Rancangan percobaan menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) faktorial dua faktor. Faktor pertama adalah aplikasi invigorasi, yaitu:
P0: kontrol (tanpa aplikasi perendaman air/isolat) P1: aplikasi perendaman benih dengan air steril
P2: aplikasi perendaman benih dengan Methylobacterium TD-TPB3 P3: aplikasi perendaman benih dengan Methylobacterium TD-J7
P4: aplikasi perendaman benih dengan Methylobacterium TD-TPB3 + TD- TM3
P5: aplikasi perendaman benih dengan Methylobacterium TD-TPB3 + TD- J7
Faktor kedua adalah tingkat viabilitas awal benih Argomulyo yang berbeda, yaitu: V1 (DB awal: 78 %, tanggal panen 18-10-2010); V2 (DB awal: 83 %, tanggal panen 8-4-2011); V3 (DB awal: 94 %, tanggal panen 25-8-2011). Sebanyak 18 kombinasi perlakuan diulang sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh 54 satuan percobaan.
Model linear dalam Rancangan Acak Kelompok Faktorial sebagai berikut: Yijk = µ + αi+ βj+ (αβ)ij+ ρk + εijk
Keterangan:
Yijk = nilai pengamatan pada faktor aplikasi invigorasi taraf ke-i, faktor tingkat viabilitas awal benih taraf ke-j, dan ulangan ke-k
µ = nilai tengah pengamatan karakter yang diamati
αi = pengaruh utama dari faktor perlakuan aplikasi invigorasi ke-i
βj = pengaruh utama dari faktor perlakuan tingkat viabilitas awal benih ke-j
(αβ)ij = komponen interaksi dari faktor aplikasi invigorasi dan faktor tingkat
viabilitas awal benih
ρk = pengaruh aditif dari kelompok dan disumsikan tidak berinteraksi dengan perlakuan
19 i = perlakuan aplikasi invigorasi
j = perlakuan lot benih k = ulangan 1, 2, 3
Apabila diperoleh hasil yang berbeda nyata pada analisis sidik ragam dengan taraf kepercayaan 95 %, maka analisis dilakukan dengan menggunakan Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).
Pemilihan isolat yang digunakan untuk aplikasi invigorasi didasarkan pada konsentrasi fitohormon tertinggi yang diproduksi Methylobacterium spp. menurut hasil penelitian Widajati et al. (2008) (Tabel 1). Selain itu, kemudahan isolat tersebut diperbanyak pada media cair juga menjadi pertimbangan karena dibutuhkan suspensi bakteri dalam jumlah yang cukup besar (+ 2 l per satu kombinasi perlakuan invigorasi). Berdasarkan penelitian sebelumnya
Methylobacterium spp tidak memiliki kekhususan inang sehingga koleksi isolat
Methylobacterium spp yang tercantum pada Tabel 1 dapat diaplikasikan pada berbagai jenis tanaman, yaitu diantaranya pada padi (Fitriani 2008), kakao (Sadikin 2009), cabai rawit (Afifah 2009), cabai besar (Goni 2010), dan kedelai (Danial 2011). Hal ini diperkuat oleh pernyataan Riupassa (2003), bahwa
Methylobacterium spp. memiliki pola adaptasi untuk mampu hidup pada lingkungan dengan daya dukung yang beragam.
Prosedur Penelitian
Persiapan Bakteri pada Media Cair
Peremajaan isolat dilakukan terlebih dahulu dengan cara mengambil 1 ose biakan murni dari koleksi agar miring kemudian digoreskan pada media padat AMS. Media padat AMS adalah media yang berisi larutan AMS (Lampiran 2) dan
trace elemen (Lampiran 3) sebanyak 25 μl l-1. Sebelum disterilisasi, terlebih dahulu diukur keasaman larutan dengan pH meter (pH=7) kemudian diberi penambahan bacto agar (20 g l-1). Media yang telah larut kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121 0C.
Penambahan metanol sebanyak 10 ml l-1 ke dalam media cair AMS dilakukan ketika suhu media (+ 30 0C) secara aseptik. Metanol yang diberikan terlebih dahulu disterilkan dengan cara menyaring larutan tersebut dengan
20
membran filter berpori (millipore) 0.22 μm merek Millex®GP. Media tersebut kemudian dituang secara aseptik dalam cawan petri yang telah di sterilisasi. Media padat digunakan untuk menumbuhkan dan memperbanyak isolat bakteri sebanyak yang dibutuhkan sebelum dikulturkan kembali pada media cair. Media padat yang telah digoreskan isolat Methylobacterium spp. kemudian diinkubasi selama 7 hari pada inkubator.
Perbanyakan isolat pada media cair dilakukan dengan cara menyiapkan media cair AMS dengan penambahan trace elemen pada erlemeyer, kemudian disterilisasi. Penambahan metanol (10 ml l-1) dan triptofan (Lampiran 4) sebanyak 1 ml l-1 secara aseptik juga dilakukan setelah suhu media (+ 30 0C). Triptofan
yang diberikan terlebih dahulu disterilkan dengan cara menyaring larutan tersebut dengan membran filter berpori (millipore) 0.22 μm merek Millex®GP. Sebanyak 1 ose biakan murni dari media padat dimasukkan ke dalam erlemeyer yang berisi media cair AMS secara aseptik. Erlemeyer kemudian diinkubasi dalam orbital shaker selama 7 hari dengan kecepatan 100 rpm pada suhu kamar.
Sebelum digunakan untuk aplikasi, kerapatan bakteri dihitung dengan metode TPC (Total Plate Count). TPC dilakukan dengan melakukan serial pengenceran (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5). Serial pengenceran dilakukan menggunakan garam fisiologis (NaCl 0.85 % ). Kemudian sebanyak 50 μl suspensi isolat pada pengenceran tersebut disebar menggunakan segitiga batang penyebar pada media padat AMS secara aseptik. Inkubasi dilakukan selama 7 hari pada suhu kamar untuk menumbuhkan bakteri yang telah disebar. Konsentrasi
Methylobacterium spp. yang digunakan untuk invigorasi benih ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3 Konsentrasi Methylobacterium spp. yang digunakan untuk invigorasi benih
Nama isolat Asal tanaman Konsentrasi
TD-TM3 Tomat 3.00 x 106 cfu ml-1
TD-TPB3 Terong Putih Bulat 4.82 x 107 cfu ml-1
21
Perendaman Benih
Aplikasi invigorasi dengan priming dilakukan dengan cara merendam benih dalam wadah gelas plastik berukuran 420 ml yang berisi kultur
Methylobacterium spp.
Perendaman benih dalam media air/isolat dilakukan selama 2 jam pada suhu kamar (29 0C) dan diberi suplai oksigen menggunakan aerator (Gambar 2). Pengunaan aerator bertujuan untuk memberikan suplai oksigen kepada benih sehingga meminimalisasi terjadinya kondisi anaerob. Perbandingan benih dengan air/isolat 3:10 (w/v).
Gambar 2 Proses perendaman benih dengan isolat Methylobacterium spp menggunakan aerator
Penanaman di laboratorium
Penanaman di laboratorium dilakukan menggunakan teknik Uji Kertas Digulung didirikan dalam plastik (UKDdp). Setiap perlakuan diulang sebanyak tiga kali dan setiap ulangan menggunakan sample sebanyak 100 benih. Benih dikecambahkan pada ekogerminator tipe IPB-72-1. Pengamatan dilakukan setiap hari hingga hitungan terakhir (hari ke-5).
Penanaman di rumah kaca
Pengujian juga dilakukan di rumah kaca. Media tanah sebanyak 3 kg dimasukkan ke dalam polibag ukuran 25 cm x 25 cm. Pemberian pupuk urea 25
22
kg ha-1, SP-36 50 kg ha-1, KCl 75 kg ha-1 dan kompos 2 ton ha-1 dilakukan sesuai dengan dosis rekomendasi (BALITKABI 2012). Jika jarak tanam yang digunakan 40 cm x 10 cm, maka diasumsikan 1 ha lahan memiliki populasi tanaman kedelai sebanyak 250,000 sehingga setiap polibag diberikan pupuk urea 0.045 g, SP-36 0.072 g, KCl 0.18 g, dan kompos 8 g. Pupuk diberikan seluruhnya pada saat tanam, kecuali kompos yang telah diberikan 1 minggu sebelum tanam.
Setiap perlakuan terdiri dari 3 ulangan dimana setiap ulangan terdiri dari 3 polibag yang ditanam 4 benih per polibag dan disisakan 1 tanaman sehat saat berumur 14 hari setelah tanam (hst). Penanaman dilakukan sore hari sehingga diharapkan benih yang telah direndam isolat tidak mengalami perubahan suhu yang ekstrim.
Pemeliharaan
Pemeliharaan yang dilakukan meliputi penyiraman yang dilakukan setiap hari. Penyemprotan pestisida Decis (bahan aktif deltametrin 25 g l-1) dengan konsentrasi 0.5 ml l-1 dilakukan setiap minggu untuk mencegah serangan hama.
Pemanenan
Panen dilakukan pada umur 35 hst ketika tanaman kedelai telah mencapai masa vegetatif akhir. Panen dilakukan dengan cara mencabut tanaman dengan hati-hati kemudian akarnya dibersihkan dengan air mengalir. Akar yang telah bersih kemudian dibungkus dengan kertas koran.
a. Peubah yang diamati di Laboratorium
1. Kecepatan Tumbuh (% etmal-1)
Kecambah tumbuh (KCT) dihitung berdasarkan nilai pertambahan
perkecambahan (persentase kecambah normal) setiap hari pada kurun waktu perkecambahan dalam kondisi optimum.
5 1 t i CT di KDimana: i = kurun waktu perkecambahan (selama 5 hari)
23 2. Daya Berkecambah (%)
Penghitungan daya berkecambah (DB) dilakukan berdasarkan persentase kecambah normal (KN) pada pengamatan pertama dan kedua. Pengamatan pertama pada hari ke-3 setelah tanam (KN hitungan I) dan pengamatan kedua pada hari ke-5 setelah tanam (KN hitungan II). Nilai Daya Berkecambah (DB) didapat dengan rumus:
100%
kan dikecambah yang benih II hitungan KN I hitungan KN DB 3. Indeks Vigor (%)Penghitungan indeks vigor (IV) dilakukan berdasarkan persentase kecambah normal pada pengamatan pertama (KN hitungan I), yaitu hari ke-3
% 100 x kan dikecambah yang benih I hitungan KN IV
4. Panjang hipokotil (cm)Panjang hipokotil diukur pada saat pengamatan hari ke-5 dengan cara mengukur panjang hipokotil kecambah
5. Panjang akar (cm)
Panjang akar diukur pada saat pengamatan hari ke-5 dengan cara mengukur panjang akar kecambah.
6. Bobot Kering Kecambah Normal (g)
Bobot Kering Kecambah Normal (BKKN) merupakan bobot dari semua kecambah normal yang telah dibuang kotiledonnya pada hari ke-5. Kecambah dikeringkan pada oven dengan suhu 60 0C selama 3x24 jam.
b. Peubah yang diamati di Rumah Kaca:
1. Daya Tumbuh (%)
Pengamatan terhadap daya tumbuh (DT) benih dilakukan pada saat bibit berumur 1 MST. Penghitungan dilakukan terhadap bibit yang telah tumbuh normal (KN). % 100 x disebar yang benih KN DT
24
2. Tinggi Tanaman (cm)
Tinggi tanaman diukur mulai dari pangkal batang sampai titik tumbuh. Pengukuran tinggi tanaman dilakukan setiap minggu selama fase vegetatif. 3. Jumlah Daun
Tanaman kedelai dihitung jumlah daunnya ketika sudah ada daun trifoliat. Pengukuran jumlah daun dilakukan setiap minggu selama fase vegetatif.
4. Bobot Kering Tajuk (g)
Bobot kering tajuk ditetapkan dengan memisahkan bagian tajuk dan akar, kemudian tajuk dioven. Setelah dioven tajuk ditimbang bobot keringnya. Bobot kering tajuk dihitung setelah tanaman berumur 35 hst.
5. Bobot Kering Akar (g)
Bobot kering akar dilakukan dengan cara mengoven akar yang dipanen pada 35 hst. Akar dikeringkan pada oven dengan suhu 60 0C selama 3 x 24 jam. Setelah mencapai bobot yang konstan, akar kemudian ditimbang.
Percobaan II: Aplikasi Methylobacterium spp untuk mempertahankan daya
