ISOLASI DNA PARSIAL GEN Tyrosinase-Related Protein-1 (TYRP1) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)
SKRIPSI
Disusun untuk memenuhi sebagian syarat memperoleh gelar Sarjana Sains Program Studi Biologi
Oleh : Angga Kly Sandy
1105533
PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
ISOLASI DNA PARSIAL GEN Tyrosinase-Related Protein-1 (TYRP1) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)
Oleh Angga Kly Sandy
Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi sebagian syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi, Departemen Pendidikan Biologi,
Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
© Angga Kly Sandy 2015 Universitas Pendidikan Indonesia
Nopember 2015
Hak Cipta dilindungi undang-undang
ANGGA KLY SANDY
ISOLASI DNA PARSIAL GEN Tyrosinase-Related Protein-1 (TYRP1) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)
disetujui dan disahkan oleh pembimbing :
Pembimbing I
Diah Kusumawaty, M.Si. NIP. 197008112001122001
Pembimbing II
Any Aryani, M.Si. NIP.197105302001122001
Mengetahui,
Ketua Departemen Biologi
ABSTRAK
Tyrosinase-Related Protein-1 (TYRP1) merupakan salah satu gen yang
berperan dalam proses sintesis melanin. Gen TYRP1 memiliki peranan penting dalam menginstruksikan pembentukan enzim tyrosinase-related
protein-1. Ekspresi gen TYRP1 dapat digunakan sebagai penanda kondisi
stres pada ikan yang dapat disebabkan oleh faktor internal dan eskternal. Namun informasi genetik mengenai gen TYRP1 pada ikan gurame (Osphronemus gouramy) sangat minim informasi, sehingga pada penelitian ini bermaksud untuk mengisolasi dan mengarakterisasi gen TYRP1 pada ikan gurame. Amplifikasi gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame di lakukan dengan menggunakan dua pasang primer degenerate yang di rancang berdasarkan konsensus sikuen gen TYRP1 dari beberapa ikan dari
infraclass Teleostei. Perancangan primer dilakukan secara online pada
laman Primaclade dan Beacon Designer Free Edition. Primer terdiri dari set
outer-primer dan inner-primer (nested), dimana outer-primer digunakan
untuk memulai proses amplifikasi, kemudian produk amplifikasi yang tidak diharapkan dapat diminimalisir dengan keberadaan inner-primer. Analisa hasil sequencing dilakukan dengan BLAST, dan didapat hasil homologi pada ikan Takifugu rubripes (AF397401.1) dengan nilai kesamaan (Ident.) sebesar 76%. Sikuen DNA parsial gen TYRP1 ikan gurame dengan panjang 525 pb yang terdiri dari 36 pb daerah intron dan 489 pb daerah exon didapatkan dari hasil pensejajaran sikuen sampel dengan outer-primer dengan sikuen sampel dengan inner-primer menggunakan software Bioedit versi 7.2.5. Gen TYRP1 berhasil teramplifikasi dari DNA genom ikan gurame menggunakan dua pasang primer degenerate yang di rancang berdasarkan sikuen sekerabat ikan gurame dari infraclass Teleostei. Di lakukan perancangan primer spesifik gen TYRP1 ikan gurame dari sikuen daerah exon gen TYRP1 ikan gurame yang telah didapatkan.
ii
Angga Kly Sandy, 2015
ABSTRACT
The Tyrosinase-Related Protein-1 (TYRP1) gene provides instructions for making an enzyme called tyrosinase-related protein-1 in the melanin biosynthesis pathway. TYRP1 enzyme function is to assist in the process of melanogenesis or synthesis melanin. TYRP1 gene expression can be used as a sign that the fish (and other vetebrates) under stress condition, either due to environmental disturbances or diseases. However the genetic information
of the TYRP1 genes doesn’t exist in goramy (Osphronemus gouramy) or
minimum shared information. In this study focus to isolate and characterize the TYRP1 genes on gouramy. Amplification of TYRP1 genes in the gouramy DNA genome performed using degenerate primers were designed based on sequence consensus TYRP1 genes of some Teleostei fish. Primer designed by Primaclade and to determining the secondary structure of primer using Beacon Designer Free Edition. First, used outer-primer for initial phase of amplification, and then non specifics products can be eliminated by nested-primer (inner-primer). Four sequences based on the results of sequencing performed contig and then obtained length 525 bp of DNA genom region. Intron and exon are exist in sequence. The identities percentage of sequence is 76 % with Takifugu rubripes (AF397401.1) in BLAST result. Gene sequences analysis obtained TYRP1 goramy exon region with sequence length 489 bp and 36 bp intron region. TYRP1 gene successfully amplified from the DNA genome of goramy using degenerate
primers were designed based on sequences of Telesotei infraclass. Design
of TYRP1 gene spesific primer on goramy was performed using exon region sequence.
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK ... i
ABSTRACT ... ii
DAFTAR ISI ... iii
DAFTAR GAMBAR ... vi
DAFTAR TABEL ... vii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
A. Latar Belakang Penelitian ... 1
B. Rumusan Masalah Penelitian ... 4
C. Pertanyaan Penelitian ... 4
D. Batasan Masalah Penelitian ... 5
E. Tujuan Penelitian ... 5
F. Manfaat Penelitian ... 6
BAB II ISOLASI DNA PARSIAL GEN Tyrosinase-Related Protein-1 (TYRP1) PADA IKAN GURAME (Osphronemus gouramy) ... 7
A. Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 7
1. Morfologi ikan gurame (Osphronemus gouramy) ... 8
2. Jenis ikan gurame (Osphronemus gouramy) ... 9
3. Penyakit pada ikan gurame (Osphronemus gouramy) ... 10
B. Gen Tyrosinase-Related Protein-1 (TYRP1) ... 12
C. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 15
1. Tahapan PCR ... 16
2. DNA primer ... 17
iv
Angga Kly Sandy, 2015
b. Primer degenerate ... 20
D. Isolasi DNA ... 21
E. Nested Polymerase Chain Reaction (nPCR) ... 22
F. Bioinformatika ... 24
1. Pohon filogenetik ... 25
BAB III METODE PENELITIAN ... 28
A. Jenis Penelitian ... 28
B. Objek Penelitian ... 28
C. Waktu dan Lokasi Penelitian ... 28
D. Alat dan Bahan ... 28
E. Prosedur Penelitian ... 29
1. Tahap persiapan ... 29
2. Tahap prapenelitian ... 29
a. Perancangan primer degenerate gen TYRP1 ... 29
3. Tahap penelitian ... 31
a. Isolasi DNA genom ikan gurame dengan metode CTAB ... 31
b. Uji kualitatif dan kuantitatif isolat DNA genom ikan gurame ... 32
c. Amplifikasi gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame menggunakan primer degenerate dengan metode nPCR ... 34
d. DNA sequencing gen TYRP1 dan analisis data ikan gurame dan analisa data ... 35
e. Analisa sikuen gen TYRP1 ikan gurame ... 35
f. Konstruksi pohon filogenetik gen TYRP1 ... 36
g. Perancangan primer spesifik gen TYRP1 ikan gurame ... 37
F. Alur penelitian ... 38
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 39
A. Perancangan Primer Degenerate Gen TYRP1 ... 39
C. Amplifikasi Gen TYRP1 pada DNA Genom Ikan Gurame
Menggunakan Primer Degenerate dengan Metode nPCR ... 45
D. DNA Sequencing Gen TYRP1 dan Analisa Data ... 49
E. Analisa Sikuen DNA Genom Gen TYRP1 pada Ikan Gurame ... 50
F. Analisa Pohon Filogenetik Gen TYRP1 ... 51
G. Perancangan Primer Spesifik Gen TYRP1 Ikan Gurame ... 55
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 57
A. Kesimpulan ... 57
B. Saran ... 57
DAFTAR PUSTAKA ... 58
vi
Angga Kly Sandy, 2015
[image:9.595.82.501.169.755.2]DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1 Ikan gurame (Osphronemus gouramy) ... 7
2.2 (A) Ikan gurame jantan (B) Ikan gurame betina ... 9
2.3 Bakteri Aeromonas hydrophila berbentuk batang ... 10
2.4 Letak gen TYRP1 pada kromosom nomor 9p23 ... 12
2.5 Struktur evolusi kelompok gen Tyrosinase ... 14
2.6 Illustrasi tahapan proses PCR ... 16
2.7 Illustrasi tahapan proses nested PCR ... 23
2.8 Kelompok dan karakter dalam pohon filogenetik ... 25
2.9 Illustrasi gap pada suatu sikuen yang ditandai dengan garis (-) ... 25
2.10 Pemodelan pohon filogenetik dengan struktur leaves, root, dan branch ... 26
4.1 Multiple alignment dua sikuen gen TYRP1perancangan primer pertama ... 40
4.2 Multiple alignment sembilan sikuen gen TYRP1 perancangan primer kedua . 42 4.3 Elektroforegram hasil amplifikasi gen TYRP1 pada isolat DNA genom ikan gurame dengan inner-primer (OgTYRP1_IP) yang dirancang pertama kali ... 46
4.4 Elektroforegram hasil amplifikasi gen TYRP1 pada isolat DNA genom ikan gurame dengan primer yang di rancang kedua kali. Kode primer 2_OgTYRP1_OP untuk sampel Nn dan 2_OgTYRP1_IP untuk sampel N ... 47
4.5 Multiple alignment empat sikuen gen TYRP1 ikan gurame hasil sequencing . 50 4.6 Sikuen gen TYRP1 ikan gurame yang terkonservasi daerah exon dan intron . 51 4.7 Pohon filogenetik gen TYRP1 berdasarkan sikuen nukleotida daerah CDS. Angka pada cabang menunjukkan nilai bootstrap ... 53
4.8 Pohon filogenetik gen TYRP1 berdasarkan sikuen asam amino hasil translate sikuen nukleotida daerah CDS. Angka pada pohon menunjukkan nilai bootstrap ... 54
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
viii
Angga Kly Sandy, 2015
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1 Daftar alat dan bahan yang digunakan selama penelitian ... 63
2 Keterangan sikuen yang digunakan selama penelitian pada laman GenBank ... 65
3 Keterangan primer degenerate gen TYRP1 ... 67
4 Keterangan struktur sekunder primer degenerate gen TYRP1 ... 68
5 Keterangan primer spesifik gen TYRP1 ikan gurame dan struktur sekunder ... 75
6 Multiple alignment empat sikuen gen TYRP1 ikan gurame hasil sequencing ... 77
7 Multiple alignment 16 sikuen nukleotida gen TYRP1 daerah CDS ... 79
8 Multiple alignment 16 sikuen asam amino gen TYRP1 daerah CDS ... 90
1
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Penelitian
Ikan gurame (Osphronemus gouramy) merupakan salah satu ikan air tawar yang termasuk ke dalam infraclass Teleostei (Integrated Taxonomic Information System, 2012). Menurut Direktoral Jenderal Perikanan Budidaya (2014) gurame merupakan salah satu komoditas perikanan budidaya yang potensial untuk dikembangkan. Terjadi peningkatan produksi gurame pada tahun 2009 hingga tahun 2013 sebesar 19,86 % per tahun di mana pada tahun 2009 produksi gurame sebesar 46,254 ton dan meningkat pada tahun 2013 menjadi 94,605 ton.
Menurut Sumanto (2005) strain gurame yang dikenal masyarakat pada umumnya yaitu strain gurame soang / angsa dan jepang. Gurame soang merupakan strain gurame yang sangat diminati dikalangan pembudidaya, karena masa panennya yang singkat yaitu berkisar antara sembilan hingga sepuluh bulan. Dalam kurun waktu tersebut gurame soang dapat mencapai bobot tubuh 500 gram dan dapat langsung di lepas ke pasaran, sedangkan pada gurame jenis lain dibutuhkan waktu satu tahun untuk mencapai bobot tubuh tersebut. Gurame soang banyak dikembangkan di daerah Jawa Barat seperti Tasikmalaya dan Ciamis. Omzet yang di peroleh dari budidaya ikan gurame soang dengan ukuran kolam 5x5 m sebanyak 10 buah, sebesar 27 hingga 30 juta rupiah per bulan. Hal tersebut sangat menguntungkan, di tambah dengan metode perawatan gurame soang yang mudah dilakukan (Mina, 2013).
2
Angga Kly Sandy, 2015
kolam atau menyendiri. Menurut Hoglund et al., (2003) disebutkan bahwa keadaan stres pada ikan dapat ditunjukkan pula dengan keadaan tubuh yang lebih gelap secara drastis. Faktor keadaan sekitar yang membuat kondisi ikan terganggu merupakan faktor utama yang menyebabkan ikan mengalami perubahan warna menjadi lebih gelap sebagai ciri keadaan stres pada ikan.
Pada bagian tubuh yang menghitam atau menunjukkan warna lebih gelap aktifitas melanin berperan aktif didalamnya. Melanin merupakan produk dari melanosit yang berperan dalam pembentukkan pigmen coklat atau hitam. Tidak hanya berperan dalam pigmentasi hitam atau coklat, melanin memiliki fungsi lain yaitu sebagai proteksi kulit dari sinar ultraviolet (UV). Melanin memiliki kuantitas bervariasi dalam kulit tergantung kondisi respon tubuh. Pada hewan, melanin memiliki fungsi tambahan yaitu sebagai aspek kamuflase dan ciri keadaan tubuh hewan tersebut (Prota, 1980).
Sel melanosit terletak di daerah stratum basalis, di mana memiliki fungsi dalam pembentukan melanin yang di bantu dengan kerja kelompok enzim tyrosinase. Tirosin diubah menjadi 3,4 dihidroksifenil alanin (DOPA) untuk selanjutnya diubah menjadi
dopaquinone yang kemudian dikonversi setelah melalui beberapa tahap perubahan
menjadi melanin (Junqueira et al., 2003). Aktifitas kelompok enzim tyrosinase mempengaruhi kecepatan proses melanogenesis, di mana gen Tyrosinase-Related
Protein-1 (TYRP1) berperan aktif dalam mengintruksikan pembuatan enzim
tyrosinase-related protein-1 (Yan et al., 2013). TYRP1 merupakan salah satu gen yang berperan
dalam proses sintesis melanin. TYRP1 berfungsi untuk menginstruksikan pembuatan enzim tyrosinase-related protein-1, di mana letak enzim tersebut berada pada sel melanosit yaitu sel yang memproduksi pigmen melanin. Melanin memberi warna pada kulit, mata, serta jaringan lain yang peka terhadap cahaya (Kwon, 1993).
3
kerap merancang pasangan primer degenerate (Linhart & Shamir, 2004). Menurut Kwok et al., (1994) keberadaan basa degenerate memiliki keunikan tersendiri dalam suatu sikuen primer. Didefinisikan sebagai sikuen primer yang mewakili basa nukleotida lebih dari satu basa, primer degenerate memiliki kecenderungan dapat mewakili empat basa nukleotida dalam satu urutan sikuen primer.
Para peneliti kerap menggunakan daerah Coding DNA Sequence (CDS) dalam merancang primer degenerate. CDS merupakan daerah yang terkonservasi atas exon, di mana daerah tersebut merupakan daerah spesifik pada suatu sikuen. Dalam identifikasi suatu gen dengan menggunakan pasangan primer degenerate, daerah CDS perlu diketahui, agar primer yang dirancang merupakan primer spesifik untuk suatu gen tertentu (Furuno et al., 2003). Dalam merancang pasangan primer degenerate guna analisa gen yang minim informasi terkait organisme tersebut, digunakan sikuen sekerabat yang memiliki informasi genetik yang baik dalam mendukung hasil temuan organisme target. Menurut metode kromatografi Edwin Chargaff pada tahun 1949 – 1953 (dalam Watson et al., 2014) didapat salah satu kesimpulan bahwa basa-basa yang menyusun rantai DNA dari species dengan kekerabatan yang dekat memiliki komposisi basa yang sama.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik perbanyakan DNA secara
in-vitro guna didapatkan segmen DNA target dalam jumlah yang di butuhkan (Mullis et
al., 1986). Nested PCR (nPCR) merupakan salah satu jenis metode PCR di mana dalam
prosesnya, digunakan dua kali reaksi PCR dengan menggunakan dua set primer yang berbeda (Yourno, 1993). Dalam proses nPCR, reaksi pertama digunakan outer-primer guna memulai proses amplifikasi, kemudian di reaksi kedua, inner-primer digunakan untuk meminimalisir produk amplifikasi yang tidak diinginkan (Haff, 1994).
Kajian integrasi molekuler dan perancangan primer dapat dijadikan landasan untuk mempelajari gen yang terlibat dalam proses sintesis melanin, salah satunya yaitu gen TYRP1. Berdasarkan hal tersebut, maka dalam penelitian ini dilakukan isolasi dan karakterisasi gen TYRP1 pada ikan gurame dengan merancang pasangan primer
degenerate berdasarkan konsensus sikuen gen TYRP1 dari beberapa ikan dari infraclass
4
Angga Kly Sandy, 2015
karakterisasi gen TYRP1 diawali dengan menentukan daerah sikuen genom yang terkonservasi atas daerah exon dan intron yang didapatkan dari hasil pensejajaran sikuen sampel hasil sequencing menggunakan software Bioedit untuk selanjutnya dilakukan konstruksi pohon filogenetik gen TYRP1 yang dirancang dari sikuen nukleotida daerah CDS dan asam amino hasil translate sikuen nukelotida daerah CDS untuk mengetahui karakterisasi gen TYRP1 pada ikan gurame. Perancangan primer spesifik gen TYRP1 ikan gurame dilakukan secara online pada laman Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) yang dirancang dari sikuens nukleotida daerah CDS.
B. Rumusan Masalah Penelitian
Bagaimana primer degenerate yang dirancang berdasarkan konsensus sikuen gen TYRP1 dari beberapa ikan sekerabat ikan gurame dari infraclass Teleostei dapat mengamplifikasi gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame soang ?
C. Pertanyaan Penelitian
1) Bagaimana analisa primer degenerate yang dirancang berdasarkan konsensus sikuen gen TYRP1 dari beberapa ikan sekerabat ikan gurame dari infraclass
Teleostei ?
2) Bagaimana amplifikasi gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame dengan pasangan primer degenerate yag telah dirancang sebelumnya ?
3) Bagaimana analisa sikuen hasil sequencing dari produk amplifikasi gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame oleh primer degenerate yang telah dirancang sebelumnya ?
4) Bagaimana analisa sikuen genom ikan gurame yang didapat dari sikuen hasil
sequencing gen TYRP1 ?
5
6) Bagaimana perancangan primer spesifik gen TYRP1 pada ikan gurame yang dirancang dari sikuen nukleotida gen TYRP1 ikan gurame daerah CDS ?
D. Batasan Masalah Penelitian
1) Populasi yang digunakan adalah ikan gurame soang yang didapat dari tempat pengelolaan ikan, Tasikmalaya, Jawa Barat.
2) Sampel DNA yang digunakan berasal dari isolasi DNA genom ikan gurame pada penelitian Kusumawaty (2014, pustaka tidak dipublikasikan).
3) Primer degenerate dirancang berdasarkan konsensus sikuen gen TYRP1 dari beberapa ikan sekerabat ikan gurame dari infraclass Teleostei. Sikuen didapat pada laman GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov/).
4) Karakterisasi gen TYRP1 dalam penelitian ini dibatasi hingga proses mengetahui kelompok gen TYRP1 ikan gurame dengan kelompok ikan sekerabatnya melalui kontruksi pohon filogenetik.
E. Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini, yaitu :
1) Didapatkan pasangan primer degenerate gen TYRP1 yang mampu mengamplifikasi gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame, dimana primer
degenerate yang digunakan dirancang berdasarkan konsensus sikuen gen
TYRP1 dari beberapa ikan sekerabat ikan gurame dari infraclass Teleostei. 2) Didapatkan sikuen gen TYRP1 ikan gurame yang terkonservasi atas daerah
exon dan intron berdasarkan analisa sikuen hasil sequencing
3) Mengetahui karakterisasi gen TYRP1 ikan gurame dari hasil konstruksi pohon filogenetik gen TYRP1 dengan ikan sekerabat ikan gurame
6
Angga Kly Sandy, 2015
F. Manfaat Penelitian
1) Dapat memberikan informasi mengenai perancangan primer degenerate gen TYRP1 pada ikan gurame yang dirancang dari sikuen sekerabat ikan gurame dari infraclass Teleostei.
2) Dapat memberikan informasi mengenai analisa daerah sikuen DNA parsial gen TYRP1 ikan gurame yang terkonseravasi atas daerah exon dan intron.
3) Dapat memberikan informasi mengenai metode nested PCR (nPCR), karakterisasi gen, dan perancangan primer spesifik.
4) Kedepanya diharapkan informasi genetik gen TYRP1 pada ikan gurame dapat dijadikan dasar ilmu guna mengetahui kondisi ikan gurame yang mengalami stres yang disebabkan oleh kondisi lingkungan yang tidak baik, ataupun infeksi bakteri / penyakit
5) Sebagai bahan tambahan ilmu, khususnya dibidang biologi molekuler, bioinformatika, dan zoologi
28
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Penelitian deskriptif merupakan jenis penelitian yang digunakan. Menurut Martyn (2008) penelitian deskriptif adalah salah satu metode ilmiah di mana dalam penelitian dilibatkan proses mengamati dan menggambarkan perilaku subjek tanpa mempengaruhi dengan cara apapun.
B. Objek Penelitian
DNA ikan gurame soang, dan set primer degenerate gen TYRP1 yang dirancang berdasarkan konsensus sikuen gen TYRP1 dari beberapa ikan sekerabat ikan gurame dari infraclass Teleostei
C. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Maret hingga September 2015, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Bioteknologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia, Jalan Dr. Setiabudhi No.229, Bandung, 40154 Jawa Barat – Indonesia.
D. Alat dan Bahan
29
Angga Kly Sandy, 2015
E. Prosedur Penelitian 1. Tahap persiapan
Dilakukan sterilisasi panas lembab untuk alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian pada autoclave pada suhu 121 ºC dengan tekanan 1,5 atm selama 15-20 menit. Guna kepentingan isolasi DNA, bahan-bahan disimpan dalam suhu suhu 4 ºC, -20 ºC, dan suhu ruang sesuai kriteria masing-masing bahan. Sterilisasi diperlukan guna menjaga kondisi alat atau bahan yang akan digunakan dari kontaminasi mikroorganisme seperti spora, jamur, bakteri, dan lainnya. Menurut lembaga kesehatan dunia atau World Health Organization (2014), suhu sterilisasi yang optimum yaitu pada rentang 121-124 ºC selama 15 menit.
2. Tahap prapenelitian
a. Perancangan primer degenerate gen TYRP1
Perancangan primer di awali dengan pengumpulan sikuen gen TYRP1 dari ikan sekerabat ikan gurame dari infraclass Teleostei, sikuen di dapat dari laman GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Primer di rancang sebanyak dua pasang yaitu satu pasang outer-primer dan satu pasang inner-primer (nested). Perancangan inner-primer mengacu pada bagian sikuen yang lebih dalam dari sikuen outer-primer dengan jarak basa minimal 10 pb. Sikuen yang di pilih berasal dari derah coding DNA sequence (CDS) di mana CDS merupakan bagian dari sikuen DNA yang tersusun atas exon dan mengodekan protein tertentu (Twyman, 2003). Keseluruhan sikuen yang di dapat kemudian di copy kan untuk di buat dalam format FASTA dengan ekstensi file .txt. Dalam file format FASTA, keberadaan spasi tidak di perbolehkan dan di ganti dengan simbol underscore “_” (tanpa tanda kutip). Label identitas (secara singkat, dan informatif) dicantumkan pada bagian atas sikuen guna menandai suatu sikuen dengan sikuen lainnya. Hal tersebut berlaku untuk setiap sikuen.
30
evolusi antar sikuen (Mount, 2004). Dalam software clustalX 1.83 file format FASTA diunggah dengan mengklik tab ‘file – load sequences’. Setelah file di unggah dalam software, tampilan clustalX 1.83 akan menunjukan beragam sikuen yang telah di
submit. Kemudian, pada tab ‘Alignment’ menu pilihan ‘Output Format Options’ dipilih
untuk menentukan format output file yang diinginkan. Pada jendela pilihan ‘Output Format Options’ kemudian dicentang kolom CLUSTAL format dan NEXUS format,
setelah itu tab CLOSE diklik.
Setelah dipilih output file yang diinginkan, kemudian tab alignment di klik kembali, dan menu pilihan Do Complete Alignment di pilih untuk dilakukan proses alignment. Setelah muncul jendela baru Do Complete Alignment, kemudian tab START di pilih untuk memulai proses alignment. Proses alignment selesai bila di bagian bawah kiri jendela software clustalX 1.83 terdapat instruksi ‘Alignment completed’. Setelah proses
selesai, keluar dari jendela software clustalX 1.83 dan file hasil alignment akan tersimpan secara otomatis.
Setelah dilakukan alignment, perancangan primer selanjutnya dilakukan secara
online pada laman Primaclade (http://primaclade.org/cgi-bin/primaclade.cgi). Pada
laman penuh Primaclade, pada bagian tab ‘Browse..’ file hasil alignment dengan
ekstensi file .nxs (NEXUS) di unggah pada laman Primaclade. Kemudian, pada tab ‘Select your file format’ dipilih ‘nexus’. Selanjutnya pada tab ‘Max Num of Degeneracies’ dipilih 2,3,4, hingga 5 dan pada bagian tab lain di isi secara default.
Kemudian tab ‘Submit’ di pilih untuk memulai proses perancangan primer secara digital. Proses perancangan primer selesai di tandai dengan tampilan jendela baru dari Primaclade, setelah itu link pada jendela baru Primaclade di klik untuk kemudian diarahkan secara automatis ke laman kandidat primer hasil perancangan Primaclade.
31
Angga Kly Sandy, 2015
(http://www.premierbiosoft.com/qpcr/). Tes struktur sekunder pada primer penting dilakukan karena turut mempengaruhi keberhasilan proses ampifikasi pada proses PCR. Pemilihan primer berdasarkan kriteria perancangan primer yang baik berdasarkan kriteria utama dan keberadaan struktur sekunder yang mengacu pada protokol pembuatan primer yang baik Premier Biosoft (2015).
3. Tahap penelitian
a. Isolasi DNA genom ikan gurame dengan metode Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB)
Metode Isolasi DNA dilakukan berdasarkan protokol Saghai-Maroof et
al.,(1984); Rogers and Bendich (1985); Doyle and Doyle (1987) dalam Weising et
al.,(1995) dengan beberapa modifikasi. Sampel DNA yang digunakan berasal dari
isolasi DNA genom ikan gurame pada penelitian Kusumawaty (2014, pustaka tidak dipublikasikan). Sampel ikan gurame soang di dapat dari peternakan ikan Tasikmalaya, Jawa Barat. Isolasi DNA ikan gurame soang diawali dengan tahapan ekstraksi, di mana bagian organ ginjal, hati atau daging ikan gurame soang dihancurkan terlebih dahulu dengan mortar steril hingga halus kemudian sebanyak 100-250 µl isolat dimasukan kedalam tabung tabung mikro 1,5 ml. Setelah itu, sebanyak 500 µl buffer lisis
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 2X ditambahkan kedalam tabung isolat,
kemudian Sodium Deodecy Sulfat (SDS) 20 % turut ditambahkan sebanyak 7 µl. Tabung isolat kemudian dihomogenkan dengan cara dibulak-balikan secara perlahan. Tabung yang berisi campuran isolat selanjutnya diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65 ºC selama satu jam. Kemudian tabung isolat diangkat dan ditambahkan Proteinase K sebanyak 10 µl, dan dihomgenkan. Tabung kemudian diinkubasi kembali dalam
waterbath selama dua jam pada suhu 65 ºC. Kemudian Proteinase K ditambahkan
kembali pada tabung isolat sebanyak 5 µl untuk selanjutnya diinkubasi kembali dalam
waterbath selama 24 jam pada suhu 65 ºC.
Setelah waktu inkubasi selama 24 jam, tabung isolat kemudian di angkat dari
waterbath dan ditambahkan Potasium Asetat 5 M sebanyak 1/10 (satu persepuluh) dari
32
20 menit, tabung dikeluarkan dari freezer -20 ºC untuk selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 15,000 rpm selama 10 menit. Pada tabung isolat hasil sentrifugasi, terbentuk dua fasa yaitu supernatan untuk fasa atas dan pelete untuk fasa bawah. Supernatan yang terdapat dalam tabung isolat dipindahkan pada tabung tabung mikro 1,5 ml baru, dan ditambahkan enzim RNAse (DNAse free) sebanyak 1/100 (satu perseratus) dari volume total. Tabung campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama satu jam. Setelah inkubasi, tabung ditambahkan Chloroform Isoamil Alcohol (CIAA) (24:1) sebanyak ½ (satu perdua) dari voulme total dan dihomogenkan. Tabung isolat kemudian disentrifugasi pada kecepatan 15,000 rpm selama 10 menit. Fasa supernatan kemudian dipindahkan pada tabung tabung mikro 1,5 ml baru untuk kemudian ditambahkan
Sodium Asetat 3 M sebanyak 1/10 (satu persepuluh) dari volume total, dan
dihomogenkan dengan cara membulak-balikan tabung secara perlahan sebanyak 50X. Tabung kemudian ditambahkan Etanol Absolut sebanyak 2X volume total. Setelah itu tabung diinkubasi selama 24 jam atau overnight dalam freezer bersuhu -20 ºC.
Dihari berikutnya, tabung dikeluarkan dalam freezer -20 ºC untuk kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 15,000 rpm. Fasa supernatan yang terbentuk kemudian di buang secara cepat dan ditambahkan alkohol 70 % sebagai larutan aseptik sebanyak 100 µl dan dibuang kembali secara cepat untuk kemudian tabung disimpan terbalik dengan posisi mulut tabung berada dibawah atau berada pada alas yang telah disediakan. Setelah tabung dipastikan kering atau tidak dominan berbau alkohol, kemudian ditambahkan Tris EDTA (TE) dingin sebanyak 30–50 µl dan dihomogenkan dengan cara menjetikan perlahan tabung isolat. Tabung kemudian diinkubasi selama 15 menit dalam suhu 37 ºC untuk kemudian disimpan dalam freezer pada suhu -20 ºC.
b. Uji kualitatif dan kuantitatif isolat DNA genom ikan gurame
33
Angga Kly Sandy, 2015
Uji kualitatif dilakukan dengan electrophoresis gel agarose untuk mengetahui kualitas DNA dengan membaca larik pita DNA yang dihasilkan. Sebanyak 0,3 g gel
agarose dilarutkan dalam 30 ml TAE 1X untuk didapatkan konsetrasi agar sebesar 1 %.
Kemudian agar dilarutkan dengan bantuan microwave hingga bening. Larutan agar kemudian didiamkan hingga suhu larutan hangat, tidak terlalu panas dan tidak dingin untuk kemudian dicetak dalam cetakan agar khusus dalam sdkkat electrophoresis untuk dibentuk sumur agar. Setelah itu, agar didiamkan dalam suhu kamar hingga tekstur agar padat, kemudian agar di simpan dalam alat electrophoresis dan ditambahkan TAE 1X higga agar terendam. Sampel siap dimasukan kedalam sumur-sumur yang tersedia sebanyak 1–5 µl. Kemudian running electrophoresis dimulai dengan menyetel alat pada
voltase 100 V selama 40 menit, setelah selesai, agar dimasukan dalam larutan Etidium
Bromida (EtBr) guna proses pewarnaan DNA selama tiga menit dan dipindahkan
kedalam aquades atau deion (ddH2O) selama 7-15 menit. Agar kemudian dipindahkan
pada alat UV-Transiluminator untuk proses pembacaan hasil uji kualitatif DNA.
Uji kuantitatif dilakukan guna mengetahui konsetrasi dan kemurnian DNA sampel dengan mengukur absorbansi DNA pada alat spectrophotometer dengan panjang gelombang 260 nm guna konsetrasi DNA, dan perhitungan rasio absorbansi panjang gelombang 260 nm dan 280 nm untuk mengetahui kemurnian DNA (DNA purity). Pertama dilakukan pengukuran larutan blanco berupa ddH2O sebanyak 500 µl pada cuvet. Setelah itu, larutan blanco dibuang dan cuvet dibilas dengan alkohol 70 %,
kemudian cuvet dibilas kembali dengan ddH2O untuk selanjutnya siap digunakan untuk
pengukuran sampel. Guna pengukuran sampel, dilakukan pengenceran 500X dengan mencampurkan sampel sebanyak 1 µl dan ddH2O sebanyak 499 µl kedalam tabung
tabung mikro 1,5 ml. Tabung campuran kemudian di vortex terlebih dahulu kemudian di
sentrifugasi selama 5 detik. Sampel kemudian dipindahkan kedalam cuvet , sebelum di
34
c. Amplifikasi gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame menggunakan primer degenerate dengan metode nPCR
Amplifikasi gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame di lakukan dengan menggunakan dua pasang primer degenerate, yaitu outer-primer dan inner-primer pada stok DNA genom ikan gurame soang. Total reaksi yang digunakan sebanyak 10 µl dengan komposisi master mix sebagai berikut : 5 µl Dream Taq Green PCR Master Mix
2X, 0,5 µl Mix DNA atau DNA Template (0,5 µg/ul), 1 µl Primer Forward (1 µM), 1 µl
Primer Reverse (1 µM), dan 2,5 µl ddH2O. Amplifikasi dilakukan dengan bantuan alat Thermocycler yang di setel dengan beberapa pengaturan untuk melaksankan beberapa
kondisi. Program PCR yang digunakan berdasarkan protokol Thermo Scientific (2014) dengan beberapa modifikasi.
Proses amplifikasi berlangsung sebanyak 35 siklus dan diawali dengan tahapan
initial denaturation pada suhu 95 ºC selama tiga menit, kemudian diikuti dengan proses
denaturation pada suhu 95 ºC selama 30 detik, kemudian proses annealing atau
penempelan primer pada sikuen gen target selama 30 detik pada temperature melting (Tm) atau suhu sesuai kondisi spesifik masing-masing primer. Selanjutnya proses
extention pada suhu 72 ºC selama 1 menit per kilobytes. Pada tahap extension waktu
yang digunakan bervariasi tergantung ukuran amplikon dari gen target dengan perhitungan waktu 60 detik untuk ukuran amplikon 1000 pb. Kemudian dilanjut pada proses final extension selama 7 menit pada suhu 72 ºC, dan tahapan terakhir yaitu
holding pada suhu 16 ºC. Dilakukan optimasi suhu annealing pada program PCR guna
mendapatkan hasil amplifikasi terbaik. Pada sampel dengan inner-primer digunakan DNA template hasil running PCR dengan outer-primer sebanyak 1 – 0,5 µl dengan pengeceran 1/25 (satu perduapuluhlima) menggunakan ddH2O.
35
Angga Kly Sandy, 2015
d. DNA sequencing gen TYRP1 ikan gurame dan analisa data
Setelah pita tunggal terbentuk kemudian di lakukan perbanyakan sampel guna proses sequencing. Total volume setiap sampel berjumlah 50 µl dengan komposisi mix PCR sebagai berikut ; 25 µl Dream Taq Green PCR Master Mix 2X, 2,5 µl Mix DNA atau DNA Template (0,5 µg/ul), 5 µl Primer Forward (1 µM), 5 µl Primer Reverse (1 µM), dan 12,5 µl ddH2O. Proses sequencing berlangsung di Seoul, Korea oleh pihak
penyedia layanan jasa sequencing Macrogen Inc.
Analisis data hasil sequencing dilakukan dengan melakukan pengecekan sikuen pada laman http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/ untuk proses BLAST. Pengecekan dilakukan dengan mengunggah sikuen yang didapat dari proses sequencing pada laman NCBI dengan pilihan Nucleotide Blast.
e. Analisa sikuen gen TYRP1 ikan gurame
Sikuen yang di dapat dari hasil sequencing berjumlah empat sikuen, yang terdiri dari dua buah sikuen forward untuk primer dengan outer-primer dan
primer dan dua buah sikuens reverse untuk primer dengan outer-primer dan
inner-primer . Selanjutnya, ke empat sikuen di analisa untuk didapatkan sikuen DNA genom
gen TYRP1 ikan gurame. Pertama, di lakukan multiple alignment pada keempat sikuen yang di dapat. Kemudian setiap basa konsensus yang di dapat kemudian di analisa satu persatu dengan mengamati kecenderungan basa yang baik untuk di susun dalam sikuen DNA genom gurame (Osphronemus gouramy). Pemilihan basa-basa yang baik harus memiliki nilai dominan, dan memiliki nilai diagram yang baik yang dapat di lihat dari hasil peak pada hasil sequencing.
36
bagian hulu dan hilir dari keseluruhan sikuen berdasarkan homologi yang didapat pada saat proses BLAST.
Seberapa banyaknya bagian hulu dan hilir sikuen di buang dengan melihat kecenderungan nilai homologi sikuen hasil BLAST. Setelah di buang bagian hulu dan hilir sikuen, kemudian di dapat sikuen utuh DNA genom ikan gurame (Osphronemus
gouramy). Sikuen DNA genom ikan gurame kemudian di analisa kembali untuk
mengetahui daerah yang terkonservasi atas exon dan intron.
Dilakukan BLAST pada sikuen DNA genom ikan gurame yang telah di dapat dan di lakukan perbandingan daerah intron dan exon dengan sikuen Takifugu rubripes. Penentuan daerah intron dan exon dilakukan dengan mengamati kesamaan sikuen gurame dengan Takifugu rubripes (AF397401.1) pada tabel subject dan query yang terdapat dalam laman NCBI-BLAST.
f. Konstruksi pohon filogenetik gen TYRP1
Konstruksi pohon filogenetik gen TYRP1 di rancang berdasarkan sikuen nukleotida daerah Coding DNA Sequence (CDS) dan asam amino hasil translate sikuen nukelotida daerah CDS. Dilakukan konstruksi pohon filogenetik untuk mengetahui kekerabatan gen TYRP1 pada ikan gurame dengan ikan sekerabatnya. Digunakan total 16 sikuen dalam perancangan pohon filogenetik gen TYRP1 dengan didalamnya terdapat satu sikuen outgroup yaitu Homo sapiens (NM_000550.2 & NP_000541.1).
Konstruksi pohon filogenetik gen TYRP1 diawali dengan mengumpulkan keseluruhan sikuen gen TYRP1 dari laman GenBank (http://ncbi.nih.nlm.gov), kemudian sikuen di buat format FASTA dengan hanya mengambil daerah CDS pada setiap sikuen dan sikuen asam amino hasil translate daerah CDS. Dilakukan alignment dengan software clustalX.1.83, kemudian file nexus hasil output dari proses alignment di convert menjadi format MEGA dengan ekstensi file .meg dengan software MEGA4. File dengan ekstensi file .meg kemudian di unggah pada software MEGA4 dan pohon filogenetik di buat secara digital dengan metode Neighbor-Joining (NJ) dan nilai
replication 500. Pohon yang telah terbentuk kemudian dianalisa untuk mengetahui
37
Angga Kly Sandy, 2015
g. Perancangan primer spesifik gen TYRP1 ikan gurame
Primer spesifik di rancang dari daerah CDS sikuen gen TYRP1 ikan gurame. Perancangan primer di lakukan secara online pada laman Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/). Pada laman Primer3 sikuen CDS gen TYRP1 ikan gurame di submit pada kotak dialog yang tersedia. Kemudian, pada kriteria primer yang tersedia pada laman Primer3 dibiarkan secara default kecuali pada tab Primer Tm di isi dengan nilai Min. 60 ºC Opt. 63 ºC dan Max. 65 ºC untuk didapatkan pasangan primer yang memiliki nilai Tm yang diinginkan, yaitu nilai Tm diatas 60 ºC.
38
F. Alur Penelitian
Bagan 3.1 Diagram alir penelitian Penyusunan Proposal
Tahap Persiapan dan Prapenelitian
Tahap Penelitian
Konstruksi pohon filogenetik gen TYRP1 ikan gurame dengan organisme sekerabat
Isolasi DNA genom ikan gurame soang
Uji kualitatif dan kuantitatif DNA ikan gurame
Amplifikasi gen TYRP1 menggunakan primer degenerate dengan metode
nested Polymerase Chain Reaction (nPCR)
DNA sequencing gen TYRP1 ikan gurame dan analisa data
Analisa sikuen DNA gen TYRP1 ikan gurame Tahap Persiapan
Persiapan alat dan bahan (sterilisasi)
Studi Pustaka
Tahap Prapenelitian Perancangan primer degenerate gen TYRP1
Perancangan primer spesifik gen TYRP1 ikan gurame
57
Angga Kly Sandy, 2015
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Total daerah sikuen DNA parsial gen TYRP1 ikan gurame yang di dapat adalah 525 pb yang terkonseravsi atas daerah exon sepanjang 489 pb dan daerah intron sepanjang 36 pb hasil pensejajaran sikuen hasil sequencing. Konstruksi pohon filogenetik gen TYRP1 dirancang dari sikuen nukleotida daerah CDS dan asam amino hasil translate sikuen nukelotida daerah CDS dan di dapatkan hasil bahwa gen TYRP1 pada ikan gurame berkelompok dengan kelompok ikan lainnya dalam ingroup. Hal tersebut menunjukkan bahwa, primer degenerate hasil perancangan dari sikuen sekerabat ikan infraclass Teleostei mampu mengamplifikasi dengan baik gen TYRP1 pada DNA genom ikan gurame.
B. Saran
Perlu dilakukan analisa lebih lanjut mengenai penentuan sikuen DNA gen TYRP1 pada ikan gurame yang terkonservasi atas daerah exon dan intron, agar di dapat sikuen DNA gen TYRP1 utuh atau full genome. Primer spesifik yang telah dirancang guna mengamplifikasi gen TYRP1 pada ikan gurame perlu dilakukan validasi pada stok
cDNA dan DNA genom ikan gurame dengan metode Real Time PCR (RT-PCR) untuk
58
DAFTAR PUSTAKA
Anderson JM., Van ICM.(1995).Tight Junctions and The Molecular Basis for
Regulation of Paracellular Permeability .doi:269:467-475
Atkins P., Paula JD.(2006).Physical Chemistry for The Life Sciences Second Edition. New York:LEGO SPA
Badan Perencanaan Pembangunan Nasional Republik Indonesia.(2015).Budidaya Ikan
Gurame (Osphronemu gouramy).[Online].Tersedia:
http://warintek.bantulkab.go.id/web.php?mod=basisdata&kat=1&sub=3&file=62 [12 September 2015]
Braithwaite VA., Ebbesson LOE.(2014).Pain and Stress Responses in Farmed
Fish.doi:33:245-253
Balai Budaya Air Tawar Sukabumi.(2012).Jaringan Pembenihan dan Produksi Induk
Unggul.DJPB:Jakarta
Barreto RE., Volpato GL.(2006).Stress Responses of the Fish Nile tilapia subjected to
electroshock and social stressors.doi:39:1605-1612
Bio-Rad Laboratories Inc.(2006).Real Time PCR Applications Guide.[Online].Tersedia: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf [19 Desember 2015]
Boonanuntanasarn S.,Yoshizaki G., Iwai K.,Taekuchi T.(2004).Molecular Cloning,
Gene Expresion in Albino Mutants and Gene Knockdown Studies of Tyrosinase mRNA in Rainbow Trout.doi:17:413-421
Budd PS., Jackson IJ.(1995).Structure of the Mouse Tyrosinase-Related
Protein-2/Dopachrome-tautomerase (Tyrp2/Dct) Gene and Sequences of Two Novel Slaty Alleles. doi:29:35-43
Burpo FJ.(2001). A critical review of PCR primer design algorithms and cross-
hybridization case study.doi:218: 1–12.
Brough D., Brough C.(2015).Giant Gourami.[Online].Tersedia: http://animal-world.com/encyclo/fresh/anabantoids/GiantGourami.php [12 September 2015]
59
Angga Kly Sandy, 2015
Chien A., Edgar DB., Trela JM.(1976). Deoxyribonucleic Acid Polymerase from the
Extreme Thermophile Thermus aquaticus.doi:127:1550-1557
Dharmayanti NIPI.(2011).Filogenetika Molekuler:Metode Taksonomi Organisme
berdasarkan Sejarah Evolusi.Balai Besar Penelitian Veteriner
Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya.(2014).Budidaya Gurame Penggerak
Perekonomian Daerah dan Meningkatkan Kesejahteraan.DJPB:Jakarta
Fermentas.(2009).Troubleshooting Guide for DNA
Electrophoresis.[Online].Tersedia:http://res.hmu.edu.iq/Portals/0/Users/Bazhdar/
DNA_Troubleshooting.pdf [29 Agustus 2015]
Furuno M., Kasukawa T., Saito R., Adachi J., Suzuki H., Baldarelli R., Hayashizaki Y., Okazaki Y.(2003).CDS Anotation in Full Length cDNA Sequence.Genome
Research.doi: 13:1478-1487
Haff, LA.(1994).Improved Quantitative PCR Using Nested Primers.doi:332–337
Hidayat T., Pancoro A.(2006).Sistematika dan Filogenetik Molekuler.Kursus Singkat
Aplikasi perangkat lunak PAUP dan MrBayes untuk Penelitian Filogenetika Molekuler SITH-ITB.Bandung:UPI
Hoegg S., Brinkmann H., Taylor JS., Meyer J.(2003). Phylogenetic Timing of the
Fish-Specific Genome Duplication Correlates with the Diversification of Teleost Fish.doi:59:190-203
Hogeweg P.(2011).The Roots of Bioinformatics in Theoretical Biology.doi:7:1-5
Genetics Home Reference.(2007).TYRP1.[Online].Tersedia
http://ghr.nlm.nih.gov/gene=TYRP1 [04 Februari 2015]
Guo HB., Huang S., Zhang., Qi F.(2003).Biochemical and Histochemical activities of
Tyrosinase in the Skins of Normal and Albino Turbot Scopthlamus maximus.
doi:67-76
Gronskov K., Ek J., Nielsen KB.(2007). Review:Oculocutaneous albinism. Orphanet
Journal of Rare Diseases.doi:2(43):1-8.
Inagaki H., Bessho Y., Koga A., Hori H.(1994).Expression of the Tyrosinase-Encoding
60
Integrated Taxonomic Information System.(2012).Osphronemus gouramy
Lacepède,1801.[Online].Tersedia:http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?
search_topic=TSN&search_value=638762 [13 Oktober 2015]
International Union for Conservation of Nature and Natural Resources.(2015).Osphronemus goramy.[Online].Tersedia:
http://www.iucnredlist.org/details/180720/0 [03 Nopember 2015]
Jiaqing W., Lin H., Ruifeng Z., Xintao Z., Lijuan J., Wenjing S., Jialu A., Xiaoyan L.(2006).The Tyrosinase Gene Family and Albinism in Fish.doi:25:191-198
Junqueira LC., Carneiro J., Kelley RO.(2003).Basic Histology 10th edition.Washington:Lange
Kerovuo J., Lauraeus M., Nurminen P., Kalkkinen N., Apajalahitt J.(1998).Isolation,
Characterization, Molecular Gene Cloning, and Sequencing of a Novel Phytase from Bacillus subtilis.doi:64:2079-2085
Kleppe K., Ohtsuka E., Kleppe R., Molineux I., Khorana HG.(1971).Studies on
polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.doi:10.1016/0022-2836(71)90469-4
Koressaar T., Remm M.(2007).Enhancements and modifications of primer design
program primer3.doi:23:1289-1291
Kwon BS.(1993).Pigmentation Genes:the Tyrosinase Gene Family and the pmel 17
Gene Family.doi:100:1348-1408
Lass DA.(2015).Aquarium Fish Stress.[Online].Tersedia:
http://www.fishchannel.com/fish-health/healthy-aquariums/fish-stress.aspx [03 Nopember 2015]
Levy C., Khaled M., Fisher DE.(2006).MITF : master Regulator Of Melanocyte
Development And Melanoma Oncogene.doi:12:406-415
Linhart C., & Shamir R.(2004). The Degenerate Primer Design Problem : Theory and
Applicatiod.School of Computer Sciences:Tel Aviv University
61
Angga Kly Sandy, 2015
Martyn S.(2008).Descriptive Research Design.[Online].Tersedia:
https://explorable.com/descriptive-research-design [11 Agustus 2015]
Meita W.(2005).Uji Resistensi Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) Terhadap Bakteri
Aeromonas hydrophila Menggunakan Metode Injeksi Peroral.Skripsi Jurusan
Pendidikan Biologi.FPMIPA:Universitas Pendidikan Indonesia
Mina S.(2013).Budidaya Ikan Gurame Soang-Panen Cepat, Untung Berlipat.[Online].Tersedia: http://www.bibitikan.net/budidaya-ikan-gurame-soang-panen-cepat-untung-berlipat/ [13 Oktober 2015]
Mina S.(2013).Ciri-ciri Gurami yang Terkena
Penyakit.[Online].Tersedia:http://bibitgurami.com/ciri-ciri-gurami-yang-terkena-penyakit/ [8 April 2015]
Mondal M., Sengupta M., Samanta S., Sil A., Ray K.2012.Molecular Basis Of Albinism
In India: Evaluation Of Seven Potential Candidate Genes And Some New Findings. doi:511:470-474
Mount DM.(2004).Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2nd ed.). .[Online].Tersedia: http://www.cshlpress.com/pdf/BioInfo.pdf [17 Agustus 2015]
Mullis K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., Erlich, H.(1986).Spesific
Enzymatic Amplification of DNA In Vitro:The Polymerase Chain Reaction.doi:51:263-273
Oxford Gene Technology.(2015).Understanding and Measuring Variations in DNA
Sample Quality.[Online].Tersedia:
http://www.ogt.co.uk/resources/literature/483_understanding_and_measuring_ variations_in_dna_sample_quality [29 Agustus 2015]
Premier Biosoft.(2015).PCR Primer Design Guidelines.[Online].Tersedia:
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html [18 Agustus 2015]
Prota G.(1980).Recent Advances in the Chemistry of Malenogenesis in Mamals.doi:75:122-127
Sambrook J., Russel D.(2001).Molecular cloning: A laboratory manual.New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press
Saitou N., Nei M.(1987).The Neighbor-Joining Method : A New Method For
62
Shibahara S., Takeda K., Yasumoto K., Udono T., Watanabe K., Saito H., Takahashi K.(2001). Microphthalmia-Associated Transcription Factor (MITF): Multiplicity in Structure, Function, and Regulation.doi:01:99-104
Sumanto F.(2015).Mengenal Jenis Gurame Angsa/Soang.[Online].Tersedia:
http://www.benihgurame.com/2015/01/mengenal-jenis-ikan-gurame-angsa-soang.html [17 April 2015]
Sturm RA., Teasdale RD., Box NF.(2001).Review:Human Pigmentation genes:
Identification, Structure, and Consequences of Polymorphic
Variation.doi:277:49-62
Thermo Scientific.(2014).Product Information ThermoScientific DreamTaq Green PCR
Master Mix (2X).United States of America:ThermoFisher Scientific
Thomas DC.(1999).Design of Gene Characterization Studies: an Overview.doi:26:17-23
Watson J., Baker T., Bell S., Gann A., Levine M., Losick R.(2014).Molecular biology
of the gene 7th edition.New York:Pearson
Weising K., Nybom H., Wolff K., Meyer W.(1995).DNA Fingerprinting in Plants and
Fungi.CRC Press:United States of America
World Health Organization.(2014).The International Pharmacopoeia Fourth Edition.[Online].Tersedia: http://apps.who.int/phint/en/p/docf/ [11 Agustus
2015]
Xu Y., Zhang XH., Pang YZ.(2013).Association of TYR and TYRP1 with Melanic
Plumage Color in Korean Quails (Coturnix coturnix).doi:26:1518-1522
Yan B., Liu B., Zhu C., Li K., Yue L., Zhao J.,Gong X., Wang C.(2013).microRNA
Regulation of Skin Pigmentation in Fish.doi:10.1242/jcs.125831
