BAHAN DAN METODE PENELITIAN

Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Estuari Muara Angke-Teluk Jakarta yang berada pada 06005’47.6” LS dan 106045’58.9”BT, Cimandiri-Teluk Pelabuhan Ratu yang berada pada 07000’32.5” LS dan 106032’11.5”BT dan Cilintang-Ujung Kulon yang berada pada 06048’49.2” LS dan 105028’22.2”BT (Gambar 21). Estuari Muara Angke yang merupakan bagian dari Teluk Jakarta dimana wilayahnya relatif tercemar, mendapat masukan limbah karena tingginya aktivitas didarat. Estuari Cimandiri dan Cilintang yang masuk dalam wilayah Teluk Pelabuhan Ratu dan Ujung Kulon merupakan wilayah yang relatif tidak tercemar karena rendahnya masukan limbah yang berasal dari aktivitas di darat.

Contoh sedimen yang diperoleh dari masing – masing lokasi dikeringkan dengan alat freeze-dryer di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan II (Departemen Teknologi Hasil Perairan), Fakultas Perikanan dan Ilmu kelautan (FPIK), Institut Pertanian Bogor (IPB). Analisis Lipid dilaksanakan di Pusat Laboratorium Terpadu, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah,Tangerang. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2010-Januari 2011.

Gambar 21 Lokasi pengambilan contoh sedimen di Estuari Muara Angke (A), Cimandiri (B) dan Cilintang (C).

BT PETA LOKASI PENELITIAN Keterangan : A. Muara Angke, T.JKT B. Cimandiri, T.P.Ratu C. Cilintang, Ujung Kulon A B C Selat sunda Samudera Hindia Laut Jawa 105.2 105.4 105.6 105.8 106 106.2 106.4 106.6 106.8 107 -7.2 -7 -6.8 -6.6 -6.4 -6.2 -6 1050₁₂’ 1050₂₄’ ₁₀₅0₃₆’ ₁₀₅0₄₈’ ₁₀₆0₀’ ₁₀₆0₁₂’ ₁₀₆0₂₄’ ₁₀₆0₃₆’ ₁₀₆0₄₈’ ₁₀₇0₀’ 60₀’ 60₁₂’ 60₂₄’ 60₃₆’ 60₄₈’ 70₀’ 70₁₂’ LS

Bahan dan Peralatan Penelitian Perlakuan peralatan laboratorium

Peralatan penelitian berupa gelas (soxhlet, round bottle glass, gelas beaker, funnel separating (kolom pemisah), kolom kromatografi, erlenmeyer), penjepit stainless steel dan spatula dicuci dengan sabun teepol dan dibilas dengan air. Selanjutnya, peralatan dibungkus dengan aluminium foil dan dikeringkan dengan oven (800C) selama 24 jam. Ketika akan digunakan alat yang telah dikeringkan dengan oven serta aluminium foil, glass wool, gelas vial, gelas pasteur pipet dibilas dengan methanol (MeOH), diklorometana (DCM) dan n-heksana secara berurutan (Prartono 1995).

Pelarut organik

Pelarut organik yang digunakan seperti etil asetat (Merck; Pro Analysis), methanol/ MeOH (Merck; LiChrosolv), diklorometana/ DCM (Merck; Pro Analysis) dan n-heksana (Merck; Pro Analysis) dilakukan destilasi untuk mengurangi kontaminan yang terkandung dalam pelarut tersebut (Prartono 1995).

Reagen

(1) Anhydrous Sodium Sulfat

Anhydrous sodium sulfat dibilas dengan diklorometana (DCM), kemudian diaktivasi (5000C; 4 jam) menggunakan oven. Selanjutnya, didinginkan pada desikator dan disimpan hingga akan digunakan (Prartono 1995).

(2) Bubuk Tembaga Aktif (Activated Copper)

Copper aktif disiapkan menurut prosedur dari Blumer (1957) dalam Prartono (1995). Cupric sulfat atau copper (II) sulfat ditimbang 45 g (Merck) kemudian dilarutkan dalam 500 mL akuades dan ditambahkan hydrochloric acid (2 M; 20 mL). Bubuk seng ditimbang 15 g selanjutnya dilarutkan dalam 25 mL akuades. Larutan seng dimasukkan dalam larutan copper (II) sulfat secara perlahan kemudian diaduk. Pengadukan terus dilakukan hingga terbentuk endapan copper dari warna merah hingga

merah kecokelatan. Cairan dipermukaan kemudian dibuang. Endapan copper dibilas dengan DCM dan n-heksana.

Silika gel 60 (ukuran partikel 0.040 – 0.063 mm)

Silika gel yang digunakan pada kolom kromatografi (0.040–0.063 mm; Merck, Jerman) dideaktivasi dengan 5% air (akuades). Tahap awal deaktivasi, silika gel (10 g) dimurnikan melalui ekstraksi menggunakan alat soxhlet (6 jam) dengan campuran n-heksana-methanol (1:1) sebanyak 100 mL, selanjutnya dikeringkan dan dibungkus dengan aluminium foil. Selanjutnya, aluminium foil yang telah terisi silika dipanaskan dalam oven (5000C; 1 jam). Setelah itu, suhu diturunkan secara bertahap menjadi 1500C hingga 1200C, kemudian dipindah kedalam desikator (30 menit). Deaktivasi silika gel dilakukan dengan menambah air akuades 5% (0.5 g) pada gelas beker yang sebelumnya telah diisi silika 95% (9.5 g) dan diaduk hingga gumpalan menghilang. Jumlah air (5%) yang ditambahkan berdasarkan persamaan (1) dan (2) berikut :

Wt = Ws 0.95 Wh = Wt - Ws keterangan :

Wt = total (berat SiO2 + H2O) Ws = berat SiO2

Wh = berat H2O yang ditambahkan

Metode Penelitian

Pengambilan dan perlakuan contoh sedimen

Pengumpulan contoh sedimen dilakukan pada 1 titik untuk masing-masing Estuari Muara Angke-Teluk Jakarta, Cimandiri-Teluk Pelabuhan Ratu dan Cilintang-Ujung Kulon. Titik pengambilan contoh sedimen dilihat posisinya (lintang dan bujur) dengan menggunakan alat Global Positioning System (GPS). Contoh sedimen permukaan (± 10 cm) dikoleksi dengan menggunakan alat Van Veen grab (Mater et al. 2004; Zhang et al. 2004). Contoh sedimen yang telah terkumpul pada grab dilakukan subcore, kemudian contoh sedimen dibungkus aluminium foil. Selanjutnya, disimpan dalam cold box yang telah diberi es batu.

... (1)

Di laboratorium contoh sedimen dibekukan dengan Freezer (-200C) untuk analisis lebih lanjut.

Prosedur analisis lipid (1) Ekstraksi

Contoh sedimen dikeringkan dengan alat freeze-dryer (24 jam), kemudian dihomogenkan. Contoh sedimen yang telah dikeringkan kemudian ditimbang sebanyak 40 g. Contoh diekstraksi dengan 120 mL pelarut campuran (1:1) diklorometana (DCM) dan methanol (MeOH) dalam alat soxhlet (24 jam). Hasil dari ekstraksi diuapkan dengan rotary evaporator hingga tersisa ekstrak kurang lebih 2 mL. Ekstrak dihidrolisis dengan 6% KOH dalam MeOH (30 mL; 12 jam) (Prartono 1995).

Fraksi netral didapat melalui ekstraksi dengan n-heksana (3x30 mL). Fraksi cair diuapkan (~0.5 mL) dan dicampur dengan akuades yang sebelumnya telah diekstraksi dengan DCM (25 mL). Campuran diasamkan hingga pH menjadi 2 (pH~2) dengan 6 N HCl dan fraksi asam didapat melalui ekstraksi dengan DCM (3x30 mL). Selanjutnya, diuapkan (tanpa nitrogen) hingga diperoleh ± 2 mL dan dimasukkan dalam gelas vial, kemudian diuapkan dengan nitrogen hingga kering. Pelarut n-heksana ditambahkan 0.5 mL kedalam gelas vial bila akan dianalisis dengan GC-MS. Sampel diderivatisasi melalui sililasi dengan bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (BSTFA (Sigma-Aldrich); 50 µL; 800 C; 10 menit) sebelum dianalisis dengan kromatografi gas (Gas Chromatography/ GC) (Prartono 1995).

(2) Fraksinasi

Fraksinasi dimulai dengan memasukkan fraksi netral ke kolom kromatografi yang telah terisi silika gel (5% dideaktivasi silika; 10 g). Berikut fraksi yang diperoleh : (I) fraksi alifatik diperoleh dengan mengelut kolom dengan 30 mL n- heksana, (II) fraksi aromatik diperoleh dengan mengelut campuran 30 mL dari n- heksana : diklorometana (90:10) diikuti oleh 20 mL campuran 50% diklorometana dalam n-heksana (50:50) dan (III) fraksi polar diperoleh dengan mengelut campuran 25 mL dari 25% etil asetat dalam n-heksana. Selanjutnya, hasil tiap fraksi diuapkan (tanpa nitrogen) hingga diperoleh ± 2 mL dan dimasukkan dalam gelas vial. Sampel yang telah dimasukkan dalam gelas vial kemudian diuapkan

dengan nitrogen hingga kering. Pelarut n-heksana ditambahkan 0.5 mL kedalam gelas vial bila akan dianalisis dengan GC-MS. Fraksi III diderivatisasi melalui sililasi (BSTFA; 50 µL; 800 C; 10 menit) sebelum dianalisis dengan kromatografi gas (Prartono 1995; Martins et al. 2007).

Analisis kromatografi gas – spektrometri massa

Analisis kromatografi gas–spektrometri massa (gas chromatography–mass spectrometry/ GC-MS) menggunakan kromatografi gas Shimadzu QP2010 yang dilengkapi dengan kolom silika DB-5 ms (panjang 30 m; 0.32 mm i.d./ inner diameter/ diameter dalam; dan 0.25 µm film thickness/ ketebalan lapis film) serta helium sebagai gas pendorong. Kromatografi gas memiliki batas deteksi 0.001 ppb. Kromatografi gas menggunakan mode injeksi split dengan rasio 10:1. Suhu oven kromatografi gas diprogram dari 40 sampai 3000C pada laju 60C/ menit setelah satu menit dan dibiarkan konstan pada 3000C selama 20 menit. Kondisi GC-MS adalah ionisasi potensial/ electron energy 70eV, ion source temperature 2300C dan interface temperature 2500C. Full mass data dicatat antara 45–600 Dalton setiap detik. Data dicatat dan diproses/ analisis dengan perangkat lunak GCMS Real Time Analysis dan GCMS Postrun Analysis.

Identifikasi dan kuantifikasi lipid

Lipid diidentifikasi dan kuantifikasi (dihitung) menggunakan kromatografi gas dan kromatografi gas–spektrometri massa. Identifikasi lipid dilakukan dengan membandingkan indeks relative retention dan mass spectra dengan data literatur. Data kuantitatif ditentukan dengan membandingkan luas puncak standar eksternal dengan senyawa yang dimaksud dalam total ionic current (TIC) chromatograms. Standar eksternal yang digunakan adalah phenanthrene (PAH) dan n-asam heptadekanoat (asam lemak). Konsentrasi senyawa dihitung dengan menggunakan persamaan (3) berikut (Prartono 1995):

Cc = Ac . Ce Ae keterangan :

Cc dan Ac = konsentrasi (µg/g berat kering) dan luas area senyawa yang dimaksud.

Ce dan Ae = konsentrasi (µg/g berat kering) dan luas area standar eksternal. ... (3)

Perhitungan parameter molekuler

Nilai Carbon Preference Index (CPI) untuk n-alkana/ HC, n-asam alkanoat/ FA dan n-alkanol/ OH dihitung dengan persamaan (4), (5), (6) dan (7) berikut (Prartono 1995; Silva et al. 2008) :

n-alkana = CPI 21−31 = 1 2 x (� − � ��� ��� �₂₁₋�₂₉) (� − � ��� ������₂₂₋�₃₀)+ (� − � ��� ��� �₂₃₋�₃₁) (� − � ��� ������₂₂₋�₃₀) ���15−21 = 1 2 x (� − � ��� ��� �₁₅₋�₁₉) (� − � ��� ������16−�20) + (� − � ��� ��� �17−�21) (� − � ��� ������16−�20)

n-asam alkanoat dan n-alkanol =

���

20−30

=

1

2 x

(� − �

. ������

20−

�

28

)

(� − �

. ���

�

21−

�

29

)

+

(� − �

. ������

22−

�

30

)

(� − �

. ���

�

21−

�

29

)

���

10−20

=

1

2 x

(� − �

. ������

10−

�

18

)

(� − �

. ���

�

₁₁₋

�

₁₉

)+

(� − �

. ������

12−

�

20

)

(� − �

. ���

�

₁₁₋

�

₁₉

)

Untuk menginterpretasikan dominasi terestrial versus akuatik digunakan terestrial to aquatic ratio (TAR) (Meyers 1997; Lu & Meyers 2009) dengan formula (8) dan (9) sebagai berikut : TAR HC = C27 + C29 + C31 C15 + C17 + C19 TAR FA / OH = C24 + C26 + C28 C12 + C14 + C16

Untuk melihat adanya dominasi masukan dari autotonus/ akuatik atau alotonus/ terestrial secara relatif pada sterol digunakan rasio cholesterol (C27Δ5)/ sitosterol (C29Δ5) (Mater et al. 2004).

Analisis statistik

Analisis perbedaan karakteristik lipid biomarker antar lokasi pengamatan digunakan analisis komponen utama (Principal Component Analysis) dengan bantuan perangkat lunak Statistica 6.

... (4) ... (5) ... (6) ... (7) ... (8) ... (9)

HASIL DAN PEMBAHASAN