikhajiagbe B. and Ajibolu Janet. 2007.

The effects of sodium azide and colchicine treatments on morphological and yield traits of sesame seed (Sesame indicum L.). African J. Biotech. 6(5):534-538.

Monica S. and N. Seetaraman. 2016. Effect of gamma irradiation and ethyl metahane Sulphonate (EMS) mutagenesis in early generation of garden bean Lablab purpureus L. Sweet var, typicus. Intern. J. Adv. Sci. Tech. Res. 6(3):398-410.

Moura de Sousa A. Jorge, Paulo R.A. Campos and Isabel Gordo. 2013. An ABC method for evaluating the rate and distribution of effect of beneficial mutations.

Genom Bio. Evol. 5(5):794-806.

Mullainathan and T. Aruldoss. 2015. Effect of gamma rays in induced morphological mutants on M2 generation of chilli (Capsicum annuum L.) var. K1.

Intern. J. Nat. Sci. 3:19-24.

Nair Reena and A.K. Mehta. 2014. Induced mutagenesis in cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) var. arka garima. Indian J. Agric., Res. 48(4): 247-257.

Oladosu Yusuff, Mohd. Y. Rafii, Norhani Abdullah, Ghazali Hussin, Asfaliza, Ramli, Harun A. Rahim, Gous Miah and Magaji Usman. 2016. Principle and application of plant mutagenesis in crop improvement: a review. Biotechnology and biotechnological equipment 30(1): 1-16.

Parmar A. M., A. P. Singh, N. P. S. Dillon and M. Jamwal. 2013. Genetic variability of morphological and yield traits in dolichos bean (Lablab purpureus L.). African J.

Agric. Res. 8(12): 1022-1027.

Parry A. J. Martin, Pippa J. Madgwick, Carlos Bayon, Katie Tearall, Antonio Hermandes lopez, Marcelo Baudo, Mariann Rakszegi, Walid Hamada, Adnan Al- Yassin, Hassan Auabbou, Mustapa Labhilili and Andrews L. Phillips. 2009.

Mutation discovery for crop improvement. J. Exp. Bot. 60(10):2817-2825.

Rahayu E. M. Della, Dewi Sukma, M. Syukur, Sandra A. Aziz dan Irawati. 2015.

Induksi poliploidi menggunakan kolkisin secara in vivo pada bibit anggrek bulan (Phalaenopsis amabilis (L.) Blum). Buletin Kebun Raya 1(1): 41-48.

Ranjan Tah Priya. 2006. Induced macromutation in mungbean (Vigna radiata, L.

Wilczek.). Int. J. Bot. 2(3):219-288.

Rizwan Muhammad, Sajjad Akhtar, Muhammad Aslam and Muhammad Jawad Asghar. 2015. Development of herbicide resistant crops through induced mutations.

Advancement in life sciences 3(1): 01-08.

Roychowdhury Rajib and Jagatpati Tah. 2016. Mutagenesis–A potential approach for crop improvement in K. R. Hakeem et al.(Eds.): Crop Improvement. Springer Science.

Shah Tariq Mahmud, Babar Manzoor Atta, Javed Iqbal Mirza and Muhammad Ashanul Haq. 2011. Induced genetic variability chickpea (Cicer arietinum L.) III.

Frequency of morphological mutations. Pak. J. Bot. 43(4):2039-2043.

Sinaga Eka Julianti, Eva Sartini Bayu dan Hasmawi Hasyim. 2014. Pengaruh konsentrasi kolkisin terhadap pertumbuhan dan produksi kacang hijau. J.

Agroekotek. 2(3): 1238-1244.

32 Sri Devi A and L. Mullainathan. 2011. Physical and chemical mutagenesis for improvement of chili (Capsicum annuum L.). World App. Sci. J. 15(1): 10-113.

Soeranto, H. Simon Manurung, Masrizal, Ismachin, Riyanti, Mugiono, Ismiati, Ishak, Dameria, Ita and Dewi. 2003. The use of physical/chemical mutagens for crop improvements in Indonesia. Center for research and development of isotopes and radiation technology.

Syaifudin Achmad, Evie Ratnasari dan Isnawati. 2013. Pengaruh pemberian berbagai konsentrasi kolkhisin terhadap pertumbuhan dan produksi tanaman cabai (Capsicum annuum) varietas Lado F1. LenteraBio 2(2): 167-171.

Wani A. Aijaz. 2011. Spectrum and frequency of macromutions induced in chickpea (Cicer arietinum L.). Turk. J. Biol. 35:221-231.