METODE PENELITIAN
3.1Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:
- Rotari Evaporator Heidolph WB 2000
- Gelas ukur Pyrex - Rak tabung reaksi - Blender
- Lemari pendingin Toshiba
- Pipet mikro Eppendorf
- Jarum ose - Cawan petri
- Inkubator Fiber Scientific
- Kertas cakram - Bunsen - Jangka sorong
- Pinset - Kuvet - Labu takar
- Neraca analitis Mettler AE 200
3.2Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
- Buah keben
- Dimethyl sulfoxide (DMSO) - Nutrient Broth (NB)
- Nutrient Agar (NA)
- Mueller Hinton Agar (MHA) - Biakan Staphylococcus aureus
- Biakan Escherichia coli
3.3Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel
3.3.2 Skrining Fitokimia Kulit Buah Keben
Dipotong kecil-kecil kulit buah keben segar sebanyak 50 gram, kemudian dipanaskan pada waterbath hingga diperoleh ekstraknya. Ekstrak yang diperoleh dilakukan uji skrining dengan beberapa tahap uji sebagai berikut:
3.3.2.1 Uji Tanin
Ekstrak Metanol kulit buah keben dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan FeCl3 5%, jika terbentuk larutan berwarna hitam
maka positif mengandung tannin.
3.3.2.2 Uji Terpenoida
Ekstrak metanol kulit buah keben diteteskan pada plate klomatorgrafi lapis tipis ditambahkan CeSO4 1% Kemudian panaskan, jika terbentuk
warna merah kecoklatan maka positif mengandung terpenoida.
3.3.2.3 Uji Alkaloida
Ektrak metanol kulit buah keben dimasukkan dalam 3 tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Bouchardat, jika terbentuk endapan coklat maka positif mengandung alkaloida. Tabung II ditetesi pereaksi Meyer, jika terbentuk endapan putih, maka positif mengandung alkaloida. Tabung III ditetesi pereaksi Dragendorf, jika terbentuk endapan jingga, maka positf mengandung alkaloida.
3.3.2.4 Uji Saponin
Ekstrak metanol kulit buah keben dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml aquadest, kemudian dikocok kuat-kuat. Jika terbentuk busa maka positif mengandung saponin.
3.3.2.5Uji Flavonoida
Ekstrak metanol kulit buah keben dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan etil asetat dan peraksi FeCl3, jika terbentuk larutan warna
3.3.3 Ekstraksi Kulit Buah Keben
Serbuk kulit buah keben ditimbang sebanyak 350 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 4 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak metanol kulit buah keben. Ekstrak metanol kulit buah keben di pekatkan diatas penangas air sehingga diperoleh ekstrak padat metanol. Ekstrak padat metanol yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan etil asetat hingga terbentuk endapan dan ekstrak etil asetat. Endapan dipisahkan (tidak dilanjutkan) dan diuji pada pereaksi untuk identifikasi senyawa tanin positif, dilanjutkan dengan uji antibakteri terhadap bakteri S. aureus, dan E. coli.
Ekstrak etil asetat dipekatkan dengan menggunakan penangas air sehingga diperoleh ekstrak padat etil asetat, ekstrak padat yang diperoleh diuapkan hingga semua etil asetat menguap. Ekstrak padat tersebut dilarutkan dengan metanol dan dipartisi dengan n-heksana hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah yaitu etil asetat dan lapisan atas yaitu n-heksana. Partisi dilakukan kembali secara berulang-ulang menggunakan pelarut n-heksana sampai lapisan n-heksana bening dan ekstrak etil asetat yang diperoleh memberikan hasil uji yang positif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid.
Ekstrak etil asetat dan n-heksana dipekatkan kembali dengan penangas air hingga diperoleh ekstrak padat etil asetat dan ekstrak padat n-heksana. Ekstrak padat etil asetat dan n-heksana dilanjutkan dengan uji antibakteri terhadap bakteri S. aureus dan E. coli.
3.3.4 Uji Antibakteri Ekstrak Etil Asetat, Metanol, dan n-Heksana Kulit Buah Keben
3.3.4.1Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
3.3.4.2Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri
Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar
steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut 30-450. Biakkan bakteri staphylococcus aureus
dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasi pada permukaan media nutrient agar miring denggan cara menggores, kemudian diinkubasi pada suhu 35 0C selama 18-24 jam. Hal sama juga dilakukan pada biakan bakteri Escherichia coli.
3.3.4.3Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Sebanyak 10,2 g serbuk mueller hinton agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 300 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.
3.3.4.4Pembuatan Inokulum Bakteri
Sebanyak 3,25 g nutrient broth (NB) dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlenmeyer dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih, kemudian disterilkan diautoklaf 1210C selama 15 menit dan didinginkan. Lalu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan kedalam 10 ml media nutrient broth steril dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 35oC selama ± 3 jam, lalu dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan standar Mc Farland. Hal yang sama juga dilakukan untuk koloni bakteri
Escherichia coli.
3.3.4.5Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksana Kulit Buah Keben
Ekstrak metanol, etil asetat, dan n-Heksan ditimbang 500 mg kemudian dilarutkan dengan 1 ml DMSO, konsentrasi ekstrak sama dengan 500 mg/ml. kemudian dari konsentrasi 500 mg/ml dengan rumus pengenceran V1 . C1 = V2 . C2 dihitung untuk konsentrasi 400 mg/l, 300 mg/ml, 200
3.3.4.6Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat, Metanol, dan n-Heksana Kulit Buah Keben
3.4 Bagan Penelitian
3.4.1 Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben
Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben
dimasukkan kedalam tabung reaksi secukupnya
ditambahkan pereaksi untuk masing-masing uji
3.4.2 Ekstraksi Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksana Kulit Buah Keben 350 gr Serbuk Kulit Buah Keben
dimaserasi dengan metanol sebanyak 4 L
didiamkan selama ± 24 jam
disaring
Yang Tidak Larut Dalam Etil Asetat (Ekstrak Padat Metanol)
dipartisi dengan n-Heksan
Larutan Metanol Yang Mengandung
Ekstrak Etil Asetat Larutan n-Heksan
3.4.3 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksana Pada Kulit Buah Keben
3.4.3.1Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
10,2 g Media Mueller Hinton Agar (MHA)
dilarutkan dengan 300 ml aquadest dalam erlenmeyer dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210c selama 15 menit
Media Mueller Hinton Agar (MHA) Steril
3.4.3.2Pembuatan Media Nutrient Agar (NA), Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri
7 g Media Nutrient Agar (NA)
dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlenmeyer dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit
Media Nutrient Agar (NA) Steril
dituangkan sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi
dibiarkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudu 30-450C
diambil biakan bakteri S.aureus dari Strain utama dengan jarumose lalu digoreskan pada media nutrient agar yang telah memadat
diinkubasi pada suhu 350C selama 18-24 jam
Stok Kultur Bakteri Staphylococcus aureus
3.4.3.3Penyiapan Inokulum Bakteri
3,25 g Media Nutrient Broth (NB)
dilarutkan dengan 250 ml aquadest kedalam erlenmeyer
dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan memdidih
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15
menit
Media Nutrient Broth (NB) Steril
dimasukkan sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi
diambil koloni bakteri S. aureus dari stok kultur bakteri
dengan jarum ose
disuspensikan kedalam Nutrient Broth (NB)
diinkubasi pada suhu 350C selama 3 jam
dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan Mc farland
Inokulum Bakteri Sthaphylococcus
aureus
(108 CFU/ml)
3.4.3.4Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-heksan Pada Kulit Buah Keben
Inokulum Bakteri
dimasukkan media MHA kedalam cawan petri steril dengan suhu 45-500C
dibiarkan sampai memadat
diambil cotton bad steril, lalu dicelupkan kedalam inokulum bakteri
digoreskan ke media MHA yang telah memadat
dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak metanol, etil asetat, dan n-Heksan kulit buah keben dengan berbagai konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri
diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 350C
diukur diameter zona bening disekitar cakram dengan jangka sorong
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
4.1.1 Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben
Ekstrak metanol kulit buah keben yang diperoleh diuji skrining fitokimia untuk mengetahui adanya golongan senyawa alkaloida, flavonoida, tanin, saponin dan terpenoida yang ditunjukkan pada tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben
No Parameter Pereaksi Hasil
1 Alkaloida Dragendorf
-Bouchardat
-Meyer
-Wagner
-2 Flavonoida FeCl3 +
3 Terpenoida CeSO41% +
4 Saponin Aquadest -
5 Tanin FeCl3 5% +
Keterangan :
4.1.2 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n- Heksana pada Kulit Buah Keben
Uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana kulit buah keben menunjukkan zona hambat pada pertumbuhan beberapa bakteri yaitu
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
Hal ini dapat dilihat dari hasil pengukuran diameter zona bening yang terbentuk, yaitu berupa wilayah bening disekeliling kertas cakram yang mengandung ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana kulit buah keben yang dapat dilihat pada gambar dibawah ini
Gambar 4.1 Zona hambat bakteri Staphylococcus aureus Ekstrak Metanol
Gambar 4.3 Zona hambat bakteri Staphylococcus aureus Ekstrak Etil Asetat
Gambar 4.5 Zona hambat bakteri Staphylococcus aureus Ekstrak n-Heksana
Hasil pengukuran diameter zona bening aktivitas antibakteri ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana kulit buah keben terhadap bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dapat dilihat pada tabel 4.2 berikut ini:
Tabel 4.2.Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kulit Buah Keben
Diameter Zona Hambat (mm) Konsentrasi
mg/ml
Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat Estrak n-Heksana
E. coli S. aureus E. coli S. aureus E.coli S.aureus
Blanko = Kertas cakram direndam dengan DMSO
4.2 Pembahasan
4.2.1 Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben
Skrining fitokimia merupakan tahap pendahuluan dari suatu penelitian yang bertujuan untuk memberikan gambaran tentang golongan senyawa yang terkandung dalam tumbuhan (Kristansti, dkk, 2008). Berdasarkan hasil skrining fitokimia golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol kulit buah keben adalah terpenoida, flavonoida, dan tanin.
Berdasarkan Tabel 4.1 Hasil skrining fitokimia ekstrak metanol kulit buah keben mengandung golongan senyawa terpenoida, flavonoida, dan tanin yang dapat ditarik dalam pelarut metanol, hal ini disebabkan karena metanol memiliki gugus polar (-OH) dan gugus non polar (-CH3) sehingga dapat menarik
Uji flavonoida pada ekstrak metanol kulit buah keben dengan penambahan FeCl3. Pada pengujian flavonoida dari ekstrak metanol kulit buah keben
menyebabkan perubahan warna menjadi kuning kemerahan sehingga positif mengandung flavinoida. Flavonoida mempunyai tipe yang beragam dan terdapat dalam bentuk bebas (aglikon) maupun terikat sebagai glikosida. Aglikon polimetoksi bersifat non polar, aglikon polihidroksi bersifat semi polar, sedangkan glikosida flavonoiad bersifat polar yaitu mengandung sejumlah gugus hidroksil dan gula, sebab itu golongan flavonoida dapat tertarik dalam pelarut metanol yang bersifat universal (Harborne, 1987).
Saponin mengandung gugus glikosida, Glikosida adalah suatu kompleks antara gula pereduksi (glikon) dan bukan gula (aglikon). Glikon bersifat mudah larut dalam air. Selain itu saponin adalah senyawa aktif permukaan kuat yang menimbulkan busa jika dikocok dengan air. Timbulnya busa menunjukkan adanya glikosida yang terhidrolisis dalam air menjadi glukosa dan senyawa lain (aglikon) (Robinson, 1995).
Pengujian terpenoida didasarkan pada kemampuan senyawa untuk membentuk warna dengan penambahan CeSO4 1% dalam H2SO4 10% . Hasil
yang diperoleh menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya warna merah kecoklatan yang menunjukkan adanya kandungan terpenoida (Sangi et al, 2008).
Pengujian tanin didasarkan pada kemampuan senyawa untuk membentuk warna dengan pemambahan FeCl35%. Pada penambahan ini golongan tanin
terhidrolisis akan menghasilkan warna hitam. Perubahan warna ini terjadi ketika penambahan FeCl3 yang bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang ada
pada senyawa tanin (Sangi et al, 2008).
4.2.2 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n- Heksana pada Kulit Buah Keben
Dari tabel 4.2 diatas dapat dilihat bahwa ekstrak etil asetat kulit buah keben menunjukkan diameter zona hambat yang lebih efektif terhadap bakteri gram positif Staphylococcus aureus pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat bakteri 16,42 mm dibandingkan dengan bakteri gram negatif
Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat bakteri 11,37 mm. Dan juga dapat di lihat bahwa semakin besar konsentrasi ekstrak maka semakin besar pula diameter daya hambat yang dibentuknya, sehingga diketahui bahwa keduanya memiliki hubungan yang berbanding lurus satu sama lain, dan dapat digambarkan dibawah ini :
Gambar 4.7 Grafik Diameter Zona Bening bakteri Escherichia coli pada Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksana
Gambar 4.8 Grafik Diameter Zona Bening bakteri Staphylococcus aureus pada Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-Heksana
0
Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat Ekstrak n-Heksana
0
Hasil uji aktivitas antibakteri pada ekstrak metanol kulit buah keben dapat menghambat petumbuhan bakteri lebih baik dengan zona hambat yang efektif terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat masing-masing 13,30 dan 10,63 mm. Pada ekstrak etil asetat kulit buah keben menunjukkan zona hambat yang efektif terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat masing-masing 16,42 dan 11,37 mm. Dan pada ekstrak n-heksana kulit buah keben menunjukkan zona hambat yang efektif terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat masing-masing 7,45 dan 7,32 mm.
Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak metanol, etil asetat, dan
n-heksana kulit buah keben lebih mudah menghambat pertumbuhan bakteri gram positif Staphylococcus aureus dibandingkan dengan bakteri gram negatif
Escherichia coli. Hal ini disebabkan oleh perbedaan komposisi dan struktur dinding sel pada bakteri gram positif dan gram negatif. Struktur dinding sel bakteri gram positif berlapis tunggal dengan kandungan lipid yang rendah (1-4%), sedangkan bakteri gram negatif memiliki kandungan lipid tinggi yaitu 11-12% dan membran terluar terdiri dari 3 lapisan yaitu lipopolisakarida, lipoprotein, dan pospolipid (Fardiaz, 1992).
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5. 1 Kesimpulan
1. Berdasarkan hasil skrining fitokimia golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol kulit buah keben adalah terpenoida, flavonida, dan tanin.
2. Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat kulit buah keben memberikan diameter zona hambat yang lebih baik terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat masing-masing 16,42 dan 11,37 mm, sedangkan pada ekstrak metanol dengan diameter zona hambat masing-masing 13,30 dan 10,63 mm, dan pada ekstrak n-heksana dengan diameter zona hambat masing-masing 7,45 mm dan 7,32 mm.
5.2 Saran
