4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Ekstraksi dan Uji Bioaktivitas Ekstrak Kasar Spons
Ekstraksi merupakan tahap awal penapisan komponen bioaktif dari sampel spons (W-19-08 dan W-36-08). Ekstraksi secara harfiah artinya adalah suatu proses penarikan komponen yang diinginkan dari suatu bahan dengan cara pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu bahan yang menjadi sumber komponennya. Proses penarikan komponen bioaktif dari spons diawali dengan proses penghancuran bahan, penimbangan, perendaman dengan pelarut (maserasi), penyaringan dan tahap pemisahan. Sampel spons (W-19-08 dan W-36- 08) diambil dari dalam pendingin beku dan dibiarkan sesaat di udara terbuka agar esnya mencair.
Sampel spons dimaserasi dalam alkohol teknis (96%) di dalam erlenmeyer dalam suhu kamar dan dilakukan hingga warna pelarutnya bening. Proses ini diharapkan semua senyawa kimia yang terkandung di dalam jaringan spons terekstrak atau tertarik dan terlarut dalam cairan pelarut. Senyawa-senyawa kimia
yang terlarut merupakan senyawa kimia yang memiliki kesamaan polaritas dengan pelarut.
Setelah tahap maserasi dan penyaringan (filtration) diperoleh ekstrak kasar dari sampel spons dengan berat setelah di evaporasi serta rendemen yang diperoleh adalah seperti yang terlihat pada Tabel 2. Rendemen merupakan nilai persentase perbandingan antara berat ekstrak kering spons dengan berat basah sampel spons. Contoh perhitungan rendemen ekstrak kasar W-19-08 dan W-36-08 dapat dilihat pada Lampiran 4.
Ekstrak W-19-08 yang diperoleh dari hasil evaporasi berupa ekstrak berwarna coklat muda sedangkan ekstrak W-36-08 berupa ekstrak kenyal berwarna kuning-jingga. Kedua ekstrak ini dikeringkan terlebih dahulu menggunakan freeze dryer hingga diperoleh ekstrak kering atau disebut sebagai ekstrak kasar.
Tabel 2 Nilai berat sampel basah (gram) dan rendemen ekstrak kasar (%) sampel spons W-19-08 dan W-36-08. W-19-08 (1) 1,14 W-19-08 (2) 0,54 W-36-08 (1) 5,60 W-36-08 (2) 3,66 50 1,68 3,36 140 9,26 6,61
Sampel Berat basah spons (gram) Berat ekstrak (gram) Berat ekstrak total (gram) Rendemen ekstrak (%)
Terlihat dari Tabel 2, berat ekstrak kasar spons W-19-08 adalah 1,68 gram dan ekstrak kasar spons W-36-08 adalah 9,26 gram. Berat ekstrak dari spons selanjutnya digunakan untuk menghitung nilai rendemen hasil ekstraksi dan maserasi dalam alkohol teknis. Nilai rendemen ekstrak spons W-19-08 dan W-36- 08 masing-masing diperoleh 3,36% dan 6,61%.
Untuk selanjutnya pada ekstrak kasar dari spons dilakukan uji sitotoksik in vitro terhadap sel lestari kanker payudara T47D yang terlebih dahulu ditumbuhkan pada medianya. Uji ini dilakukan untuk menguji potensi senyawa yang terkandung dalam ekstrak kasar dari spons dalam menghambat pertumbuhan
atau mematikan sel uji T47D. Uji sitotoksik ekstrak kasar dari spons dilakukan dengan menggunakan metode MTT. Prinsipnya adalah sel uji T47D yang telah diberi ekstrak spons pada konsentrasi tertentu diberi pereaksi MTT, diamati perubahan warna yang terjadi, dan dilakukan pengukuran absorbansi intensitas warna yang terbentuk sebagai representasi kehidupan sel uji T47D. Kemampuan ekstrak kasar dari spons pada konsentrasi tertentu dalam menghambat pertumbuhan atau mematikan sel uji T47D memperlihatkan bahwa senyawa tersebut memiliki sifat sebagai senyawa antikanker. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08 terlihat pada Gambar 6.
8 48 49 25 40 44 0 10 20 30 40 50 60 30 60 120 P e rs e n ta se k e m a ti a n s e l ( % )
Konsentra si ekstra k ka sa r sponge (ppm)
Sponge W-19-08 Sponge W-36-08
Gambar 6 Persentase kematian sel lestari tumor T47D setelah perlakuan dengan ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08 (Keterangan: (---) batas persentase kematian 50%).
Persentase kematian sel lestari tumor yang diberi perlakuan ekstrak kasar dihitung dengan rumus (2) berdasarkan hasil pengukuran dengan spektrofotometer dan contoh perhitungan persentase kematian dapat dilihat di Lampiran 5. Gambar 6 menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak kasar maka semakin tinggi persentase kematian sel tumor. Pada konsentrasi 30 ppm, persentase kematian sel T47D akibat perlakuan ekstrak W-19-08 lebih rendah daripada yang
diakibatkan perlakuan ekstrak W-36-08 namun persentase keduanya masih dibawah 50% sehingga kedua ekstrak dapat dikatakan memiliki aktivitas yang rendah. Menurut Andersen (1991) in Sismindari et al. (2002), suatu ekstrak dianggap aktif apabila mampu menyebabkan mortalitas 50% populasi sel tumor pada konsentrasi di bawah 30 ppm (LC50 < 30 ppm). Bahkan pada konsentrasi 120 ppm pun, persentase kematian sel uji tetap tidak melebihi 50%. Persentase kematian yang rendah tersebut diduga disebabkan karena senyawa yang terkandung di dalam ekstrak kasar masih merupakan campuran senyawa kimia. Senyawa-senyawa tersebut dapat bersifat antagonis atau saling meniadakan sehingga ekstrak ini memiliki persentase kematian yang rendah.
Jika dibandingkan dengan hasil uji sitotoksik pada tahun 2008, hasil uji sitotoksik diatas menunjukkan penurunan aktivitas biologis ekstrak kasar kedua spons yang diperoleh dari hasil ekstraksi sampel spons yang telah melalui masa penyimpanan. Sebenarnya kedua hasil tersebut tidak dapat dibandingkan karena beberapa dugaan berikut ini:
1. uji sitotoksik in vitro dilakukan oleh orang berbeda dan prosedur kerja yang baru sehingga kondisi pada saat uji sudah berbeda dan prosedur kerja yang baru perlu diverifikasi;
2. generasi sel uji T47D pada uji tahun 2008 berbeda dengan generasi pada saat uji tahun 2010. Generasi sel uji pada tahun 2008 merupakan hasil pembiakan yang lama dan diduga sudah resisten terhadap ekstrak uji; 3. masa penyimpanan dalam pelarut dalam waktu yang lama dapat
menyebabkan senyawa yang terkandung di dalam spons mengalami perubahan struktur secara kimiawi karena dapat terjadi reaksi alkilasi atau esterifikasi (Ebada et al.2008);
4. metabolit sekunder yang terkandung dalam spons dihasilkan oleh simbionnya. Sejumlah publikasi mengungkapkan beberapa jenis mikroorganisme yang bersimbiosis dengan spons ternyata juga menghasilkan metabolit sekunder yang sama dengan metabolit sekunder yang diisolasi dari spons (Lee et al. 2001; Piel 2004; Piel et al. 2004; Radjasa 2008). Oleh karena itu, dapat diduga mikroorganisme yang hidup
dalam spons tersebut telah mati selama masa penyimpanan namun dugaan ini perlu dikaji dan dibuktikan lebih lanjut.
Perhitungan nilai Lethal Concentration (LC50) 24 jam ekstrak kasar sampel spons dilakukan berdasarkan hasil persentase kematian sel T47D pada seri konsentrasi ekstrak (Gambar 6) dengan menggunakan analisis probit. Tabel 3 menunjukkan nilai LC50 ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08. Perhitungan ini dilakukan untuk memperkirakan konsentrasi ekstrak kasar yang menyebabkan kematian sel T47D sebesar 50%. Contoh perhitungannya dapat dilihat pada Lampiran 5. Nilai LC50 menunjukkan bahwa ekstrak kasar W-19-08 akan menyebabkan kematian sel T47D sebesar 50% pada konsentrasi 156,14 ppm, sedangkan ekstrak kasar W-36-08 akan menyebabkan kematian sel T47D sebesar 50% pada konsentrasi 97,04 ppm.
Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak kasar spons W-19-08 dan W-36-08 terhadap sel T47D.
No Sampel LC50 (ppm)
1 W-19-08 156,14
2 W-36-08 97,04