Metabolisme Lemak
D. KOMPONEN ENZIM
4. Isolasi Enzim dan Pemurnian Enzim
Enzim dapat diisolasi secara ekstraseluler dan intraseluler. Enzim ekstraseluler merupakan enzim yang bekerja di luar sel, sedangkan enzim intraseluler merupakan enzim yang bekerja di dalam sel. Ekstraksi enzim ekstraseluler lebih mudah dibandingkan ekstraksi enzim intraseluler, karena tidak memerlukan pemecahan sel dan enzim yang dikeluarkan dari sel mudah dipisahkan dari pengotor lain serta tidak banyak bercampur dengan bahan- bahan sel lain.
a. Sentrifugasi
Sentrifugasi merupakan tahap awal pemurnian enzim. Metode ini digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa sel. Sentrifugasi akan menghasilkan supernatan yang jernih dan endapan yang terikat kuat pada dasar tabung, yang kermudian dipisahkan secara normal. Sel-sel mikroba biasanya mengalami sedimentasi pada kecepatan 5000 selama 15 menit, prinsip sentrifugasi berdasarkan pada kenyataan bahwa setiap partikel yang berputar pada laju sudut yang konstan akan memperoleh gaya keluar (F). Besar gaya ini bergantung pada laju sudut ω (radian/detik) dan radius pertukarannya (sentimeter).
b. Fraksinasi dengan ammonium sulfat Presipitasi
Merupakan proses penambahan senyawa yang dapat menggumpalkan dan memisahkan protein dari bahan lain sehingga didapatkan protein yang lebih murni.
Presipitasi protein merupakan metode yang berguna untuk pemekatan protein dan sering dilakukan pada tahap awal dari pemurnian enzim. Presipitasi protein dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain perubahan pH, penambahan pelarut organik dan penambahan garam. Pemekatan protein dengan penambahan garam ke dalam larutan enzim merupakan cara yang banyak dilakukan. Garam yang dapat digunakan berupa natrium klorida, natrium sulfat, atau ammonium sulfat. Ammonium sulfat lebih sering digunakan karena memiliki beberapa kelebihan dibandingkan garam-garam yang lain, yaitu mempunyai kelarutan yang tinggi, tidak mempengaruhi aktivitas enzim, mempunyai daya pengendapan yang efektif, mempunyai efek penstabil terhadap kebanyakan enzim, dapat digunakan pada berbagai pH dan harganya murah. Penambahan garam pada konsentrasi tinggi akan menurunkan kelarutan protein. Hal ini dikarenakan adanya peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan menarik molekul-molekul air dari protein. Interaksi hidrofobik sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi akan menyebabkan pengendapan protein, yang disebut salting out. Protein yang hidrofobisitasnya tinggi akan mengendap lebih dahulu, sedangkan protein yang memiliki sedikit residu non polar akan tetap larut meskipun pada konsentrasi garam yang paling tinggi
c. Dialisis
Salah satu metode yang digunakan untuk meningkatkan kemurnian enzim adalah dialisis. Prinsip dialisis yaitu memisahkan molekul-molekul besar dari molekul-molekul kecil dengan bantuan membran semipermeable. Dialisis berfungsi untuk memisahkan garam- garam anorganik agar tidak mengganggu tahap pemurnian enzim selanjutnya. Dialisis dapat dilakukan dengan menggunakan kantong selofan, kantong ini memiliki ukuran pori-pori yang lebih kecil dari ukuran protein sehingga protein tidak dapat keluar dari kantong selofan.
Penggunaan kantong selofan memiliki beberapa keuntungan yaitu mudah digunakan, memiliki harga yang relatif murah dan mudah didapatkan. Proses dialisis berlangsung karena adanya perbedaan konsentrasi zat terlarut di dalam dan di luar membran. Difusi zat terlarut bergantung pada suhu dan viskositas larutan. Meskipun suhu tinggi dapat meningkatkan laju difusi, namun sebagian besar protein dan enzim stabil pada suhu 4-8oC sehingga dialisis harus dilakukan di dalam ruang dingin. Pada proses dialisis, larutan enzim dimasukan kedalam kantung dialisis yang terbuat dari membran semipermeable (selofan). Jika kantung
yang berisi larutan enzim dimasukan ke dalam larutan buffer, maka molekul protein kecil yang ada di dalam larutan protein atau enzim seperti garam anorganik akan keluar melewati pori-pori membran, sedangkan molekul enzim yang berukuran besar tetap tertahan dalam kantung dialisis. Keluarnya molekul menyebabkan distribusi ion-ion yang ada di dalam dan di luar kantung dialisis tidak seimbang. Untuk memperkecil pengaruh ini digunakan larutan buffer dengan konsentrasi rendah di luar kantung dialisis. Setelah tercapai keseimbangan, larutan diluar kantung dialisis dapat dikurangi. Proses ini dapat dilakukan secara kontinu sampai ion-ion di dalam kantung dialisis dapat diabaikan.
LATIHAN
Untuk memperdalam pemahaman Anda mengenai materi di atas, kerjakanlah latihan berikut!
1) Sebutkan dan jelas sub kelas dari enzim oksidoreduktase ! 2) Jelaskan dan gambarkan cara kerja enzim !
3) Sebutkan beberapa enzim yang dapat diperoleh dari hewan dan tumbuhan!
RINGKASAN
Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk reaksi-reaksi kimia didalam sistem biologi. Katalisator mempercepat reaksi kimia. Walaupun katalisator ikut serta dalam reaksi, ia kembali ke keadaan semula bila reeaksi telah selesai. Seperti halnya katalisator, enzim dapat mempercepat reaksi kimia dengan menurunkan energi aktivasinya.
Perubahan suhu dan pH mempunyai pengaruh besar terhadap kerja enzim. Kecepatan reaksi enzim juga dipengaruhi oleh konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat. Pengaruh aktivator, inhibitor, koenzim dan konsentrasi elektrolit dalam beberapa keadaan juga merupakan faktor-faktor yang penting. Hasil rekasi enzim juga dapat menghambat kecepatan reaksi.
Fungsi suatu enzim ialah sebagai katalis untuk suatu proses biokimia yang terjadi dalam sel maupun di luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat daripada suatu reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis.
Enzim mempunyai kekhasan yaitu hanya bekerja pada satu reaksi saja. Untuk dapat bekerja terhadap suatu zat atau substrat harus ada hubungan atau kontak antara enzim dengan substrat.Oleh karena itu tidak seluruh bagian enzim dapat berhubungan dengan substrat.Hubungan antara substrat dengan enzim hanya terjadi pada bagian atau tempat tertentu saja.Tempat atau bagian enzim yang mengadakan hubungan atau kontak dengan substrat dinamai bagian aktif (active site).Hubungan hanya mungkin terjadi apabila bagian aktif mempunyai ruang yang tepat dapat menampung substrat. Apabila substrat mempunyai bentuk atau konformasi lain, maka tidak dapat ditampung pada bagian aktif suatu enzim.
Dalam hal ini enzim itu tidak dapat berfungsi terhadap substrat.Ini adalah penjelasan mengapa tiap enzim mempunyai kekhasan terhadap substrat tertentu.Secara tradisional tripsin dan lipase pankreas diperoleh dari sumber hewani.Tanaman juga merupakan sumber
enzim.Beberapa protein biasa diperoleh dari getah pepaya, nanas dan tumbuhan lainnya.Selain itu, kecambah barley juga sering digunakan sebagai sumber enzim.
TES 1
Pilihlah satu jawaban yang paling tepat!
1) Sebagian besar enzim didalam tubuh akan menunjukan aktivitas optimum antara pH : A. 1 – 3
B. 4 C. 5 – 9 D. 10 – 12
2) Faktor – faktor berikut yang tidak dapat mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatis adalah :
A. Suhu B. pH
C. Konstanta keseimbangan reaksi D. Inhibitor
3) Yang manakah diantara enzim dibawah ini yang mengkatalis reaksi berikut:
Asetat + CoA-SH + ATP <–> Asetil CoA + AMP + P-P A. Dekarboksilase
B. Asetat C. Transfarase D. Hidrolase
4) Enzim yang memecah ikatan ester dengan cara hidrolisis : A. Lipase
B. Amilase C. Esterase D. Protease
5) Enzim yang dapat memecah ikatan-ikatan pada amilum sehingga terbentuk maltosa adalah :
A. Lipase B. Amilase C. Esterase D. Protease
6) Enzim yang memecah ikatan ester pada lemak sehingga terjadi asam lemak dan gliserol:
A. Lipase B. Amilase C. Esterase D. Protease
7) Enzim yang memerlukan ion logam sebagai kofaktornya dinamakan : A. Holoenzim
B. Metaloenzim
8) IsoenzimPeningkatan jumlah tripsinogen I (salah satu isozim dari tripsin) hingga 400x menunjukkan adanya :
A. Hepatitis
B. Pankreasitis akut C. Penyumbatan darah D. Asam urat
9) Uricase yang berasal dari jamur Candida utilis dan bakteri Arthobacter globiformis dapat digunakan untuk mengukur :
A. Tekanan darah B. Glukosa dalam darah C. Asam urat
D. Kolesterol
10) Enzim yang lazim digunakan dalam teknik EMIT (Enzim Multiplied Immunochemistry Test) adalah :
A. lisozim B. Amilase C. Esterase D. Protease