POLIMORFISME GEN BMP15 PADA KAMBING KACANG, SAMOSIR DAN MUARA
BAHAN DAN METODE
BAHAN DAN METODE
Sampel DNA dan Amplifikasi Gen BMP15
Jumlah dan jenis sampel DNA kambing yang dipergunakan sama dengan sampel DNA pada bab sebelumnya. Amplifikasi gen BMP15 dilakukan dengan mesin TaKaRa Thermal Cycler. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen BMP15 ekson 1 dan ekson 2 didesain dengan mengacu pada Capra hircus breed Guizhou White berdasarkan data GenBank dengan No. Akses FJ429281 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran1). Pasangan primer forward AF218 GATGCAAAGAGGACAATTTAGAAGACC dan primer reverse AF219 5’-CCCACCAGAACAATATAGTATGATAACTC digunakan untuk amplifikasi ekson 1. Amplifikasi ekson 2 dilakukan dengan menggunakan pasangan primer forward AF222 TGCAGGCTCCTGGCACATACAGAC dan primer reverse AF223 5’-TCACCTGCATGTGCAGGACTGGG. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 12 µL, yang terdiri atas sampel DNA sekitar 10 ng, primer forward dan reverse masing-masing 0.5 µL 25 mM, dan KAPA Taq Ready Mix DNA polymerase 6 µL
(KAPATaq DNA polymerase 0.05 U/µL, bufer polimerase dengan Mg2+.25 mM
dan setiap dNTP masing-masing 0.4 mM). Kondisi PCR, yaitu predenaturasi 94
0C, selama 5 menit, (denaturasi 94 0C, 60’, penempelan primer ekson 1 60 0C,
90’, pemanjangan 72 0C, 90’) sebanyak 30 siklus, pemanjangan akhir pada suhu
72 0C selama 10 menit, dan penyimpanan dilakukan pada suhu 4 0C. Kondisi PCR
untuk ekson 2 sama kecuali penempelan primer yaitu 64 0C. Amplikon
dimigrasikan pada gel poliakrilamida 6% dengan penanda DNA Ladder 100 pb (Generay Biotech) yang dilanjutkan dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009).
Penentuan Genotip dengan Metode Sekuensing
Amplikon dari jenis kambing yang sama dicampur, sehingga ada tiga kelompok besar yaitu sampel kambing Kacang (K), kambing Samosir (S), dan kambing Muara (M). Proses sekuensing dilakukan pada hasil pencampuran amplikon dengan menggunakan primer yang sama seperti proses amplifikasi awal. Hasil sekuensing berupa grafik elektroforegram diedit secara manual dengan software Bioedit versi 7.0.9.0 (Hall 1999). Urutan nukleotida yang sudah benar
15
kemudian disejajarkan dan dianalisis lebih lanjut dengan program MEGA4.0 (Tamura et al. 2007) dan Genetyx-win 4.1.
Analisis filogeni kambing lokal Indonesia dilakukan berdasarkan daerah
coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan metode Neighbour-joining
(NJ) dengan bootstrap 1000x. Data sekuen pembanding yang digunakan diperoleh dari data GenBank yaitu Pongo abelii : XM_002831651, Pan troglodytes : XM_529247, Macaca mulatta : XM_001083980, Equus caballus : XM_001496223, Jining Grey : EU743938, Homo sapiens : AF082350, Gallus
gallus : AY729025, Bos Taurus : DQ463368, Yunling Black : EU847284, Boer :
EU847289, Black Bengal : EU888137, Guizhou White : FJ429281, Markhoz : GU732196, Ovis aries : AF236079, Mus musculus : NM_009757, Rattus
norvegicus : NM_021670, Bubalus bubalis : EF375880 dan Carassius gibelio :
HQ179985. (Lampiran 2 dan 3).
HASIL
Amplifikasi gen BMP15 ekson 1 yang diapit oleh primer forward AF218 dan primer reverse AF219 menghasilkan fragmen DNA sepanjang 574 pb (Gambar 6A). Amplifikasi gen BMP15 ekson 2 yang diapit oleh primer forward AF222 dan primer reverse AF223 menghasilkan fragmen DNA sepanjang 861 pb (Gambar 6B).
A B
Gambar 6 Amplikon gen BMP15 ekson 1 dan 2 pada kambing Kacang (A) ekson 1 = 574 pb (B) ekson 2 = 861 pb (M) Marker 100 pb (1-6) Kambing Kacang.
Hasil sekuensing menunjukkan bahwa gen BMP15 pada daerah ekson1 memiliki urutan nukleotida yang identik pada ketiga populasi kambing lokal Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara). Pada daerah ekson 2
100 pb 574 pb
1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 M
100 pb 861 pb
16
ditemukan 3 varian nukleotida yang berbeda antar populasi kambing lokal Indonesia. Pada populasi kambing Kacang ditemukan dua macam mutasi substitusi (Gambar 7). Pertama, transisi A→G pada posisi nukleotida ke-325 yang bersifat mutasi bisu karena tidak menyebabkan perubahan asam amino ke-108 yaitu tetap sebagai lisin. Kedua, transversi C→G pada posisi nukleotida ke-398. Mutasi ini bersifat mutasi netral karena menyebabkan perubahan asam glutamat menjadi glutamin pada posisi asam amino ke-133 namun tidak merubah fungsi protein.
A B
Gambar 7 Mutasi substitusi gen BMP15 pada kambing Kacang (A) Mutasi substitusi A325G (B) Mutasi substitusi C398G.
Gambar 8 Mutasi substitusi C34T pada kambing Muara.
Populasi kambing Muara menunjukkan satu mutasi substitusi C34T (Gambar 8). Mutasi ini tidak menyebabkan adanya perubahan asam amino pada posisi ke-11 yaitu tetap sebagai leusin. Pada populasi kambing Samosir tidak ditemukan adanya variasi nukleotida.
Hasil analisis pohon filogeni berdasarkan daerah coding sequence ekson 2 menunjukkan bahwa ketiga kambing lokal Indonesia berada dalam satu kelompok
17
dengan berbagai jenis kambing di dunia, seperti Boer, Ghuizou White, Black Bengal, Markhoz, ataupun Yunling Black (Gambar 9).
Gambar 7 Pohon filogeni kambing lokal Indonesia berdasarkan daerah coding sequence gen BMP15 ekson 2 menggunakan program MEGA 4 dengan metode Neighbour-joining dengan bootstrap 1000x. Angka di percabangan menunjukkan nilai bootstrap.
Pada pohon filogeni tampak percabangan yang memisahkan kelompok hewan yang bersifat monoovulasi dengan kelompok hewan yang bersifat poliovulasi dengan nilai bootstrap 100. Kelompok hewan yang bersifat monoovulasi meliputi beberapa hewan ruminansia dan primata. Kelompok hewan yang bersifat poliovulasi terdiri atas Mus musculus dan Rattus norvegicus yang merupakan hewan rodensia. Adapun Gallus gallus dan Carassius gibelio terlihat berada pada kelompok terluar dalam pohon filogeni.
PEMBAHASAN
Gen BMP15 pada kambing terdiri dari dua ekson dan satu intron yang menyandikan sebanyak 394 asam amino berdasarkan Capra hircus breed Guizhou White pada basis data GenBank dengan No. Akses FJ429281 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Lampiran 1). Analisis sekuen gen BMP 15
18
menunjukkan bahwa ketiga populasi kambing lokal Indonesia (kambing Kacang, Samosir dan Muara) memiliki urutan nukleotida yang identik pada ekson 1. Hal ini kemungkinan karena pada daerah ekson 1 terdapat daerah yang menyandikan bagian sinyal peptida dalam pembentukan protein BMP15 sehingga bersifat sangat stabil. Ada enam alel mutan pada gen BMP15 yang telah diketahui berkorelasi dengan sifat prolifik pada mutan heterozigot carrier dan menyebabkan sifat steril pada mutan homozigot carrier. Mutasi pada keenam alel ini semuanya terjadi pada bagian ekson 2 (Tabel 2).
Tabel 2. Alel mutan pada gen BMP15
Nama Alel Mutasi DNA Mutasi Protein Ekson Domba Referensi FecXI (Inverdal) T579A V31D 2 Romney Galloway et al. (2000) FecXH (Hanna) C544T Q23stop 2 Romney Galloway et al. (2000) FecXG (Galway) C718T Q239Ter 2 Belcrare,Cambridge Hanrahan et al. (2004) FecXB (Belclare) G1100T S99I 2 Belcrare Hanrahan et al. (2004) FecXL (Lacaune) G635A C53Y 2 Lacaune Bodin et al. (2007) FecXR (R.Aragonesa) del c.525_541 W154NfsX55 2 Rasa Aragonesa Royo,A.M. et al (2008)
Polimorfisme ditemukan pada gen BMP15 ekson 2 tiga kambing lokal Indonesia. Pada populasi kambing Kacang ditemukan ada dua jenis mutasi. Pertama, mutasi bisu yaitu transisi A325G . Kedua, mutasi netral yaitu transversi C398G yang menyebabkan perubahan asam glutamat menjadi glutamin namun tidak merubah fungsi BMP15. Asam glutamat adalah asam amino yang bermuatan negatif sedangkan glutamin adalah asam amino dengan rantai samping yang tidak bermuatan. Populasi kambing Muara hanya mempunyai satu mutasi bisu yaitu C34T, sedangkan populasi kambing Samosir tidak mengalami mutasi.
Fungsi BMP15 pada setiap spesies bersifat khas (specific species) terkait dengan perbedaan laju ovulasi antar species (Hashimoto et al. 2005). BMP15 pada mamalia berfungsi sebagai faktor pertumbuhan dan proliferasi sel granulosa.
BMP15 juga berperan dalam menghambat sensitivitas folikel terhadap Follicle Stimulating Hormone (FSH) dengan menekan ekspresi dari reseptor FSH (Otsuka et al. 2000). Penelitian yang dilakukan oleh Yan et al. (2001) menunjukkan bahwa
tikus yang sudah diinaktivasi (knock out) gen BMP15 nya tidak menunjukkan sifat steril tetapi hanya mengalami penurunan laju ovulasi (sub fertil). Mc Mahon et al.
19
(2008) menyimpulkan bahwa sifat poliovulasi ini ternyata dipengaruhi oleh jumlah ekspresi gen BMP15 yang lebih sedikit. Hal ini berdasarkan penelitiannya dengan menggunakan tikus transgenik oocyt specific overexpression BMP15. Mutasi gen BMP15 pada ruminansia kecil menyebabkan sifat prolifik pada genotip heterozigot dan sifat steril pada genotip homozigot (Galloway et al. 2000; Hanrahan et al. 2004; Bodin et al. 2007; Martinez-Royo et al. 2008). Zhang et al. (2009) mengungkapkan bahwa pada beberapa jenis sapi ditemukan adanya mutasi delesi 4 pb yang menyebabkan perubahan reading frame dan menghasilkan stop kodon prematur, namun mutasi ini tidak berkorelasi dengan sifat prolifik pada genotip heterozigot. Polimorfisme gen BMP15 pada manusia diketahui berhubungan dengan human dizygotic (DZ) namun tidak signifikan (Zhao et al. 2008). Pada ikan zebra, BMP15 berfungsi untuk mencegah terjadinya perkembangan dan pematangan prematur oosit dengan menekan sensitivitas folikel terhadap maturation inducing hormone (MIH) pada pertumbuhan awal dari folikel (Clelland et al. 2007).
SIMPULAN
Hasil sekuensing daerah ekson 1 menunjukkan bahwa kambing Kacang, Samosir dan Muara memiliki urutan basa nukleotida yang identik. Polimorfisme ditemukan pada daerah ekson 2 karena ada tiga varian mutan. Populasi kambing Kacang memiliki dua jenis alel mutan yaitu A325G dan C398G. Pada Populasi kambing Muara ada satu alel mutan yaitu C34T, sedangkan populasi kambing Samosir tidak memiliki varian mutan. Analisis pohon filogeni memperlihatkan bahwa kambing Kacang, Samosir dan Muara terletak dalam satu kelompok dengan beberapa kambing lokal di dunia. Pada pohon filogeni tampak percabangan yang memperlihatkan hubungan genetik antara kelompok hewan monoovulasi dan poliovulasi.
20
21