BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
D. Fraksinasi Ekstrak etanol hasil maserasi
Kromatografi kolom vakum adalah suatu bentuk kolom yang terutama bermanfaat untuk fraksinasi secara kasar dengan cepat. Fraksinasi ini tidak dapat mengisolasi dalam bentuk suatu senyawa tunggal namun hanya mengisolasi berdasarkan polaritas senyawa pada fase gerak. Senyawa ataupun golongan senyawa yang diperoleh bisa lebih dari satu. Penggunaan vakum akan mempercepat proses pengeluasian karena selain adanya gaya gravitasi juga terdapat perbedaan tekanan pada kolom.
Ekstrak etanol dari tumbuhan tembelekan yang didapat dari metode maserasi kemudian di fraksinasi dengan kromatografi kolom vakum. Sebelum di fraksinasi dilakukan tahap KLT orientasi berdasarkan pemisahan senyawa terpenoid. Hal ini didasarkan pada kandungan senyawa golongan terpenoid yang terdapat di daun tumbuhan tembelekan. Fase gerak yang digunakan pada KLT adalah toluen-etil asetat dengan perbandingan 93 banding 7 (v/v) dan fase diam yang digunakan adalah silika gel. Toluen merupakan pelarut yang relatif non-polar memiliki indeks non-polaritas 2,4 P’ dan etil-asetat merupakan pelarut yang relatif lebih polar daripada toluen memiliki indeks polaritas 4,4 P’ (Skoog, 1985). Campuran kedua fase gerak didapatkan indeks polaritas sebesar 2,54 P’. Silika gel merupakan bahan penjerab yang polar. Hal ini dikarenakan adanya atom oksigen yang polar dan adanya gugus hidroksi pada permukaannya (Gritter dkk, 1991).
Hasilnya pemisahan belum cukup optimal karena pada profil bercak KLT masih terdapat beberapa bercak yang bertumpuk pada daerah awal jarak pengeluasian (awal penotolon) yang menunjukkan bahwa beberapa bercak bersifat lebih polar sehingga lebih berinteraksi kuat dengan fase diamnya (Gambar 2)..
Gambar 2. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan untuk panduan fraksinasi dengan perbandingan fase gerak 93:7, jarak pengembangan 15 cm.
Keterangan :
Fase diam : silika gel GF254
Fase gerak : toluen : etil asetat (93:7 v/v) Deteksi : Sinar UV 365 nm
( Dari kiri ke kanan merupakan urutan bercak penotolan dari 1 kali penotolan sampai n kali penotolan.)
Bercak yang menumpuk akan mempengaruhi hasil dari proses fraksinasi yang diharapkan akan diperoleh fraksi dengan profil bercak yang jelas serta terpisah menurut kepolarannya. Modifikasi fase gerak diperlukan untuk bisa mengeluasi bercak yang bertumpuk hingga bercak terpisah dan juga untuk mendapatkan kerapatan jarak antar bercak yang teratur. Melihat sifat bercak yang polar maka modifikasi fase gerak dibuat menjadi lebih polar daripada sebelumnya yang non polar. Fase gerak non polar, dalam hal ini toluen, dikurangi konsentrasinya dan fase gerak yang lebih polar, etil asetat, konsentrasinya ditambah. Perbandingan fase gerak dibuat toluen (90) : etil asetat (10), indeks polaritas campuran 2,6 P’.
Setelah dilakukan proses eluasi, hasil pemisahan dengan perbandingan ini masih belum memuaskan karena masih terdapat bercak yang menumpuk dan kerapatan jarak antar bercak masih belum merata (Gambar 3).
Gambar 3. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan untuk panduan fraksinasi dengan perbandingan fase gerak 90:10, jarak pengembangan 15 cm.
Keterangan :
Fase diam : silika gel GF254
Fase gerak : toluen : etil asetat (90:10 v/v) Deteksi : Sinar UV 365 nm
Modifikasi selanjutnya dirubah pada perbandingan toluen (85) : etil asetat (15), indeks polaritas campuran fase gerak 2,7 P’. Pemisahan becak sudah baik karena bercak sudah tidak menumpuk dan diperoleh kerapatan jarak antar bercak yang hampir merata(Gambar 4).
Gambar 4. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan untuk panduan fraksinasi dengan perbandingan fase gerak 85:15, jarak pengembangan 15 cm..
Keterangan :
Fase diam : silika gel GF254
Fase gerak : toluen : etil asetat (85:15 v/v) Deteksi : Sinar UV 365 nm
Hasil dengan perbandingan 85:15 sudah baik, namun dirasa masih perlu dilakukan modifikasi lebih lanjut untuk mendapatkan hasil yang lebih baik lagi. Perbandingan selanjutnya yang digunakan adalah toluen (80) banding etil asetat (20). indeks polaritas campuran fase gerak 2,8 P’. Hasilnya kerapatan jarak antar
bercak sudah merata dan namun terdapat bercak yang menumpuk pada posisi akhir jarak pengeluasian(Gambar 5).
Gambar 5. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan untuk panduan fraksinasi dengan perbandingan fase gerak 80:20, jarak pengembangan 15 cm.
Keterangan :
Fase diam : silika gel GF254
Fase gerak : toluen : etil asetat (80:20 v/v) Deteksi : Sinar UV 365 nm
Melihat profil dari ke empat KLT orientasi di atas maka diputuskan untuk memakai fase gerak toluen-etil asetat dengan perbandingan 85:15 v/v.
Setelah diperoleh sistem pemisahan dari KLT orientasi, kemudian diaplikasikan ke metode Vaccum Coloumn Chromatography (VCC) atau disebut juga Kromatografi Kolom Vakum. Volume fase gerak yang digunakan untuk setiap kali fraksinasi sebanyak 50 ml karena diharapkan dapat mengeluasi bercak berdasarkan urutan kepolarannya. Pada perbandingan fase gerak 85:15, indeks polaritas campuran dari kedua senyawa tersebut adalah 2,7 P’ yang masuk dalam kategori fase gerak yang relatif non-polar. Bercak/senyawa yang bersifat non polar akan terfraksinasi terlebih dahulu. Berturut-turut selanjutnya akan didapatkan bercak/senyawa yang cenderung lebih polar. Senyawa-senyawa yang non-polar akan berinteraksi dengan fase gerak yang non-polar sehingga lebih cepat tereluasi sedangkan senyawa yang relatif lebih polar akan berinteraksi dengan fase diam sehingga waktu eluasinya lebih lama.
Fase diam yang digunakan adalah silika gel yang dibuat menjadi bubur dengan pelarut fase gerak yang akan digunakan. Pembuatan bubur ini bertujuan untuk memudahkan dalam pemasukan ke dalam kolom serta untuk menghindari terjadinya rongga udara pada kolom yang dapat mengganggu dalam proses fraksinasi. Penghisapan pelarut bubur dalam kolom dimaksudkan untuk lebih memampatkan fase diam sehingga diperoleh kerapatan fase diam yang kompak dan merata.
Fraksinasi dengan menggunakan kromatografi vakum-cair didapatkan 12 fraksi hasil (Gambar 6).
Gambar 6. Kromatogram 12 fraksi ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan hasil fraksinasi dengan jarak pengembangan 15 cm.
Keterangan :
Fase diam : silika gel GF254
Fase gerak : toluen : etil asetat (85:15 v/v) Deteksi : Sinar UV 365 nm
Proses fraksinasi dapat dihentikan karena sudah didapatkan profil bercak yang sesuai dengan KLT orientasi. Pada fraksi no 1 didapatkan profil bercak yang berwarna hijau pada UV 365 nm. Profil bercak ini sudah sesuai dengan profil bercak pada KLT orientasi yang tereluasi pertama kali yang juga memberikan warna hijau pada UV 365 nm. Akhir pengeluasian pada profil bercak KLT orientasi juga ditandai dengan bercak yang berwarna hijau pada UV 365 nm dan bercak ini sudah diperoleh profil bercaknya mulai dari fraksi no 8.
Fraksi-fraksi yang mempunyai kesamaan bercak kemudian digabung. Selain itu penggabungan bercak juga didasarkan pada bercak yang dominan pada fraksi. Bercak dominan adalah bercak yang mempunyai area relatif lebih lebar dan terlihat lebih tebal. Fraksi yang mempunyai kesamaan bercak yaitu pada fraksi no 8 sampai 12 yang kemudian digabung menjadi satu. Profil bercak pada fraksi no 3 sampai 7 mempunyai profil yang hampir sama dalam rentang panjang bercak pengeluasiannya. Namun, profil bercak pada fraksi no 4 sampai 7 lebih dominan pada bercak bagian bawah pengeluasian (polar) sehingga fraksi no 4 sampai 7 digabung menjadi satu. Fraksi no 1 sampai 3 tidak digabung karena mempunyai karakteristik bercak dominan yang berbeda. Penggabungan ini bertujuan untuk mendapatkan profil fraksi dari yang nonpolar sampai ke fraksi yang polar. Selain itu untuk mendapatkan profil dari fraksi yang memiliki efek toksik pada larva artemia.
Tabel II. Penggabungan hasil fraksinasi menjadi 5 fraksi berdasarkan data gambar 6
Penggabungan Fraksi
no nama dan berat fraksi gabungan
1 F1 berat 40 mg
2 F2 berat 150 mg
3 F3 berat 60 mg
4 sampai 7 F4 berat 150 mg 8 sampai 12 F5 berat 20 mg
Hasil penggabungan didapatkan lima fraksi yaitu F1, F2, F3, F4, F5. Tabel penggabungan fraksi menunjukkan berat dari fraksi gabungan. Berat fraksi yang besar ditunjukkan pada F2 dan F4. Lima fraksi gabungan tersebut, tiga fraksi yang diujikan dengan metode BST yaitu F , F , F . Pengujian dengan metode BST tidak
melibatkan F1 karena profil bercak KLT pada F1 sudah terwakili pada F2. Pada F5 tidak diuji karena profil nya sudah terwakili pada F4.