Larutan stok standar dari sebelas antihistamin yang dipelajari (1,00 mg mL 1 ) dan larutan stok standar internal (diazepam-d5 pada 1,00 mg mL 1 , hydroxyzine-d4 pada 250,0 mg mL 1 dan
cetirizine-d8 pada 200,0 mg mL 1 ) disiapkan secara terpisah dalam asetonitril atau metanol. Larutan stok tambang antihista dicampur dengan benar dan diencerkan dengan asetonitril untuk menyiapkan larutan kerja campuran 10,00 mg mL1 yang menahan kesebelas antihistamin. Solusi kerja yang disiapkan ini kemudian diencerkan dengan asetonitril pada konsentrasi 0,10, 1,00 dan 2,00 mg mL 1.
Solusi kerja di atas (0,10, 1,00, 2,00 dan 10,00 mg mL 1 ) digunakan untuk persiapan batas quantication (LOQ), kalibrasi dan sampel kontrol kualitas (QC). Tiga larutan kerja lagi pada konsentrasi 0,10, 2,00 dan 10,00 mg mL1 digunakan untuk persiapan sampel kontrol kualitas (QC).
Sampel darah utuh berduri disiapkan dengan spiking 1 mL darah utuh kosong dengan 50 dan 100 mL dari 0,10 mg mL 1, 30 dan 50 mL dari 1,00 mg mL 1, 75 mL dari 2,00 mg mL 1, dan 50 dan 100 mL dari 10,00 mg mL 1 larutan kerja standar campuran. Tujuh kalibrator berisi sebelas antihistamin pada konsentrasi yang sama 5,00, 10,00, 30,00, 50,00, 150,0, 500,0 dan 1000,0 ng mL 1, dan sampel QC disiapkan pada tiga tingkat konsentrasi (15,00, 200,0 dan 800,0 ng mL 1). Larutan stok standar internal (diazepam-d5, hydroxyzine-d4 dan cetirizine-d8) juga dicampur dan diencerkan dengan asetonitril dengan benar untuk memberikan larutan standar internal kerja campuran pada konsentrasi 10,00 mg mL 1 . Solusi ini digunakan untuk meningkatkan sampel kalibrasi, QC, dan casework. Semua stok dan solusi kerja disimpan pada suhu 4 C setidaknya selama dua bulan dan terbukti stabil.
Antihistamin diekstraksi dari sampel darah utuh sebagai berikut: 30 mL larutan standar internal kerja (10,00 mg mL 1 ) ditambahkan ke 1,0 mL sampel darah utuh berduri (LOQ, kalibrasi, dan QC) dan casework; dengan demikian, konsentrasi masing-masing standar internal di semua sampel adalah 300,0 ng mL 1. Kemudian, volume 2 mL asetonitril ditambahkan ke semua sampel, di bawah
pencampuran pusaran, untuk presipitasi protein, dan sampel disentrifugasi pada 2000 rpm selama 5 menit. Supernatan dikumpulkan dan diuapkan hingga 1,0 mL di bawah aliran lembut N2 pada suhu kamar. Kemudian, pH semua sampel disesuaikan menjadi 4,0 dengan penambahan 5 mL campuran buffer asetat yang baru disiapkan (pH 4,0; 0,1 M): metanol (95: 5, v / v) dan sampel disentrifugasi pada 2000 rpm selama 10 menit. Kolom SPE Bond Elut LRC Certify II dikondisikan dengan 3 mL metanol dan 3 mL campuran buffer asetat yang baru disiapkan (pH 4,0; 0,1 M): metanol (95: 5, v / v) sebelum pemuatan sampel. A er pemuatan sampel, kolom kemudian dicuci dengan 3 mL air deionisasi dan dikeringkan di bawah vakum tinggi $ 10 mm Hg selama 5 menit a er penambahan 70 mL aseton. Semua antihistamin, kecuali cetirizine, dielusi dua kali dengan 2 mL campuran dichlor omethane yang baru disiapkan: isopropanol: amonium hidroksida (85: 15: 3, v / v / v). Kemudian, kolom dicuci lagi dengan 1 mL air deionisasi dan dikeringkan di bawah vakum tinggi $ 10 mm Hg selama 5 menit penambahan 70 mL n-heksana. Cetirizine dielusi dua kali dengan 2 mL campuran dichlor omethane yang baru disiapkan : isopropanol : asam asetat glasial (85 : 15 : 3, v / v / v). Eluat dikumpulkan dalam tabung bersih dan diuapkan hingga kering di bawah aliran lembut N2 pada suhu 40 C. Derivatisasi sampel yang diekstraksi dicapai dengan menambahkan 100 mL campuran anhidrida asetat yang baru disiapkan: n-propanol (1: 1, v / v) dan inkubasi pada suhu 70 C selama 30 menit.
Aer pendinginan, semua larutan turunan evapo dinilai kekeringan di bawah aliran lembut N2 pada suhu kamar dan sampel dipindahkan ke botol auto-sampler aer rekonstitusi dengan 70 mL etil asetat. 1 mL disuntikkan ke dalam sistem GC-MS (mode splitless).
The precision and accuracy of the method were estimated as the relative standard deviation (% RSD) and the percentage difference from the expected concentration (% Er), respectively. These
parameters were calculated by analyzing six (intra-day) and thirty (inter-day) spiked whole blood samples at the three QC levels. The results for accuracy and precision at the three QC levels for all analytes are presented in Table 3
The quantification of the selected NPS was performed using an Acquity UPLC I class system (Waters Associates) for the chromatographic separation coupled to a triple quadrupole (Xevo TQ-S micro) mass spectrometer equipped with an orthogonal Z-spray-electrospray interface (ESI) (Waters Associates, Milford, MA, USA). Nitrogen was used as drying and nebulizing gas. The desolvation gas flow was set to 1200 L/h and the cone gas flow to 50 L/h. A capillary voltage of 3 kV was used in positive ionization mode. The nitrogen desolvation temperature was set to 600ºC and the source temperature to 150ºC. Argon was used as collision gas and the injection volume was 10 µL.
The chromatographic separation was achieved at 55ºC using an Acquity UPLC BEH C18, (1.7 µm, 2.1 x 100 mm) (Waters Associates), at a flow rate of 300 µL/min. Mobile phase A was ammonium formate 1 mM with formic acid (0.01% v/v) in methanol. Mobile phase B was ammonium formate 1 mM with formic acid (0.01% v/v) in water. A gradient program was used for the separation of the analytes; the percentage of mobile phase A linearly changed as follows: 0 min, 15%; 1 min, 15%; 7.9 min, 95%; 8 min, 99%; 8.5 min, 99%; 9 min, 15%; 10 min, 15%. Analytes were determined by a Selected Reaction Monitoring (SRM) method by acquiring two transitions for each compound. MassLynx software V4.1 and TargetLynx XS were used for data management.
