III. METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini berlangsung pada bulan Juni 2011 sampai dengan bulan Februari 2012. Pemeliharaan dan pemberian perlakuan serta analisa parameter imun dan histopatologi udang vaname dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Analisis PCR (Polimerase chain reaction) dilakukan pada awal dan akhir perlakuan di Balai Uji Standarisasi Kesehatan Ikan, KKP Jakarta.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian
Udang uji yang digunakan adalah udang vaname (Litopenaeus vannamei) SPF (specific pathogen free), berukuran 2.9±0.1 g, didatangkan dari hatchery PT Central Pertiwibahari di Suak, Lampung. Udang vaname ditampung terlebih dahulu dalam bak fiber yang dilengkapi aerasi dan menggunakan sistem resirkulasi selama dua minggu pada suhu ruangan. Selama aklimatisi udang diberi pakan komersial tiga kali sehari dengan FR 4-5% dari bobot total udang. Kemudian, udang didistribusikan ke dalam 15 unit akuarium, masing-masing berisi air dengan volume 30.6 liter. Air media untuk pemeliharaan yang bersalinitas 25 ppt difilter dan disterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan Ca-hypoclhoride (CaCO3) sebesar 30 ppm.
Bahan yang digunakan sebagai imunostimulan adalah tepung kappa-karagenan yang diekstrak dari rumput laut Kappaphycus alvarezii, berasal
dari Laboratorium Bioteknologi THP IPB. Virus yang digunakan untuk infeksi adalah IMNV (Infectious Myonecrosis Virus) yang diperoleh dari udang hidup yang terinfeksi IMNV, dan diberikan secara oral. Bahan desinfektan yang digunakan terdiri dari Ca-hypochloride (kaporit) dan alkohol. Bahan-bahan kimia lain yang digunakan dalam mengukur parameter imun adalah methanol, pewarna giemsa, asam sitrat, L-DOPA(Sigma D9628), trypsin (Sigma T4799), sodium
cacodylate (Sigma C0250) MgCl2, NaCl, CaCl, dan anti koagulan
Peralatan yang digunakan meliputi akuarium berukuran 60x30x35 cm sebanyak 15 buah dan bak fiber berukuran 150x100x50 cm, masing-masing dilengkapi dengan aerasi dan menggunakan sistem resirkulasi. Peralatan lainnya yang digunakan yaitu, bak fiber satu ton berdiameter 150 cm sebagai bak penampungan air laut bersih dan steril yang dilengkapi dengan peralatan aerasi. Alat-alat yang digunakan untuk pemeriksaan parameter imun udang meliputi
sirynge satu ml, kaca obyek dan penutupnya, hemositometer, mikropipet,
mikrotube (eppendorf 1.5), yellow tip, blue tip, sentrifus, mikroskop, alat penghitung (hand counter), autoklaf, spektrofotometer, petridish dan gelas Beaker.
3.3 Rancangan Percobaan
Penelitian yang dilakukan terdiri dari dua tahapan. Penelitian tahap satu yaitu menguji pengaruh pemberian k-karagenan melalui pakan dengan dosis yang berbeda dalam meningkatkan respons imun udang vaname dan resistensi udang vaname dari serangan IMNV. Penelitian tahap dua adalah menguji frekuensi pemberian k-karagenan yang efektif dalam mengendalikan serangan IMNV pada udang vaname.
Rancangan percobaan yang digunakan yaitu rancangan acak lengkap (RAK) dengan tiga ulangan pada masing-masing perlakuan. Parameter imun, kelangsungan hidup dan pertumbuhan udang vaname di analisis keragamannya menggunakan ANOVA. Bila terdapat perbedaan antar perlakuan, maka dianalisis lebih lanjut dengan menggunakan uji lanjut Duncan. Sedangkan data PCR, data pengamatan gejala klinis yang meliputi skoring dan histopatologi di analisis secara deskriptif.
3.4 Kappa-Karagenan dan Penyiapan Pakan
Kappa-karagenan yang digunakan merupakan hasil ekstraksi rumput laut
Kappaphycus alvarezii dari laboratorium Bioteknologi THP, dalam bentuk
tepung. Tepung K-karagenan yang akan dicampurkan dengan pakan udang komersial ditimbang terlebih dahulu berdasarkan dosis perlakuan yang telah ditentukan, yaitu 5, 10 dan 15 g kg-1 pakan. Masing-masing k-karagenan yang
telah ditimbang tersebut dilarutkan dalam sedikit air, kemudian dicampurkan secara merata dengan pakan komersial yang telah disiapkan, dan dikering-anginkan pada suhu ruang. Setelah pakan kering, kemudian dilapisi (coating) dengan putih telur dan dikering-anginkan kembali pada suhu ruang. Pakan yang telah siap dimasukkan dalam wadah plastik dan disimpan dalam lemari pendingin hingga saat akan digunakan.
3.5 Prosedur Infeksi IMNV
Infeksi IMNV pada udang vaname dilakukan secara oral. Udang yang digunakan untuk menginfeksi IMNV adalah udang yang telah terinfeksi dan memperlihatkan gejala klinis otot pada ruas terakhir berwarna merah. Terlebih dahulu udang dibersihkan dari kepala, karapas dan ekor, sehingga didapatkan bagian otot/daging udang secara utuh, lalu dihancurkan dan dihomogenkan. Setelah itu ditimbang sesuai dengan kebutuhan dan otot udang yang terinfeksi tersebut diberikan kepada udang sebagai pakan tiga kali sehari selama tiga hari berturut-turut (Coelho et al. 2009) sebesar 10% dari biomassa udang vaname uji (Fadilah 2010).
3.6 Prosedur Penelitian Tahap Satu
3.6.1 Menguji Pengaruh Pemberian Kappa-Karagenan terhadap Parameter Imun Udang Vaname
Penelitian tahap satu terdiri dari tiga perlakuan dan kontrol (kontrol positif dan kontrol negatif) dengan masing-masing tiga ulangan. Pada tahap ini udang vaname diberi k-karagenan melalui pakan yang dicampurkan dalam setiap kilogram pakan udang komersial yang diberikan. Masing-masing perlakuan k-karagenan yang diberikan sebesar K: 0, A: 5, B: 10 dan C: 15 g kg-1 pakan. Udang vaname yang digunakan berukuran 4.9±0.32 g, sebanyak 150 ekor. Seluruh perlakuan dan kontrol diberi pakan tiga kali sehari dengan FR (feeding
rate) sebesar 4-5 % dari bobot biomassa. Pemberian perlakuan berlangsung
selama empat minggu. Pengukuran parameter imun dan pertumbuhan dilakukan pada minggu ke-0, 1, 2, 3 dan 4 perlakuan.
3.6.2 Menguji Pengaruh Pemberian Kappa-Karagenan terhadap Resistensi Udang Vaname dari Serangan IMNV
Resistensi udang vaname diamati setelah udang vaname yang diberi perlakuan selama empat minggu, diinfeksi dengan IMNV. Udang vaname yang telah diberi perlakuan pakan yang ditambahkan k-karagenan dengan dosis berbeda selama empat minggu, selanjutnya diinfeksi dengan IMNV secara oral. Pada tahap ini terdiri dari tiga perlakuan dan kontrol (kontrol positif dan kontrol negatif), dengan masing-masing tiga ulangan. Udang vaname yang diinfeksi telah mencapai ukuran 10.77±1.32 g. Penginfeksian IMNV berdasarkan prosedur infeksi IMNV (subbab 3.5). Setelah diinfeksi IMNV, udang vaname diberi pakan udang komersial dan diamati selama dua minggu. Pengamatan yang dilakukan meliputi kelangsungan hidup, gejala klinis dan histopatologi serta konfirmasi keberadaan IMNV pada udang vaname dengan PCR (polymerase chain reaction).
3.7 Prosedur Penelitian Tahap Dua
3.7.1 Mengevaluasi Frekuensi Pemberian Kappa-Karagenan terhadap Resistensi Udang Vaname dari Serangan IMNV
Penelitian tahap dua adalah menentukan frekuensi pemberian k-karagenan dengan menggunakan dosis terbaik (C: 15 g kg-1 pakan) yang didapatkan pada penelitian tahap satu. Penelitian tahap dua ini terdiri dari perlakuan :
Kontrol (+) dan (-) : Pemberian pakan tanpa k-karagenan
Perlakuan C1 : Pemberian k-karagenan setiap hari selama lima minggu Perlakuan C7 : Pemberian k-karagenan selama tujuh hari secara berulang
dengan interval pemberian tujuh hari (minggu ke-1,3,5) Perlakuan C14 : Pemberian k-karagenan selama 14 hari secara berulang
dengan interval pemberian tujuh hari, pada minggu ke-1 dan 4
Pemberian perlakuan berlangsung selama lima minggu, menggunakan udang vaname berukuran 4.2±0.32 g. Pengamatan pertumbuhan dilakukan setiap minggu selama perlakuan, yaitu minggu ke-0 sampai 5 perlakuan. Selanjutnya udang vaname diinfeksi dengan IMNV berdasarkan prosedur infeksi IMNV (subbab 3.5). Udang vaname yang diinfeksi dengan IMNV telah mencapai ukuran
12.2±1.01 g. Pemeliharaan setelah infeksi menggunakan pakan komersial berlangsung selama selama dua minggu. Pengamatan resistensi meliputi kelangsungan hidup, gejala klinis, histopatologi, serta konfirmasi keberadaan IMNV dengan PCR.
3.8 Pengukuran Parameter Pengamatan
Parameter pengamatan dalam penelitian ini meliputi parameter imun, pemeriksaan gejala klinis, histopatologi dan kelangsungan hidup serta konfirmasi keberadaan IMNV dengan PCR pada udang vaname. Sebagai data penunjang dilakukan pula pengukuran pertumbuhan. Parameter imun yang diukur adalah total hemosit, diferensiasi hemosit, aktifitas fagositosis, dan phenoloksidase. 3.8.1 Total Hemosit (Blaxhall dan Daishley 1973)
Hemolim diambil sebanyak 0.1 ml dibagian pangkal kaki jalan ke-5 dengan syringe 1 ml yang sudah berisi antikoagulan Na-sitrat sebanyak 0.3 ml, kemudian dihomogenkan selama lima menit. Tetesan pertama hemolim pada syringe dibuang, selanjutnya hemolim diteteskan ke haemositometer dan dihitung jumlah selnya per ml dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40 kali. Total hemosit dihitung dengan menggunakan rumus :
Total Hemosit Keterangan:
FP = Faktor Pengenceran
3.8.2 Diferensiasi Hemosit (Martin dan Graves 1995)
Hemolim yang telah diambil dari udang uji diteteskan pada gelas objek dan dibuat ulasan, kemudian dikeringkan di udara dan difiksasi dengan metanol 100% selama lima menit. Setelah itu dikeringkan udara kembali dan diwarnai dengan larutan giemsa 10% selama 10 menit, dicuci dalam air mengalir selama 30 detik dan dibiarkan kering. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 100 kali dan dibedakan menurut jenisnya yaitu sel hialin, semi granular dan granular. Persentase jenis hemosit dihitung dengan menggunakan rumus :
3.8.3 Aktifitas Fagositik (Anderson dan Siwicki 1993)
Hemolim 0.1 ml dimasukkan kedalam mikroplate dan dicampur secara merata dengan 25 μl bakteri Staphylococcus aureus dan diinkubasi selama 20
menit. Hemolim sebanyak 5 μl diteteskan pada objek glas dan dibuat preparat ulas lalu dikeringkan. Fiksasi dengan metanol 100% selama lima menit dan diwarnai dengan giemsa selama 15 menit. Aktivitas fagositik diukur berdasarkan persentase sel-sel fagosit yang melakukan fagositosis. Aktifitas fagositik dihitung dengan menggunakan rumus :
3.8.4 Aktifitas Phenoloxidase (PO) (Liu and Chen 2004)
Aktifitas phenoloxidase diukur menggunakan spektrofotometer. Pengamatan dilakukan dengan melihat perekaman pembentukan dopachrome yang dihasilkan dari L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA). Hemolim disentrifuse pada 1000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Cairan supernatan dibuang dan pellet dibilas dengan cacodylate-citrate buffer hingga 1 ml (sodium cacodylate 0.01 M, sodium chloride 0.45 M, trisodium citrate 0.10 M, pH 7.0) kemudian disentrifus ulang. Pellet selanjutnya dicampur dengan cacodylate buffer hingga 200 µl (sodium cacodylate 0.01 M, sodium chloride 0.45 M, calcium chloride 0.01 M dan magnesium chloride 0.26 M, pH 7.0). Larutan kemudian dibagi dua, Larutan pertama sebanyak 100 µl diinkubasi selama 10 menit pada suhu 25oC dengan 50 µl trypsin (1 mg ml-1), sebagai elicitor kemudian ditambahkan 50 µl LDOPA, dan lima menit kemudian dicampur 800 µl cacodylate buffer. Larutan kedua sebanyak 100 µl suspensi sel dicampur dengan 50 µl cacodylate buffer (untuk menggantikan trypsin) dan 50 µl L-DOPA yang digunakan sebagai kontrol untuk background aktifitas phenoloxidase pada semua kondisi uji.
Optikal density (OD) diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 490 nm. Aktifitas phenoloxidase udang diekspresikan sebagai pembentukan dopachrome per 50 µl hemolim.
3.8.5 Pemeriksaan Virus dengan Metode PCR
Pemeriksaan virus dengan metode PCR dilakukan guna mengkonfirmasi keberadaan virus pada udang vaname uji yang akan digunakan dalam perlakuan dan pada saat setelah diinfeksi. Pemeriksaan virus dengan metode PCR menggunakan metode standar dari OIE (2009).
3.8.6 Pemeriksaan Gejala Klinis
Pemeriksaan gejala klinis dilakukan setelah infeksi dengan IMNV. Pengamatan gejala klinis dilakukan melalui skoring berdasarkan jenis perubahan gejala yang terjadi (Angka 2005). Parameter gejala klinis yang digunakan
berdasarkan modifikasi dari penentuan kelompok gejala klinis dalam Costa (2009), yaitu terinfeksi tanpa symptom termasuk kategori tingkat infeksi
ringan dengan skor (+), gejala dengan sedikit warna putih lebam di dalam jaringan pada bagian beberapa segmen abdomen termasuk kategori menengah dengan skor (++), gejala dengan sebagian besar jaringan abdomen berwarna putih lebam termasuk kategori berat dengan skor (+++) dan gejala dengan bagian abdomen dari arah ekor berwarna merah (jaringan mati) termasuk kategori berat dengan skor (++++).
3.8.7. Histopatologi
Histopatologi diambil dari jaringan otot skeletal dan hepatopankreas udang pada setiap akhir pengamatan setelah infeksi. Sampel udang yang digunakan diambil dari setiap perlakuan untuk mengetahui tingkat kerusakan jaringan yang terjadi akibat IMNV dan pengaruh perlakuan yang diberikan. Organ dan jaringan yang diambil dari udang uji difiksasi terlebih dahulu dengan larutan fiksatif Davidson minimal satu hari. Kemudian organ dipotong 3-5 mm dan 1 x 1 cm, selanjutnya dilakukan dehidrasi, clearing, impregnasi, embedding dan blocking paraffin. Block jaringan selanjutnya diiris menggunakan mikrotom setebal 5 µm dan diwarnai dengan hematoxylin-eosin.
3.8.8 Kelangsungan Hidup
Tingkat kelangsungan hidup udang dihitung dengan menggunakan rumus:
Keterangan:
SR = Tingkat Kelangsungan Hidup
Nt = Jumlah udang yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No = Jumlah udang pada awal pengamatan
3.8.9 Pertumbuhan Relatif
Penghitungan pertumbuhan relatif udang dilakukan sebagai data penunjang, untuk mengetahui pertumbuhan yang terjadi selama perlakuan.
Pertumbuhan relatif udang vannamei dihitung berdasarkan rumus (Affandi and Tang 2002) :
Keterangan
Wr = pertumbuhan relatif udang (%) Wt= Bobot rata-rata akhir udang (g) Wo= Bobot rata-rata awal udang (g)
Wt – Wo
Wr = x 100 Wo
