Nama: Nisrina Nur Azizah NPM: 2206049022
Kelompok: B9
I. LEMBAR PENGAMATAN
HASIL UJI KOLIFORM SECARA KUALITATIF DENGAN METODE PRESENT-ABSENT TEST
Amati perubahan warna dan perpendaran medium Readycult Coliforms dalam falcon lalu lengkapi table di bawah ini :
Tabel 1. Hasil uji koliform dengan metode present-absent test
Sampel
Hasil Pengamatan 24 jam
Perubahan warna Perpendaran
Minuman/ Air (Cair)
Hasil : Perubahan Warna/Perpendaran: + : warna berubah/berpendar;
- : tidak berubah warna/tidak berpendar
*Sertakan dokumentasi hasil uji koliform
HASIL PENGAMATAN PURIFIKASI BAKTERI KOLIFORM PADA MEDIUM SELEKTIF DIFFERERNSIAL
Amati warna koloni yang tumbuh pada medium selektif-differensial lalu lengkapi tabel di bawah ini :
Tabel 2. Hasil pengamatan gores kuadran
Koloni
Medium
CCA EMBA
24 jam 48 jam 24 jam 48 jam
Ungu - -
Pink + +
Hijau metalik - -
Coklat-merah + +
Hasil : + : terdapat koloni ; - : tidak ada koloni
*Sertakan dokumentasi hasil gores kuadran
Medium 24 jam 48 jam
CCA
EMBA
HASIL UJI KOLIFORM SECARA KUANTITATIF DENGAN METODE MULTIPLE TUBE FERMENTATION (MTF)
Sampel uji :
Amati perubahan warna dan perpendaran medium Readycult Coliforms serta pembentukan cincin indol merah lalu lengkapi table di bawah ini :
Tabel 3. Hasil uji koliform dengan metode multiple tube fermentation (MTF) Hasil Pengamatan
Perubahan Warna Perpendaran
Ganda Tunggal 1 Tunggal 2 Ganda Tunggal 1 Tunggal 2
3 2 1 3 2 1
Hasil : diisi jumlah tabung yang berubah warna dan berpendar
*Sertakan dokumentasi hasil uji koliform
II. PERTANYAAN
Jawablah pertanyaan di bawah ini berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh.
Sertakan referensi dalam setiap jawaban yang dituliskan.
1. Berdasarkan hasil pengamatan uji koliform teknik present-absent test, apakah di dalam sampel Saudara mengandung bakteri koliform dan/atau E. coli?.
Jelaskan berdasarkan apa Saudara menentukan hal tersebut.
Dari hasil pengujian yang dilakukan oleh kelompok 7, tidak ada deteksi bakteri koliform dalam sampel yang diuji, yaitu dalam sampel cair. Hal ini didasarkan oleh absennya perubahan warna pada medium uji, sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa keberadaan bakteri koliform biasanya ditandai oleh perubahan warna menjadi biru indigo akibat reaksi enzimatik antara substrat X-GAL dalam medium readycult 100 dengan enzim β-galactosidase yang dimiliki oleh bakteri koliform. Dari penjelasan tersebut, dapat disimpulkan bahwa baik sampel es batu (cair) tidak mengandung bakteri koliform karena tidak ada perubahan warna yang diamati selama inkubasi 24 hingga 48 jam. Selain itu, ketika sampel tersebut dipapar sinar UV, tidak ada perubahan warna yang berarti tidak ada bakteri E. coli yang terdeteksi. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa sampel yang terkontaminasi oleh bakteri E. coli akan menunjukkan perubahan warna dan fluoresensi ketika terkena sinar UV (Cappuccino & Sherman 2014: 261—265;
Merck 2010: 411; Naratama & Santoso 2020: 4).
2. Sebutkan dan jelaskan komposisi medium yang digunakan dalam uji koliform present-absent test dan MTF. Substrat apa yang berperan dalam membedakan bakteri koliform dengan E. coli?
Medium Kromogenik-Fluorogenik yang digunakan dalam uji koliform present-absent test dan MTF adalah Readycult Coliforms 100. Komposisi medium Readycult Coliforms secara umum terdiri dari Tryptose sebanyak 0.25 gram, Sodium chloride sebanyak 0.25 gram, Sorbitol sebanyak 0.05 gram, Tryptophan sebanyak 0.05 gram, Di-potassium hydrogen phosphate sebanyak 0.135 gram, Potassium dihydrogen phosphate sebanyak 0.1 gram, Lauryl sulfate sodium salt sebanyak 0.005 gram, X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D- galactopyranoside) sebanyak 0.004 gram, MUG (4-methylumbelliferyl ß-D- glucuronide) sebanyak 0.0025 gram, dan IPTG (Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranoside) sebanyak 0.005 gram (Merck 2010: 410)
Lauryl sulfate bertugas sebagai penghambat untuk bakteri gram positif dalam medium Readycult Coliforms. Komposisi buffer fosfat dan triptosa hadir untuk mempercepat perkembangan bakteri koliform dengan menyediakan sumber nitrogen yang cukup. Natrium klorida berfungsi untuk menjaga keseimbangan osmotik yang optimal bagi pertumbuhan bakteri koliform. IPTG digunakan untuk meningkatkan aktivitas kromogenik, sementara triptofan memperkuat reaksi indol.
Substrat yang membedakan bakteri koliform dari E. coli adalah methylumbelliferone yang terikat dalam komponen MUG (4-methylumbelliferyl-β- D-glucuronide), yang mengalami perubahan saat terjadi reaksi enzimatik spesifik.
Senyawa tersebut dilepaskan oleh enzim β-glucuronidase yang dihasilkan oleh bakteri fecal koliform E. coli. Methylumbelliferone yang terlepas dapat terdeteksi melalui cahaya UV, memungkinkan identifikasi bakteri E. coli dari koliform
lainnya (Cappuccino & Sherman 2014: 261—265; Merck 2010: 410; ITW Reagents 2013: 1).
3. Berdasarkan hasil pengamatan MTF yang Saudara lakukan, berapa estimasi jumlah bakteri koliform dan E. coli dalam sampel?
Berdasarkan hasil pengamatan MTF, jumlah tabung yang berubah warna (positif koliform) dan berpendar positif (E. coli) adalah 3-2-1, dengan begitu jumlah estimasi bakteri koliform dan bakteri E. coli sebanyak 17 bakteri (Cappuccino &
Sherman: 229—235; Santoso 2023: 5).
4. Mengapa volume sampel yang dimasukkan ke dalam tabung Ganda dan Tunggal pada uji koliform Teknik MTF berbeda-beda, walaupun volume medium sama?
Metode MTF (Multiple Tube-Fermentation) digunakan untuk menentukan kepadatan bakteri koliform dalam sampel. Variasi volume sampel yang dimasukkan ke dalam tabung ganda dan tunggal adalah untuk memastikan pengenceran yang sesuai dengan medium. Jumlah tabung positif cenderung meningkat dengan peningkatan volume sampel, yang dapat mengakibatkan hasil yang kurang akurat.
Oleh karena itu, pengurangan volume sampel disesuaikan dengan mediumnya untuk mencapai konsentrasi mikroorganisme yang tepat. Hal ini dilakukan melalui pengenceran hingga mencapai tingkat tertentu, memastikan frekuensi pertumbuhan positif yang sesuai untuk hasil yang lebih akurat. Misalnya, pada tabung ganda, volume sampel biasanya diencerkan dengan perbandingan 1:1 dengan medium, sementara pada tabung tunggal, perbandingannya adalah 1:10 atau bahkan 1:100 untuk memastikan akurasi hasil yang optimal (Cappuccino & Sherman: 261—265:
Jiwintarum dkk. 2017: 15—16; Willey dkk. 2020: 648).
5. Mengapa dapat terbentuk cincin indol merah pada medium yang mengandung E. coli?
Pembentukan cincin indol merah pada medium uji koliform setelah pemberian KOVAC’S indole reagent menunjukkan adanya bakteri E. coli dalam sampel. Proses ini dipicu oleh reaksi antara indole reagent, yang merupakan substrat triptofan, dengan enzim tryptophanase yang dihasilkan oleh E. coli. Tryptophan yang terdapat dalam medium Readycult 100 diuraikan oleh tryptophanase, menghasilkan senyawa indol yang kemudian membentuk cincin merah sebagai tanda keberadaan bakteri E. coli (Koneman dkk 2016: 452—453; Naratama &
Santoso 2020: 4).
6. Sebutkan dan jelaskan komposisi medium selektif-differensial (CCA dan EMBA). Substrat apa yang berperan dalam membedakan bakteri koliform dengan E. coli?
Medium CCA (Chromocult Coliform Agar) memiliki komposisi yang terdiri dari beberapa bahan utama. Pepton sebanyak 3.0g, sodium chloride sebanyak 5.0g, sodium dihydrogen phosphate sebanyak 2.2g, dan di-sodium hydrogen phosphate sebanyak 2.7g memberikan dasar nutrisi yang penting untuk pertumbuhan bakteri.
Sodium pyruvate sebanyak 1.0g dan tryptophane sebanyak 1.0g menyediakan sumber karbon dan nitrogen yang penting dalam metabolisme bakteri. Agar-agar sebanyak 10.0g digunakan sebagai pengental dalam medium agar. Sorbitol
sebanyak 1.0g berfungsi sebagai sumber karbon tambahan. Tergitol@7 sebanyak 0.15g berperan sebagai agen penghambat untuk menghambat pertumbuhan bakteri non-koliform yang mungkin ada dalam sampel. Terakhir, campuran kromogenik sebanyak 0.4g memberikan sifat kromogenik pada medium, memungkinkan identifikasi dan pemisahan bakteri koliform berdasarkan warna yang dihasilkan saat tumbuh (Merck 2010: 235).
Komponen seperti pepton, piruvat, sorbitol, dan buffer fosfat berfungsi untuk merangsang pertumbuhan bakteri koliform dengan cepat dalam medium CCA.
Tergitol bertindak sebagai penghambat, menekan pertumbuhan bakteri gram positif dan negatif yang dapat memengaruhi hasil pengujian. Natrium klorida menjaga keseimbangan osmotik yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri koliform.
Dalam membedakan bakteri koliform dan E. coli, substrat X-Glucuronide dan Salmon-GAL digunakan. Bakteri E. coli menghasilkan koloni biru gelap keunguan karena reaksi antara X-Glucuronide dan enzim β-D-glukuronidase, sementara bakteri koliform menghasilkan warna merah muda karena interaksi antara Salmon- GAL dan enzim β-D-galaktosidase. Selain substrat kromogenik, triptofan juga penting untuk memperkuat reaksi indol, meningkatkan akurasi hasil akhir (Merck 2010: 235; ITW Reagents 2013: 1).
Medium EMBA (Eosin Methylene-blue Lactose Sucrose Agar) terdiri dari beberapa komponen penting untuk mendukung pertumbuhan dan identifikasi bakteri. Peptones sebanyak 10.0g memberikan sumber nitrogen dan nutrisi penting bagi mikroorganisme. Di-potassium hydrogen phosphate sebanyak 2.0g bertindak sebagai buffer untuk menjaga pH medium agar tetap stabil. Lactose sebanyak 5.0g dan sucrose sebanyak 5.0g adalah sumber karbon yang digunakan oleh bakteri untuk metabolisme. Eosin Y, berwarna kuning, sebanyak 0.4g dan methylene blue sebanyak 0.07g adalah pewarna yang memberikan sifat kromogenik pada medium agar. Agar-agar sebanyak 13.5g digunakan sebagai pengental agar medium membeku (Merck 2010: 276).
Pepton berperan sebagai sumber karbon, nitrogen, dan nutrisi penting untuk pertumbuhan bakteri. Fosfat bertindak sebagai buffer pada medium, menjaga pH agar tetap stabil. Laktosa dan sukrosa berfungsi sebagai substrat fermentasi, di mana laktosa juga memiliki peran penting dalam membedakan bakteri gram negatif berdasarkan kemampuannya dalam menguraikan laktosa. Sukrosa digunakan sebagai sumber karbohidrat bagi bakteri gram negatif yang tidak mampu memfermentasi laktosa. Eosin dan methylene blue berfungsi untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif. Dalam membedakan bakteri koliform dengan E.
coli, laktosa, eosin, dan methylene blue digunakan. Bakteri koliform akan menghasilkan koloni ungu kehitaman karena kompleks yang terbentuk antara eosin dan methylene blue pada pH asam. Warna hijau metalik muncul karena fermentasi laktosa oleh E. coli, yang meningkatkan kadar asam di medium dan menyebabkan endapan methylene blue. Bakteri yang tidak mampu memfermentasi laktosa akan menghasilkan koloni yang tidak berwarna atau tidak mengalami perubahan warna (Merck 2010: 276; Harijani dkk. 2013: 41; Himedia 2022: 1).
III. REFERENSI
Cappuccino, J. G., N. Sherman. 2014. Microbiology: A Laboratory Manual. 10th edition. Pearson Education, Inc. U.S.A: xvi + 533 hlm.
Harijani, N., Rahadi, U.S.E. & Nazar, D.S. 2013. Isolasi Escherichia coli pada Daging yang Diperoleh dari beberapa Pasar Tradisional di Surabaya Selatan. Veterinaria Medika 6(1): 39—44.
Himedia. 2022. Technical Data-EMB Agar: 1—3.
ITW Reagents. 2013. CCA Coliforms, Chromogenic Agar Base (ISO 9308-1) (Dehydrated media) for microbiology. PanReac AppliChem: 1—2.
Jiwintarum, Y., Agrijanti & B.L. Septiana. 2017. Most Probably Number (MPN) coliform dengan variasi volume media Lactose Single Strength (LBSS) dan Lactose Broth Double Strength (LBDS). Jurnal Kesehatan Prima 11(1): 11–17.
Elmer Koneman, Washington Winn, Jr., Stephen Allen, William Janda, Gary Procop, Paul Schreckenberger, and Gail Woods. 2016. Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia: 1736 hlm.
Merck, Microbiology Manual Twelveth Edition. Merck KGaA, Germany, 2010: 237.
Merck, Readycult Coliforms 100 Presence/Absence Test for Detection and Identification of Coliform Bacteria and Escherichia coli in Finished Waters (Merck KgaA. Darmstadt, 2007), p. 2.
Merck. 2010. Microbiology Manual. 12th ed. Jerman: 682 hlm.
Naratama, M.R. & I. Santoso. 2020. Non-fecal and fecal coliform test of ready-to-eat food and drinks using fluorogenic and chromogenic media. Journal of Physics 1442: 1–7.
Santoso, I. 2023. Modul Praktikum Analisis Air-Uji Koliform dengan Medium Kromogenik. Praktikum Mikrobiologi: 1—7.
Willey, J., Sandman, K. & Wood, D. 2020. Prescott’s Microbiology. 11th ed. McGraw- Hill Education, New York: xxiii + 975 hlm.