BAB VII. ANALISIS KERAGAMAN GENETIK ANGGREK Spathoglottis plicata Blume AKSESI BENGKULU DAN
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Nilai koefisien keragaman genetik mutan anggrek S. plicata
dan pembandingnya berdasarkan analisis klustering UPGMA
marka morfologi... 149 2. Nilai koefisien keragaman genetik mutan anggrek S. plicata
dan pembandingnya berdasarkan analisis klustering UPGMA
marka ISSR... 150 3. Deskripsi anggrek Spathoglottis plicata Blume. aksesi
Bengkulu setelah didomestikasi... 151 4. Deskripsi mutan 1 (1SpBa50) anggrek Spathoglottis plicata
Blume. aksesi Bengkulu setelah diiradiasi sinar gamma 50 Gy... 154 5. Deskripsi mutan 2 (2SpBa70) anggrek Spathoglottis plicata
Blume. aksesi Bengkulu setelah diiradiasi sinar gamma 70 Gy... 157 6. Deskripsi mutan 3 (3SpBa50) anggrek Spathoglottis plicata
Blume. aksesi Bengkulu setelah diiradiasi sinar gamma 50 Gy... 160 7. Deskripsi mutan 4 (4SpBa60) anggrek Spathoglottis plicata
Blume. aksesi Bengkulu setelah diiradiasi sinar gamma 60 Gy... 163 8. Deskripsi mutan 5 (5SpBa100) anggrek Spathoglottis plicata
Blume. aksesi Bengkulu setelah diiradiasi sinar gamma 100Gy.. 166 9. Deskripsi mutan 6 (6SpBa50) anggrek Spathoglottis plicata
Blume. aksesi Bengkulu setelah diiradiasi sinar gamma 50 Gy... 167 10. Deskripsi mutan 7 (7SpBa40) anggrek Spathoglottis plicata
Blume. aksesi Bengkulu setelah diiradiasi sinar gamma 40 Gy... 168 11. Deskripsi mutan 8 (8SpBa30) anggrek Spathoglottis plicata
Blume. aksesi Bengkulu setelah diiradiasi sinar gamma 30 Gy... 171 12. Deskripsi mutan 9 (9SpBa60) anggrek Spathoglottis plicata
GLOSSARY
Annealing : Penempelan primer pada DNA templat.
BA : Benzyl Adenin, termasuk golongan sitokinin yang berfungsi dalam pembelahan sel, induksi dan multiplikasi tunas.
Denaturasi : Tahapan reaksi dalam PCR, yaitu proses pemanasan sampai 94oC yang bertujuan untuk memisahkan DNA dari ikatan ganda menjadi ikatan tunggal.
Dendrogram : Diagram bercabang-cabang menyerupai pohon yang dipakai untuk menggambarkan derajat kekerabatan atau kemiripan. Fenotipe : Karakter yang dapat dilihat dan diukur atau sifat yang dapat
diobservasi pada makhluk hidup yang dihasilkan melalui interaksi antara potensi genetik dengan lingkungan.
Genotipe : Ciri fisik dari luar yang terkait dengan konstitusi genetik suatu individu.
Induksi mutasi : Memacu pembentukan mutan.
Iradiasi : Induksi radiasi, istilah baku yang digunakan untuk radiasi fisik yang terukur dan menggunakan peralatan tertentu. ISSR : Inter simple suquent repeat merupakan penanda DNA yang
menggunakan primer bagian microsetelit DNA atau urutan basa yang berulang dengan pola tertentu yang bersifat dominan.
Karakter : Setiap penciri organisme yang dapat dijasikan ukuran pembeda atau kesamaan suatu individu.
Keanekaragaman (diversity)
: Perbedaan atau variasi dalam ciri (karakter).
Kekerabatan : Derajat kesamaan umum fenotip atau genetik atau kedekatan kesamaan leluhur.
Monomorfik : Pola fragmen yang sama antar individu.
Multiplikasi : Pelipatgandaan materi genetik dalam kultur in vitro.
Mutagen : Wahana yang digunakan untuk menciptakan mutasi buatan. PCR : Polimerase chain reaction merupakan proses polimerasi
DNA secara berantai pada setiap siklus terjadi polimerisasi dan pembentukan DNA baru secara in vitro dengan bantuan primer, dNTP, taq DNA polimerasi.
Plasma nutfah (Germplasm)
: Bahan sumber hereditas yang diwariskan pada keturunan melalui gamet.
Plantlet : Tanaman kecil yang sudah lengkap akar, batang dan daun hasil perbanyakan in vitro.
Plb : Protocom like bodies yaitu perkembangan ekplan anggrek membentuk stuktur mirip kormus atau embriosomatik. Pleiotropic : Satu gen mengendalikan banyak karakter.
Polimorfik : Frgamen DNA yang berbeda antar individu.
Primer : Rantai DNA pendek yang terdiri atas beberapa nukleotida yang berfungsi sebagai pemula proses sintesis rantai DNA dalam reaksi polimerasi.
Regerasi : Perkembangan materi kultur jaringan membentuk organ tertentu.
Sinar gamma : Radiasi yang dihasilkan oleh sumber 60CO yang mempunyai daya tembus yang sangat kuat yang dapat menyebabkan terjadinya kekacauan materi genetik makhluk hidup.
Terresterial : Jenis anggrek yang tumbuh pada medium tanah. Moss : Media tanam poros yang digunakan untuk anggrek.
Latar Belakang
Kebutuhan taman sebagai jalur hijau, taman-taman kota, tanaman hias pembatas jalan dan ornamen taman mini di daerah perumahan di perkotaan saat ini sangat penting dan sudah menjadi kebutuhan mutlak. Tanaman anggrek Spathoglottis sp. merupakan salah satu jenis tanaman hias yang sangat potensial untuk memenuhi keperluan tersebut, karena mampu tumbuh dengan baik pada kondisi marginal, minim perawatan dan berpenampilan menarik. Terutama setelah didapat varian- varian bentuk dan warna daun serta bentuk dan warna bunga yang lebih beragam, baik melalui persilangan maupun dengan induksi mutasi.
Indonesia merupakan negara sumber plasma nutfah (mega biodiversitas) dari tanaman anggrek. Lebih dari 5.000 spesies anggrek atau sekitar seperlima dari total anggrek yang ada di dunia terdapat di Indonesia. Keragaman warna dan bentuk bunga anggrek merupakan faktor penting pada tanaman anggrek, semakin unik dan langka tanaman anggrek semakin tinggi nilai ekonominya (Handoyo dan Prasetya 2006).
Anggrek merupakan salah satu jenis tanaman hias yang sangat potensial sebagai penghasil devisa. Produksi dan nilai ekspor impor anggrek Indonesia mengalami fluktuasi dari tahun ke tahun, pada tahun 2009 produksi anggrek Indonesia sebanyak 16 205 949 batang, tahun 2010 sebanyak 14 050 445 batang, dan tahun 2011 sebanyak 14 419 819 batang (BPS 2012).
Selama beberapa tahun terakhir juga terjadi fluktuasi nilai ekspor-impor anggrek Indonesia. Nilai ekspor anggrek secara keseluruhan selama lima tahun dari tahun 2006-2010 mengalami pasang surut. Tahun 2006 sebesar $ 1.232.199 turun menjadi $ 1.166.671 tahun 2007 dan turun kembali sebesar $ 740.751 tahun 2008. Tahun 2009 ekspor anggrek mengalami peningkatan sebesar $ 1.040.544, namun pada tahun 2010 mengalami penurunan hingga sebesar $ 899.397. Nilai total impor anggrek yang juga mengalami fluktuasi yaitu pada tahun 2006 nilai impor anggrek sebesar $ 548.601 turun menjadi $ 480.204 tahun 2007 dan tahun 2008 impor anggrek mengalami penurunan yaitu sebesar $ 78.265. Tahun 2009 impor anggrek
mengalami peningkatan yaitu sebesar $ 434.071 dan tahun 2010 nilai impor anggrek turun hingga hanya mencapai $ 40.154. Walaupun terjadi fluktuasi, dari data ekpor
impor dapat diketahui bahwa terjadi surplus bagi Indonesia (Dirjen Hortikultura (2011).
Anggrek yang dominan disukai oleh konsumen baik dalam maupun luar negeri adalah jenis Dendrobium (34%), diikuti oleh Oncidium Golden Shower (26%), Cattleya (20%) dan Vanda (17%) serta anggrek lainnya (3%). Jenis anggrek Spathoglottis sp belum termasuk ke dalam anggrek yang diekspor karena belum ada permintaan dari luar negeri yang tercatat secara resmi pada BPS (2011) maupun Kominfo-Newsroom (2009). Anggrek jenis Spathoglottis sp. belum banyak diminati oleh konsumen karena masih memiliki beberapa kelemahan yang harus diperbaiki, diantaranya adalah kurang beragamnya warna bunga.
Pemuliaan tanaman anggrek melalui persilangan membutuhkan waktu yang relatif lama, sebagai contoh anggrek Dendrobium hibrida membutuhkan waktu 3-5 tahun untuk mendapatkan kultivar baru, akibat lamanya masa juvenil yang mencapai 30 bulan (Kamemoto et al. 1999, Fadelah 2006). Anggrek Vanda sp. dan Onchidium sp membutuhkan waktu yang lebih lama lagi karena masa juvenil yang lebih lama dibandingkan dengan anggrek Dendrobium (Martin dan Madassery 2006). Pemuliaan anggrek Spathoglottis sp. belum banyak dilaporkan, namun BALITHI segunung sudah melakukan persilangan secara intensif dan terprogram dengan baik. Beberapa hasil silangan sudah berhasil dilepas sebagai varietas baru (Kartikaningrum dan Puspasari 2005).
Hasil pemuliaan tanaman anggrek S. plicata dapat dipercepat dengan cara melakukan induksi mutasi, baik dengan bantuan bahan kimia maupun secara fisik. Salah satu cara yang paling efektif yang diduga mampu dan berpotensi untuk menghasilkan varian baru adalah melalui iradiasi sinar gamma (Human 2003). Keberhasilan upaya iradiasi untuk meningkatkan keragaman populasi sangat ditentukan oleh radiosensitivitas genotipe yang diradiasi. Tingkat sensitivitas tanaman sangat bervariasi antar jenis tanaman dan antar genotipe (Banerji dan Datta 1992). Radiosensitivitas dapat diukur berdasarkan nilai LD50 (Lethal dose 50) yaitu
dosis yang menyebabkan kematian 50% populasi tanaman. Beberapa studi menunjukkan bahwa dosis optimum yang dapat menghasilkan mutan terbanyak biasanya terjadi disekitar LD30-LD70 (van Harten 2002).
Penanda morfologi dapat digunakan sebagai cara cepat untuk mengidetifikasi perbedaan tanaman hasil mutasi (mutan) dibandingkan dengan tipe liarnya. Semakin banyak perbedaan morfologi antara tanaman mutan dengan tipe liarnya, semakin banyak terjadi perubahan akibat iradiasi sinar gamma. Marka morfologi sudah banyak digunakan untuk mengidentifikasi perubahan pada beberapa jenis tanaman, diantaranya adalah tebu (Hartatik 2000). Karakter morfologi daun dan bunga merupakan karakter penting yang umumnya digunakan untuk membedakan antar kelompok tanaman anggrek (Bechtel et al. 1982). Karakteriasasi berdasarkan marka morfologi mempunyai beberapa kelemahan karena sangat dipengaruhi oleh lingkungan, baik mikro maupun makro. Kesulitan lain akan terjadi apabila suatu karakter yang bersifat kuantitatif yang diatur oleh banyak gen sehingga interpretasi hasilnya akan sulit dilakukan (Weising et al. 1995).
Marka molekuler dapat digunakan untuk melengkapi hasil pengukuran menggunakan marka morfologi. Salah satu penanda molekuler yang dapat digunakan untuk mengungkap variabilitas genetik beberapa jenis tanaman adalah Inter Simple Sequence Repeats (ISSR). Identifikasi secara molekuler menggunakan marka ISSR sudah berhasil dan sangat efektif digunakan untuk mendeteksi keragaman genetik 31 spesies anggrek Dendrobium (Wang et al. 2009).
Perumusan Masalah
Pengembangan klon unggul dan unik anggrek S. plicata hanya dapat dilakukan apabila sumber keragaman genetiknya tersedia dalam koleksi plasma nutfah, terutama yang mempunyai jarak genetik yang jauh (Kartikaningrum et al. 2004). Populasi yang memiliki keragaman genetik tinggi sebagai bahan baku utama program pemuliaan tanaman dapat berupa kerabat liar, landras (unggul lokal), kultivar komersial, atau mutan hasil induksi mutasi.
Keterbatasan plasma nutfah anggrek S. plicata sebagai sumber gen bentuk dan warna daun serta bentuk dan warna bunga menyebabkan upaya induksi mutan secara buatan menjadi salah satu alternatif yang dapat ditempuh. Induksi mutasi secara artificial (buatan) dapat dilakukan dengan bantuan mutagen kimia, mutagen fisik, atau melalui kultur kalus berulang secara in vitro di dalam medium dengan penambahan zat pengatur tumbuh konsentrasi tinggi.
Penelitian Disertasi ini memanfaatkan teknik induksi mutasi buatan melalui iradiasi sinar gamma untuk meningkatkan keragaman genetik dan mendapatkan varian mutan anggrek S. plicata yang unik dan berbeda dengan wildtypenya. Varian mutan tersebut selanjutnya akan diseleksi secara in vitro dan di rumah kawat untuk mendapatkan genotipe-genotipe yang unik sekaligus untuk mendapatkan karakter agronomi dan morfologi yang baik dalam rangka mendapatkan genotipe yang berpotensi menjadi kultivar unggul dan unik, serta dapat dilepas sebagai kultivar baru hasil induksi mutasi menggunakan iradiasi sinar gamma.
Skenario pengembangan kultivar unggul dan unik anggrek S. plicata hasil iradiasi sinar gamma, diawali dengan melakukan seleksi untuk memilih mutan- mutan potensial yang dapat dilepas sebagai kultivar unggul dan unik, serta potensial dijadikan sebagai tetua persilangan untuk memperbaiki beberapa kekurangan karakter morfologi yang terdapat pada anggrek S. plicata aksesi Bengkulu. Selanjutnya dilakukan pengujian stabilitas mutan dan penentuan identitas morfologi dan molekuler (ISSR) mutan potensial yang dihasilkan. Terakhir dilakukan perbanyakan massal mutan potensial secara in vitro untuk mengantisipasi peningkatan permintaan pasar terhadap anggrek S. plicata kultivar unggul baru dan unik.
Tujuan Penelitian
Tujuan utama penelitian ini adalah untuk mendapatkan klon mutan unggul anggrek S. plicata asal Bengkulu melalui induksi mutasi dengan iradiasi sinar gamma. Selanjutnya dari tujuan utama dijabarkan menjadi beberapa tujuan khusus sebagai berikut :
1. Mendapatkan protokol perbanyakan massal yang standar dan seragam untuk anggrek S. plicata secara in vitro.
2. Menginduksi keragaman genetik anggrek S. plicata aksesi Bengkulu menggunakan iradiasi sinar gamma dan menentukan radiosensitivitas plb dan planlet hasil iradiasi sinar gamma dalam pembentukan mutan potensial untuk pengembangan klon mutan unggul anggrek S. plicata aksesi Bengkulu.
3. Menganalisis efektifitas dan akurasi penggunaan marka morfologi dan marka molekuler menggukan primer ISSR untuk mengidentifikasi keragaman genetik mutan anggrek S. plicata hasil iradiasi sinar gamma dan pembandingnya.
Hipotesis
1. Terdapat teknik perbanyakan massal anggrek S. plicata yang terbaik.
2. Terdapat dosis iradiasi sinar gamma yang efektif untuk menginduksi keragaman genetik yang tinggi yang mampu menghasilkan mutan potensial untuk pengembangan klon unggul anggrek S. plicata aksesi Bengkulu.
3. Perubahan yang terjadi pada sel mutan akan dapat diamati pada karakter morfologi dan karakter molekuler menggunakan marka ISSR baik pada fase vegetatif maupun fase generatif sehingga dapat dibedakan antara mutan dengan tipe liarnya.
Kerangka Pemikiran
Pemilihan anggrek S. plicata dalam percobaan ini didasarkan atas pemikiran bahwa anggrek S. plicata belum banyak beredar dipasaran karena varian warna daun dan bunga serta bentuk daun dan bunga yang tersedia masih sangat terbatas yaitu warna pink sampai ungu cerah saja. Selain itu masih banyak permasalahan yang terdapat pada anggrek S. plicata tipe standar yang harus segera diatasi, antara lain ukuran daun yang terlalu besar sehingga tidak seimbang dengan ukuran bunga yang kecil, tanaman terlalu tinggi sehingga mudah rebah, diameter tangkai bunga yang terlalu kecil sehingga tidak mampu menyangga bunga akibatnya tangkai bunga menjuntai kebawah dan tidak bisa terlihat karena terhalangi oleh rimbunnya daun, serta lama mekar satu bunga yang terlalu singkat biasanya 2-3 hari saja.
Permintaan anggrek Spathoglottis sudah mulai meningkat terutama untuk ditanam sebagai ornamen taman di perumahan-perumahan yang berwawasan lingkungan di daerah perkotaan, taman-taman kota dan border jalan, sehingga dibutuhkan tanaman dalam jumlah besar dan varian warna yang lebih banyak. Teknik perbanyakan massal dan kontinyu sangat diperlukan untuk memenuhi kebutuhan peningkatan permintaan yang terus meningkat.
Banyak cara untuk meningkatkan keragaman warna dan bentuk tanaman anggrek, antara lain dengan cara hibridisasi dan induski mutasi. Hibridisasi akan berhasil apabila terdapat keragaman yang besar di dalam plasma nutfah. Sebaliknya, apabila tetua yang tersedia keragamannya rendah cara ini akan mengalami hambatan dan tingkat keberhasilannya rendah serta dibutuhkan waktu yang lebih lama untuk mendapatkan varitas baru melalui teknik persilangan, karena anggrek memiliki masa juvenil yang panjang.
Induksi mutasi dengan iradiasi sinar gamma dapat menjadi salah satu alternatif untuk meningkatkan keragaman anggrek S. plicata. Penggunaan iradiasi sinar gamma diyakini akan mampu menghasilkan varian baru anggrek S. plicata yang lebih beragam warna dan bentuk bunganya, sekaligus akan mampu memperbaiki beberapa kekurangan yang terdapat pada tanaman tipe standar. Penggunaan iradiasi sinar gamma umumnya akan menghasilkan tanaman yang lebih kecil, daun varigata, dan ada kemungkinan didapatkan tanaman unik yang sangat berbeda dengan tipe liarnya (van Harten 2002).
Penggunaan iradiasi sinar gamma ternyata telah berhasil meningkatkan keragaman berbagai jenis tanaman, seperti yang dilaporkan oleh beberapa peneliti pada tanaman krisan (Datta dan Chakrabarty 2009, Datta dan Steiner 2005). Induksi mutasi dengan iradiasi sinar gamma pada tanaman krisan yang berwarna pink telah menghasilkan variasi warna bunga paling banyak, antara lain orange, coklat, bronze, merah, putih dan kuning sebagai warna akhir. Iradisi pada krisan berwarna ungu telah didapatkan warna pink, putih dan merah. Model perubahan warna bunga hasil iradiasi sinar gamma dapat dilihat pada Gambar 1.
Perubahan warna yang terjadi pada krisan ternyata berlaku pula pada bunga anyelir (Aisyah et al. 2009), kecombrang (Dwiatmini et al. 2009), mawar (Soedjono 2003), Portulaca grandiflora (Wongpiyasatid dan Roongtanakiat 1992).
Pendekatan yang sama secara analogi terhadap perubahan yang terjadi pada tanaman krisan berwarna pink yang telah menghasilkan banyak varian warna bunga yang berbeda dibandingkan dengan tipe liarnya, diharapkan dapat terjadi pula pada anggrek S. plicata. Anggrek S. plicata yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari provinsi Bengkulu yang mempunyai warna bunga ungu cerah, pangkal batang/tangkai daun dan tangkai bunga yang berwarna ungu cerah.
Induksi mutasi diharapkan dapat memperbaiki beberapa kekurangan pada morfologi tanaman, seperti daun yang terlalu panjang dan lebar, ideotipe tanaman yang terlalu besar, lama mekar bunga yang sangat singkat dan jumlah bunga yang mekar bersamaan yang terlalu sedikit.
Novelty
Kebaharuan (novelty) yang telah didapatkan dari beberapa rangkaian percobaan yang telah dilakukan adalah :
1. Teknik perbanyakan massal anggrek S. plicata yang mampu menghasilkan lini klon plb dan planlet dalam jumlah besar dan seragam secara in vitro.
2. Radiosensitivitas (LD50) plb dan planlet anggrek S. plicata yang dapat digunakan
sebagai acuan untuk melakukan iradiasi sinar gamma.
3. Sembilan mutan potensial hasil iradiasi sinar gamma yang terdiri atas 5 mutan warna bunga, 2 mutan bentuk bunga dan 2 mutan berbeda tipe pertumbuhan tanaman dibandingkan dengan tipe liarnya, yang sudah stabil secara klonal pada generasi ketiga- keenam dan berpotensi dilepas sebagai varitas baru.
4. Ideotipe tanaman baru (mutan 4) yang berukuran kecil dengan warna bunga kuning cerah yang sangat menarik dan sangat cocok dijadikan tanaman pot, sudah stabil sampai generasi keenam dan berpotensi dilepas sebagai varitas baru, karena memenuhi persyaratan BUSS (baru, unggul, seragam dan stabil).
5. Metode analisis molekuler yang lebih efektif dan lebih akurat dalam mengidentifikasi keragaman genetik tanaman anggrek S. plicata dan mutan hasil iradiasi sinar gamma menggunakan marka ISSR.
BAB II.