ISOLASI KOI HERPESVIRUS (KHV) DARI BEBERAPA ORGAN
TARGET DENGAN MENGGUNAKAN KULTUR SEL KT- 2
T ut i Sum iat i* ) dan Agus Sunar t o* * )
* ) Balai Penelit ian dan Pengem bangan Budidaya Air Tawar Jl. Raya Sem pur No. 1, Bogor 16154
E- m ail: tuti.sumiati@yahoo.co.id
* * ) Pusat Penelit ian dan Pengem bangan Perik anan Budidaya Jl. Ragunan 20, Pasar Minggu, Jakart a Selat an 12540
(Naskah diterima: 5 Mei 2011; Disetujui publikasi: 1 Maret 2012)
ABST RAK
Kasus kem atian m assal pada ikan m as dan koi (Cyprinus carpio) yang disebabkan oleh koi herpesvirus (KHV) terjadi sejak tahun 2002 dan m asih berlangsung hingga sekarang. Pem ilihan sam pel yang tepat sangat penting untuk m endeteksi dan m engidentifikasi penyakit KHV tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk m engetahui jaringan yang m enjadi t arget infeksi KHV dengan cara isolasi virus m enggunakan kult ur sel KT- 2. Kultur sel diinokulasi dengan ekstrak jaringan organ target (otak, m ata, insang, ginjal, lim fa, hat i, jant ung, dan usus, sert a gabungan insang, ginjal, dan lim fa) dan diinkubasi pada suhu 25oC selam a 14 hari. Kerusakan sel terjadi pada kultur sel yang diinokulasi dengan ekstrak dari jaringan insang, ginjal dan gabungan organ insang, ginjal, dan lim fa. Uji PCR dari m edia kultur dan sel yang m engalam i CPE m enunjukkan bahwa CPE disebabkan oleh KHV.
KATA KUNCI: KHV, organ t arget , k ult ur sel, isolasi virus, CPE, PCR
ABST RACT : Isolation of k oi herpesvirus (KHV) f rom several target tissues using KT- 2 fish cell culture. By: Tuti Sumiati and Agus Sunarto
Mass mortality of koi and common carp (Cyprinus carpio) caused by koi herpesvirus (KHV) occured since 2002 is continuing at moment. Appropriate sample is crucial for the detection and identification of the KHV disease. The aim of this research is to investigate the major sites of KHV infection by isolating the virus from several target tissues using KT-2 fish cell culture. The cell cultures were inoculated with tissue extract from target tissues (brain, eye, gills, kidney, spleen, liver, heart, intestine, and pooled of gill, kidney and spleen) and incubated at 25oCfor 14 days. Cythophatic effect (CPE) was observed in cell cultures inoculated with gill, kidney and pooled of gill, kidney, and spleen. Polymerase Chain Reaction (PCR) assay of tissue cultures supernatant and cells showing CPE confirmed that the CPE was caused by KHV.
PENDAHULUAN
Perikanan budidaya menjadi harapan bagi p en i n g k at an p r o d u k si p er i k an an d al am m em enuhi perm int aan pasar baik dom est ik maupun internasional. Dampak lanjut dengan ad an ya i n t en si f i k asi b u d i d aya p er i k an an adalah t erjadinya berbagai kasus serangan penyakit . Kasus serangan penyakit t ersebut telah mengakibatkan kerugian yang signifikan baik dari aspek ekonom i m aupun sosial, dan berakibat kurang menguntungkan bagi industri perikanan budidaya di Indonesia. Salah sat u kasus serangan penyakit pada ikan air t awar yang m enyebabkan kerugian ekonom i dan sosial sangat besar adalah kem at ian m assal pada ikan m as dan koi akibat infeksi koi her-pesvirus, KHV (Sunart o et al., 2005a).
Penyak it KHV p er t am a k ali d ilap or k an terjadi di Israel dan Amerika Serikat pada tahun 1 9 9 8 (Hed r i ck et al., 2 0 0 0 ), sel an j u t n ya m enyebar ke berbagai negara (Hoffm an et al., 2002; Way et al.,2002; Sano et al., 2004; Tu et al., 2004). Di Indonesia, kasus kematian massal pada ikan mas dan koi pertama kali dilaporkan t er j ad i p ad a t ah u n 2 0 0 2 d i d aer ah Bl i t ar (Su n ar t o et al., 2 0 0 5 a). Wab ah i n i t er u s berlanjut dan m enyebar ham pir ke seluruh wilayah di Indonesia, dari Sumatera sampai ke Papua (Sunart o & Cam eron, 2005) dan m asih t erus berlanjut hingga saat ini.
Ko i h er p esvi r u s m er u p ak an p en yak i t paling m em at ik an pada budidaya ik an air tawar di Indonesia. Penyakit ini dapat m enye-babkan kem at ian ikan m as dan koi ant ara 80%–95% dalam wakt u 2 m inggu (Perelberg et al., 2 0 0 3 ). Gej ala k linis dar i ik an yang terinfeksi KHV ditandai dengan produksi lendir yang berlebihan, adanya kerusakan insang dan t erjadi pendarahan pada sirip, kulit sert a int er nal or gan. KHV per t am a k ali ber hasil diisolasi dari organ insang sert a gabungan g i n j al d an l i m f a (Hed r i ck et al., 2 0 0 0 ). Selanjut nya Neukirch & Kunz (2001), Ronen et al. (2 0 0 3 ) d an Per el b er g et al. (2 0 0 3 ) m elaporkan t elah berhasil m engisolasi virus yang ident ik dengan KHV dari ikan m as dan koi. Hedrick et al. (2005) berhasil mengisolasi KHV dari beberapa organ t arget ant ara lain insang, ginjal, limfa, usus, dan hati.
Up aya p em i l i h an sam p el yan g t ep at sangat penting untuk m endeteksi dan m eng-identifikasi penyakit KHV. Hal ini berhubungan dengan penget ahuan or gan yang m enj adi t ar g et s er an g an KH V, s eh i n g g a d ap at
m em udahkan dalam isolasi virus untuk kajian lebih lanjut . Adapun t ujuan dari penelit ian ini ad al ah u n t u k m en g et ah u i j ar i n g an yan g menjadi target infeksi KHV dengan cara isolasi vi r u s d ar i b eb er ap a or g an t ar g et d en g an menggunakan kultur sel KT- 2.
BAHAN DAN METODE
Kultur Sel
Kult ur sel yang dipakai dalam penelit ian ini adalah kultur sel KT- 2 yang dikembangkan di laboratorium kesehatan ikan (Sunarto et al., 2005b). Kult ur sel dit um buhkan dalam kult ur cawan 12 (12 multiwell plates) dengan m edia Lei b ovi t z ’ s L- 1 5 yan g m en g an d u n g Fet al Bovine Serum (FBS) 10%, Penicillin 250 IU, St rept om ycin 250 µg/ m L, Kanam ycin Sulf at 250 µg/ mL, dan L- glutamin2 mM. Untuk pasase isolat m urni, sel dikult ur pada flask kult ur dengan luas 25 cm2.
Ikan Sampel
Ik an uj i yang d igunak an unt uk isolasi vir us ad alah ik an m as yang secar a visual t erlihat sakit . Ikan diam bil dari Waduk Cirat a, Jawa Barat , yang pada wakt u t ersebut sedang mengalami kasus kematian massal. Gejala klinis ik an sak it adalah berenang di perm uk aan, lem ah, terjadi kerusakan insang dan sirip.
Isolasi Virus
Kem udian, kult ur sel diinkubasi pada suhu 25oC selam a 14 hari. Param et er yang diam at i adalah wak t u t erjadi CPE (onset) dan jenis kerusakan sel (cytopathic effects, CPE). Pasase b u t a (blind passage) d i l ak u k an u n t u k konfirmasi bahwa CPE yang terjadi disebabkan oleh inf eksi virus, bukan karena t oksisit as inokulum ekst rak jaringan. Pasase t ersebut dilakukan sebanyak 3 kali.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Uji PCR dilakukan dengan m enggunakan kits KHV (IQ- 2000, Taiwan) yang menghasilkan produk PCR pada 229 bp dan 440 bp. Tes ini d i l ak u k an u n t u k m em ast i k an b ah wa i k an sam pel yang digunakan dalam isolasi adalah t er i n f ek si KHV. Sam p el u j i d i am b i l d ar i gabungan (pooled) insang, ginjal, dan limfa. Tes PCR juga dilakukan untuk konfirmasi terhadap m ed i a k u l t u r d an sel y an g m en g al am i kerusakan (CPE) set elah diinokulasi dengan ekstrak jaringan ikan sakit.
HASIL DAN BAHASAN
Ikan yang dipakai untuk isolasi virus adalah ikan mas sakit yang diambil dari Waduk Cirata yan g sed an g m en g al am i k asu s k em at i an m assal dengan indikasi terinfeksi KHV. Hal ini ditandai dengan gejala klinis seperti produksi lendir yang berlebihan, insang putih, dan rusak (OATA, 2001). Hasil uji PCR dengan m eng-gunakan kits KHV (IQ- 2000, Taiwan) terhadap ikan mas sampel menunjukkan bahwa ikan sakit d i seb ab k an o l eh KHV. Den g an k at a l ai n , kem at ian m assal ikan m as di kolam budidaya tersebut disebabkan oleh KHV (Gam bar 1).
Perubahan yang t erjadi pada kult ur sel yang diinokulasi ekstrak jaringan organ target selama masa pengamatan disajikan pada Tabel 1.
Hasil pengam at an pada kult ur sel KT- 2 menunjukkan bahwa pada hari pertama sampai hari kelima setelah dilakukan inokulasi ekstrak jaringan, kondisi sel m asih norm al (t idak ada perubahan). Perubahan m ulai t eram at i pada hari keenam setelah inokulasi. Khususnya pada k u l t u r yan g d i i n o k u l asi d en g an ek st r ak jaringan insang, ginjal, dan gabungan organ (insang, ginjal, dan limfa). Tidak terlihat adanya perubahan pada kult ur sel yang diinokulasi dengan ekstrak jaringan dari organ otak, mata, hat i, jant ung, lim f a, dan usus, m aupun pada kult ur sel yang diinokulasi dengan m edium HBSS sebagai kontrol negat if (Gam bar 2).
Per ubahan yang nyat a pada k ult ur sel (CPE) yang diinokulasi ekst rak insang, ginjal, d an g ab u n g an (i n san g , g i n j al , d an l i m f a) mulai terlihat pada hari ke- 7. CPE yang teramati antara lain berupa vakuola- vakuola kecil pada kultur sel. Vakuola yang terlihat seperti bintik put ih dan berlubang t ersebut hanya t erdapat di beberapa bagian pada kult ur sel. Pada hari ke- 10, kerusakan sel yang terjadi mulai terlihat lebih nyat a yait u pem bent ukan vakuola yang lebih besar dan m enyebar di sebagian besar kultur sel. Terlihat juga individu sel (single cell) yan g t er p i sah d ar i sel - sel d i sek i t ar n ya. Set el ah h ar i k e- 1 1 vak u o l i sasi sem ak i n m em besar dan penyebarannya m erat a pada selur uh per m uk aan k ult ur . Vak uolisasi ini diikut i dengan t erjadinya pelepasan ( detach-ment) sel dari permukaan cawan kultur (Gambar 3). Pada hari ke - 14 sekitar 95% dari kultur sel m engalam i detachment.
Gambar 1. Hasi l u j i d et ek si KHV d en g an m enggunak an PCR d ar i ek st r ak jaringan ikan m as sakit dan sehat . 1. m arker DNA ladder 100 bp; 2. kontrol negatif; 3. Sampel ikan mas sehat, 4. ikan m as sakit, 5. kontrol positif
Figure 1. The result of PCR assay for KHV de-tection of tissue extract from un-healthy and un-healthy fish. 1. 100 bp DNA marker ladder; 2. negative control; 3. Healthy carp; 4. un-healthy carp, 5. positive control
Hasil pengam at an pada kult ur sel yang diinokulasi dengan isolat KHV (kontrol positif) yang diikuti dari hasil pasasenya menunjukkan CPE. CPE t er am at i pada har i k e- 4 set elah inokulasi, 3 hari lebih cepat dari CPE yang Tabel 1. Pengamatan pembentukan cytopathic effect (CPE) pada kultur sel KT- 2
Table 1. Observation of the formation of cytopathic effect (CPE) in KT-2 cell culture
Ket erangan (Note):
* ) = insang (gills), ginjal (kidney), lim f a (spleen)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2 1 3 14
In sang (Gills) - - - + + + + + + + + + + ++ + ++ + ++ Ginjal (Kidney) - - - + + + + + + + + + + ++ + ++ + ++ Ot ak (Brain) - - - -Mat a (Eyes) - - - -Hati (Liver) - - - -Jan tun g (Heart) - - - -Usus (Intestine) - - - -Limf a (Spleen) - - - -Gabu ng an organ*)
(Pooled of organ)
Kont rol posit if
(Positive control)
Kont rol neg atif
(Negative control)
Org an
Pe mb ent uk an CPE (CPE f or m a t ion)
- - - + + + + + + + + + + ++ + ++ + ++
- - - + + + ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++
- - -
-Pada akhir pengam at an selam a 14 hari, t i d ak t er l i h at ad an ya k er u sak an sel yan g menunjukkan CPE pada kultur yang diinokulasi dengan ekstrak jaringan dari otak, mata, limfa, hati, jantung, dan usus (Tabel 2).
Gambar 2. Isolasi KHV menggunakan kultur sel KT- 2. (A) Kultur sel KT- 2 yang diinokulasi dengan medium HBSS (kontrol negatif). (B) Kultur sel KT- 2 yang diinokluasi ekstrak jaringan organ target tetapi tidak menunjukkan CPE
Figure 2. Isolation of KHV using KT-2 cell culture. (A) KT-2 cell cultures inoculated with HBSS medium (negative control). (B) KT-2 cell cultures inoculated with tissue extracts from target tissue but did not showed CPE
t erjadi pada saat isolasi virus (kult ur sel yang diinokulasi dengan ekst rak jaringan insang, ginjal, dan gabungan (insang, ginjal, dan limfa) ikan m as sakit . CPE t ersebut dit andai dengan adanya vak uola k ecil di beberapa t em pat , k em u d i an b er k em b an g secar a ek st en si f . Pelepasan sel terjadi mulai hari ke- 7. Hasil yang
sam a dijum pai pada pasase yang dilakukan berulang dari pasase 1 sam pai pasase ke-3. Hasil PCR dengan m enggunakan kit s KHV (IQ- 2000) pada m edia kult ur dan sel yang menunjukkan CPE memperlihatkan hasil positif. Hal ini m enunjukkan bahwa kult ur sel benar-benar terinfeksi KHV (Tabel 3).
Tabel 2. Hasil isolasi virus dari beberapa organ target pada ikan mas Table 2. The isolated virus from several target organs in common carp
Org an t arg et Kerusakan sel
T a r g et or g a n Cyt oph a t h ic ef f ect / CPE
Otak (Brain)
-Mata (Eyes)
-Insang (Gills) +
Ginjal (Kidney) +
Limfa (Spleen)
-Hati (Liver)
-Jantung (Heart)
-Usus (Intestine)
-Gabungan insang, ginjal, dan limfa
Pooled of gills, kidney, and spleen
+
Kontrol negatif (Negative control, HBSS) -Kontrol positif (Positive control) +
Gambar 3. Kultur sel KT- 2 yang diinokulasi dengan ekstrak jaringan insang, ginjal, dan gabungan organ (insang, ginjal, dan limfa) menunjukkan CPE pada hari ke- 7 (A) dan hari ke- 10 (B) set elah inokulasi. a. Vakuola kecil, b. Vakuola besar, c. Pem bent ukan individu sel, dan d. Perm ukaan cawan yang kosong karena sel sudah t erlepas (detached) dari dasar cawan
Figure 3. KT-2 cell cultures inoculated with tissue extracts from gill, kidney, and pooled of organs (gills, kidney, and spleen) showed CPE on 7 (A) and 10 (B) post inoculation. a. small vacuoles, b. large vacuoles, c. development of a single cell, and d. empty space due to the cells have detached from the flask
A B
a
c
d b
Isolasi KHV pert am a kali dilakukan dari kasus kematian massal pada budidaya ikan mas di Israel dan Am erika dengan m enggunakan kultur sel KF- 1 (Hedrick et al., 2000). Meskipun p enyeb ar annya sangat cep at , p enyak it ini dilaporkan hanya m enyerang pada ikan m as dan koi (Perelberg et al., 2003). Di Indonesia, KHV p er t am a k al i b er h asi l d i i so l asi d ar i gabungan insang, ginjal, dan lim f a dari ikan k oi yang ber asal dar i k olam yang sedang mengalami kasus kematian massal di Jawa Barat dengan menggunakan kultur sel KT- 2 (Sunarto et al., 2005b, Sum iat i & Sunart o, 2009). CPE t eram at i pada hari k e- 6 set elah inok ulasi. Dem ikian halnya dengan penelit ian ini, CPE mulai teramati pada hari ke- 6 setelah inokulasi p ad a k u l t u r sel yan g d i i n o k u l asi d en g an ek st r ak j ar i n g an d ar i i n san g , g i n j al , d an gabungan (insang, ginjal, dan lim f a). Usaha isolasi virus dari otak, mata, limfa, hati, jantung, dan usus belum berhasil m enunjukkan CPE, namun hal ini tidak berarti bahwa organ- organ tersebut bukan merupakan target organ infeksi KHV. Ber d asar k an u j i PCR yan g p er n ah dilakukan, selain insang, ginjal, dan limfa, KHV juga terdeteksi ham pir dari sem ua organ ikan (Hedrick et al., 2000; Gray et al., 2002; Gilad et al., 2003; Gilad et al., 2004). Meskipun Hedrick et al. (2005) melaporkan telah berhasil m engisolasi KHV dari berbagai organ ant ara lain insang, ginjal, lim f a, usus, dan hat i, t api dinyat akan juga bahwa isolasi virus dengan
menggunakan kultur sel sangat sulit dilakukan. Kesu l i t an d al am i so l asi vi r u s KHV j u g a dilaporkan oleh beberapa negara t erm asuk Jepang (Sano et al., 2004), Taiwan (Tu et al., 2004), Thailand (Pikulkaew et al.,2009), dan Filipina (Som ga et al., 2010). Hal ini diduga k ar en a vi r i on KHV san g at l ab i l , seh i n g g a sam pel unt uk keperluan isolasi virus perlu p en an g an an k h u su s. Gi l ad et al. (2 0 0 4 ) m elaporkan bahwa sam pel unt uk isolasi KHV harus diproses dalam hit ungan jam set elah ikan m at i dan cukup sulit unt uk m elakukan isolasi KHV dari sam pel yang t elah disim pan beku. Sunarto et al. (2011) melaporkan bahwa kesulit an isolasi KHV dapat disebabkan oleh beberapa hal antara lain: (1) terbatasnya kultur sel yang cocok untuk isolasi KHV, (2) kesulitan m em elihara kult ur sel yang ada, (3) kult ur sel yang ada kurang sensitif untuk isolasi KHV, (4) t it er yang t inggi pada saat infeksi KHV sangat singkat.
Berdasar hasil riset ini, unt uk keperluan diagnosa dan isolasi virus hidup, sebaiknya digunakan organ insang at au ginjal sepert i dinyat akan juga oleh Hedrick et al. (2000), Gray et al. (2002), dan Gilad et al. (2003). Keberhasilan isolasi virus dari jaringan organ insang, ginjal dan gabungan organ (insang, g i n j al , d an l i m f a) m u n g k i n d i seb ab k an konsent rasi virus di insang, ginjal, dan lim f a sangat t inggi yait u 108- 109 virus per 106 sel ikan (Gilad et al., 2004).
Tabel 3. Hasil uj i PCR p ad a m ed ia k ult ur d an sel d ar i k ult ur sel yang menunjukkan CPE
Table 3. The results of PCR assays on the cell culture medium and cells from cell cultures showing CPE
Sel M ed ia kult ur sel
Cell Cell cult ur e m ed ium
Inokulasi dengan ekstrak jaringan ginjal, insang dan gabungan organ*)
Inoculated with tissue ex tracts from gills,
kidney, and pooled of organ*)
Sam p ai saat i ni b el um ad a ob at yang ef ekt if unt uk penyakit KHV. Oleh karena it u, p en an g g u l an g an p en yak i t KHV l eb i h d i -f okuskan pada st rat egi pencegahan. Upaya p en an g g u l an g an h ar u s b er b asi s r am ah l i n g k u n g an . Up aya p en ceg ah an d en g an m et ode vak sinasi m enjadi solusi alt ernat if yan g b i sa d i l ak u k an . Keb er h asi l an d al am isolasi KHV di Indonesia dengan menggunakan kult ur sel diharapkan dapat dijadikan acuan d al am p r og r am vak si n asi u n t u k p en an g -gulangan penyakit KHV.
KESIMPULAN DAN SARAN
Koi her p esvir us b er hasil d iisolasi d ar i jaringan organ insang, ginjal, dan gabungan organ (insang, ginjal, dan lim fa) ikan m as dari Waduk Cirat a. Hasil uji PCR dari m edia kult ur sel d an sel y an g m em p er l i h at k an CPE menunjukkan bahwa CPE disebabkan oleh KHV.
Unt uk k eper luan isolasi vir us KHV di-sarankan m enggunakan sam pel dari organ insang, ginjal at au gabungan insang, ginjal dan lim f a. Diagnosa penyak it KHV dengan m en g g u n ak an m et o d e l ai n sep er t i PCR, h i b r i d i sasi in situ d an ELISA d i sar an k an m enggunakan sam pel dari ginjal dan insang.
DAFTAR ACUAN
Freshney, R.I. 1994. Cult ure of anim al cells: A m anual of basic t echnique. 3rd ed. Wiley-Liss. Inc. USA, 486 pp.
Gilad, O., Yun, S., Andree, K.B., Adkison, M.A., Way, K., Willit s, N.H., Ber covier , H., & Hedrick, R.P. 2003. Molecular comparison of isolat es of an em erging fish pat hogen, t he k oi her p esvir us, and t he ef f ect of water temperature on mortality of ex peri-m ent ally infect ed koi. J. Gen. Virol.,84: 2,661- 2,668.
Gi l ad , O., Yu n , S., Zag m u t t - Ver g ar a, F., Leu t en eg g er , C. M. , Ber co vi er , H. , & Hedrick, R.P. 2004. Concent rat ions of a herpes- like virus (KHV) in tissues of experi-m ent ally- infect ed Cyprinus carpio koi as assessed by real- t im e TaqMan PCR. Dis. Aquat. Org.,60: 179- 187.
Gray, W.L., Mullis, L., LaPatra, S.E., Groff, J.M., & Goodwin, A. 2002. Detection of koi herp-esvirus DNA in t issues of infect ed fish. J. Fish. Dis.,25: 171- 178.
Hedrick, R.P., Gilad, O., Yun, S., Spangenberg, J.V., Marty, G.D., Nordhausen, R.W., Kebus M.J., Bercovier, H., & Eldar, A. 2000. A
herp-esvirus associat ed wit h m ass m ort alit y of juvenile and adult koi, a strain of a common carp. J. Aquat. Anim. Health.,12: 44- 57. Hedrick, R.P., Gilad, O., Yun, S.C., Mcdowell, T.S.,
Waltzek, T.B., Kelley, G.O., & Adkison, M.A. 2005. Initial isolation and characterization of a herpes- like virus (KHV) from koi and common carp. Bull. Fish. Res. Agen. Supple-ment, 2: 1- 7.
Hoffman, R.W., Just, J., & El- Matbouli, M. 2002. Ko i h er p esvi r u s i n f ect i o n i n k o i an d com m on carp in Germ any. Abstract of 10 International Conference of the European Association of Fish Pathologist, Dublin, Germany, 131 pp.
Neukrich, M. & Kunz. 2001. Isolation and pre-liminary characterization of several viruses from koi (Cyprinus carpio) suffering gill necrosis and m ort alit y. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 21(4): 125- 135.
Ornamental Aquatic Trade Association (OATA). 2 0 0 1 . Koi Her p es Vi r us (KHV). OATA, Wetsbury, Wilts, UK, p. 4- 33.
Perelberg, A., Smirnov, M., Hutoran, M., Diamant, A., Bejerano, I., & Kot ler, M. 2003. Epide-m i o l o g i cal d escr i p t i o n o f a n ew vi r al disease afflicting cultured Cyprinus carpio in Israel. Isr. J. Aquacult. Bamidgeh, 55: 5-12.
Pikulkaew, S., Meeyam, T., & Banlunara, W. 2009. The outbreak of koi herpesvirus (KHV) koi (Cyprinus carpio koi) from Chiang Mai Prov-ince, Thailand. Thai Journal of Veterinary Medicine, 39: 53–58.
Ronen, A., Perelberg, A., Abramowitz, L., Hutoran, M., Tinm an, S., Bejerano, I., St evit z, M., & Kot ler, M. 2003. Efficient vaccine against t he virus causing a let hal disease in cul-t ure Cyprinus carpio. Vaccine, 21: 4,677-4,684.
Sano, M., Ito, T., Kurita, J., Yuasa, K., Miwa, S., & Iida, T. 2004. Ex perience on common carp m ass m o r t al i t y i n Jap an . 2 0 0 4 . i n “Transboundary fish Disease in Southeast Asia: Occurrence, Surveillance, Research and Training” (Eds.) C.R. Lavilla- pitogo, C.R. & Nagasawa, K. SEAFDEC Aq uacult ur e Department, Ilo- Ilo, Philippines, p. 13- 21. Somga, J.R., de la Pena, l.D., Sombito, C.D., Paner,
Sumiati, T. & Sunarto, A. 2009. Susceptibility of Cyprinid and Non-Cyprinid Fish Cell Lines to Koi herpesvirus (KHV). Indonesian Aqua-culture Journal, 4(2): 131–137.
Sunart o, A. & Cam eron, A. 2005. Response t o m ass m ortality of carp: an Indonesian ex -periences. In Subasinghe, R.P. & Arthur, J.R. (Eds.) Regional Workshop on Preparedness and Response t o Aquat ic Anim al Healt h Em ergencies in Asia. FAO Fisheries Pro-ceedings. No. 4. Rome, p. 87- 106.
Sunarto, A., Taukhid, Rukyani, A., Koesharyani, I., Supriyadi, H., Huminto, H., Agungpriyono, D.R., Pasaribu, F.H., Widodo, Herdikiawan, D., Rukm ono, D., & Prayit no, S.B. 2005a. Field investigation on serious disease out-b r eak am o n g k o i an d co m m o n car p (Cyprinus carpio) in Indonesia. In Walker, P.J., R.G. Lester and M.G. Bondad Reantaso (eds). Diseases in Asian Aquaculture V. Fish Healt h Sect ion, Asian Fisheries Society, Manila, p. 125- 136.
Sunarto, A., Sumiati, T., Koesharyani, I., Hyatt, A., & Itam i, T. 2005b. Developm ent of cell line from t ail of koi (Cyprinus carpio) and isolat ion of koi herpesvirus from
Indone-sia aquaculture. Book of abstracts 6th Sym-posium on Diseases in Asian Aquaculture, 25- 28 October 2005. Colombo. Srilanka, 74 pp.
Sunarto, A., McColl, K.A., Crane, M.St., Sumiati, T., Hyat t , A.D., Barnes, A.C., & Walker, P.J. 2011. Isolation and characterization of koi herpesvirus (KHV) in Indonesia: identifica-t ion of a new geneidentifica-t ic lineage. Journal of Fish Diseases, 34: 87–101.
Tu, C., Lin, S.Y., & Sung, H.T. 2004. Current sta-t us of Koi herpesvirus disease in Taiwan. 2004. in “Transboundary fish Disease in Sout heast Asia: Occurrence, Surveillance, Research and Training” (Eds.) Lavilla- pitogo, C.R. & Nagasawa, K. SEAFDEC Aquaculture Department, Ilo- Ilo, Philippines, p. 21- 24. Way, K., Le Deuff, R.M., Ecclest one, L., Feist ,
