Konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA dapat dihitung secara akurat melalui penyerapan spektofotometrik sinar ultraviolet. Jumlah radiasi yang diserap DNA berbanding lurus dengan jumlah DNA dalam sampel (Brown, 1995). Hasil sidik ragam menunjukkan bahwa perbandingan volume darah dengan lisis buffer tidak berpengaruh terhadap konsentrasi DNA yang dihasilkan, sedangkan kecepatan sentrifugasi berpengaruh terhadap konsentrasi DNA yang dihasilkan (P<0,05). Rataan konsentrasi semakin meningkat dengan peningkatan kecepatan sentrifugasi. Rataan konsentrasi DNA yang dihasilkan diperlihatkan pada Tabel 2.
Tabel 2 menunjukkan bahwa konsentrasi DNA pada kecepatan sentrifugasi 2.500 rpm (205,82 ng/µl) lebih sedikit daripada kecepatan 3.500 rpm (519,33 ng/µl) (P<0,05). Perbandingan lisis buffer dan darah tidak berpengaruh terhadap konsentrasi DNA yang dihasilkan. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan sampel darah dalam jumlah yang sedikit jika ditemukan kesulitan dalam memperoleh sampel darah dalam volume besar.
Konsentrasi yang diperoleh pada ketiga taraf perlakuan perbandingan darah dan lisis buffer adalah sama. Namun pada perbandingan darah dan lisis buffer 1:2 lebih optimal dalam melisis eritrosit. Hal ini diperkirakan bahwa darah yang digunakan lebih sedikit dibandingkan 1:1 dan 2:1, tetapi dapat memanen leukosit dengan jumlah yang tidak berbeda. Jumlah leukosit yang dipanen berbanding lurus dengan konsentrasi DNA yang dihasilkan karena DNA ada di dalam inti sel yang hanya dimiliki oleh leukosit. Dellman dan Brown (1989) menyatakan bahwa eritrosit mamalia dewasa tidak berinti, sedangkan leukosit memiliki nukleus (inti sel). DNA bersama-sama protein dan molekul RNA terdapat dalam inti sel (Muladno, 2002).
Tabel 2. Rata-rata Konsentrasi DNA (ng/µl) pada Perbandingan Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan yang Berbeda.
Darah:lisis buffer Kecepatan sentrifugasi 1:2 1:1 2:1 Rata-rata ± SE 2.500 rpm 170,60±53,32 220,10±71,92 226,78±52,06 205,82b±32,13 3.500 rpm 862,50±272,37 496,45±190,33 199,05±56,39 519,33a±130,46 Rata-rata ± SE 516,55a±183,31 358,27a±107,70 212,91a±35,91
Keterangan: Huruf superskrip berbeda pada kolom yang sama, berbeda (P<0,05); SE = Standard
18 Hasil sidik ragam yang tidak nyata pada pengaruh perbandingan darah dan lisis buffer juga disebabkan standard error pada kombinasi perlakuan 1:2, 3.500 rpm (272,37 ng/µl) dan 1:1, 3.500 rpm (190,33 ng/µl) lebih besar dari standard error pada kombinasi perlakuan yang lain. Standard error yang besar pada kedua kombinasi perlakuan mungkin disebabkan oleh pengaruh pengenceran yang dilakukan pada tahap penghitungan konsentrasi. Pengenceran dilakukan karena
QeneQuant DNA calculator tidak dapat membaca pada konsentrasi DNA awal yang
pekat. Hasil pembacaan konsentrasi oleh GeneQuant DNA calculator dikalikan dengan faktor pengenceran yang dilakukan. Hal tersebut membuat selang data konsentrasi pada kedua kombinasi perlakuan tersebut menjadi besar sehingga mengakibatkan standard error juga berbeda.
Konsentrasi DNA yang diperoleh dengan kecepatan yang berbeda adalah tidak sama. Peningkatan konsentrasi DNA terjadi dengan pertambahan kecepatan dari 2.500 rpm menjadi 3.500 rpm. Rata-rata konsentrasi DNA pada kecepatan 2.500 rpm adalah 205,82 ng/µ, sedangkan pada kecepatan 3.500 rpm adalah 519,33 ng/µl. Peningkatan konsentrasi pada kecepatan sentrifugasi 3.500 rpm diduga disebabkan oleh lebih banyak sel darah putih yang mengendap daripada kecepatan 2.500 rpm. Prinsip sentrifugasi berdasarkan fenomena bahwa partikel yang tersuspensi di dalam suatu wadah akan mengendap ke dasar wadah karena pengaruh gravitasi (Triwibowo, 2008).
Kemurnian DNA
Tingkat kemurnian DNA berhubungan dengan kualitas DNA. DNA dinyatakan murni jika memiliki nilai rasio OD260/OD280 (optical density) berkisar antara 1,8-2,0 (Sambrook et al., 1989). Tingkat kemurnian tersebut diukur secara spektofotometrik dengan menggunakan Genequant DNA calculator. Sidik ragam menunjukkan bahwa perbandingan darah dengan lisis buffer tidak berpengaruh terhadap kemurnian DNA. Rataan rasio OD260/OD280 dari DNA yang dihasilkan disajikan secara lengkap pada Tabel 3.
19 Tabel 3 menunjukkan bahwa kecepatan sentrifugasi juga tidak berpengaruh terhadap kemurnian DNA yang dihasilkan pada penelitian ini (P>0,05). Rataan kemurnian DNA pada keenam kombinasi perlakuan berkisar 1,009 sampai 1,214. Rasio tertinggi relatif dimiliki oleh perbandingan darah dan lisis buffer 1:1 pada kecepatan 2.500 rpm (1,214±0,057). Rasio relatif terendah ada pada perbandingan darah dan lisis buffer 2:1 pada kecepatan 2.500 rpm (1,009±0,018). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa DNA yang dihasilkan tidak terlalu murni. Kemurnian yang rendah ini diduga disebabkan protein yang tercampur pada DNA yang dihasilkan. Sambrook et al. (1989) menjelaskan bahwa rasio OD akan lebih besar atau lebih kecil dari nilai 1,8-2,0 jika ditemukan kontaminasi dari protein atau fenol. Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah high salt method yang hanya menggunakan NaCl jenuh sehingga materi pengotor berupa protein masih tinggi ditemukan pada perolehan DNA. Prasetyo (2005) menyatakan bahwa kandungan materi pengotor (protein, RNA, fenol, heparin, haemoglobin) lebih tinggi pada DNA yang diekstraksi menggunakan metode pengendapan garam. Penggunaan NaCl jenuh juga diduga sebagai sumber kontaminasi DNA.
Perbandingan volume darah dan lisis buffer maupun kecepatan sentrifugasi tidak berpengaruh terhadap kemurnian DNA yang dihasilkan karena kedua faktor tersebut hanya menentukan banyaknya sel darah putih yang diperoleh. Setelah pengkoleksian sel darah putih baru dilakukan protein removal dengan menambahkan Proteinase-K yang terdiri atas 10 % SDS, 0,5 M EDTA, dan Proteinase-K dalam jumlah yang sama pada masing-masing perlakuan. EDTA berfungsi untuk merusak sel dengan cara mengikat ion magnesium. SDS untuk merusak membran sel. Proteinase-K berfungsi untuk menghilangkan protein yang berikatan dengan DNA di dalam inti sel darah putih (Sigma, 2008). Protein tersebut tidak hilang, tetapi hanya dipisahkan dari DNA. DNA yang ada lalu dipekatkan dengan menggunakan NaCl Tabel 3. Rata-rata Kemurnian DNA (OD260/OD280) pada Perbandingan Darah
dan Lisis Buffer dengan Kecepatan yang Berbeda. Darah:lisis buffer Kecepatan sentrifugasi 1:2 1:1 2:1 Rata-rata ± SE 2.500 rpm 1,155±0,103 1,214±0,057 1,009±0,018 1,12±0,044 3.500 rpm 1,148±0,111 1,161±0,065 1,131±0,054 1,146±0,042 Rata-rata ± SE 1,151±0,070 1,187±0,041 1,070±0,034
20 jenuh. Proses penuangan supernatan yang berisi DNA memungkinkan protein yang ada ikut tertuang sehingga menyebabkan DNA yang diperoleh terkontaminasi oleh protein. Selain itu, kemurnian yang rendah juga dapat terjadi karena volume Proteinase-K yang digunakan terlalu sedikit dan masih terdapat NaCl pada DNA.
Konsentrasi DNA yang dihasilkan pada penelitian ini cukup besar dengan tingkat kemurnian yang rendah. Hal ini disebabkan penghitungan dengan GeneQuant DNA calculator didasarkan pada penghitungan optical density (OD). Dengan demikian, yang dihitung termasuk kontaminan (protein). Tingkat kemurnian DNA yang rendah tidak menutup kemungkinan DNA tersebut untuk digunakan pada penelitian yang berbasis teknologi DNA. Penelitian teknologi DNA yang memerlukan DNA dalam jumlah banyak dan tidak menuntut tingkat kemurnian yang tinggi, diantaranya pemetaan genetik, teknologi marker, dan sequencing DNA.
Setiap prosedur ekstraksi DNA memiliki kelebihan dan kekurangan, begitu juga dengan high salt method. DNA yang diperoleh dengan menggunakan metode
high salt method yang dilakukan pada penelitian ini, memiliki tingkat kemurnian
yang rendah. Meskipun demikian, metode ini mempunyai kelebihan yaitu tidak menggunakan bahan-bahan yang bersifat toksik dan korosif seperti fenol dan kloroform. Dengan demikian high salt method bersifat aman terhadap peneliti yang menggunakannya. Selain itu, isu lingkungan menuntut untuk menggunakan bahan-bahan yang ramah lingkungan. High salt method dapat dijadikan alternatif metode ekstraksi DNA yang bersifat ramah lingkungan.
Kualitas DNA
Hasil elektroforesis dari DNA ditampilkan pada Gambar 4. Masing-masing kombinasi perlakuan diwakili oleh satu ulangan yang didapat melalui pemilihan secara acak.
21
Gambar 4. Hasil Elektroforesis DNA dalam Gel 0,8% Agarosa (M= DNA Ladder 1 kb, T1 sampai dengan T6 = sampel DNA).
Keenam sampel DNA dielektroforesis dalam gel Agarosa 0,8% pada tegangan 100 V selama 1 jam. Marker yang digunakan adalah DNA Ladder N32325 yang berukuran 1 kb. Ukuran sampel DNA diperkirakan dengan melihat letak DNA terhadap marker yang telah diketahui ukurannya. Pengukuran tersebut hanya bersifat perkiraan dan untuk memastikan DNA tersebut benar-benar ada. Keenam sampel DNA menunjukkan bahwa ukuran DNA lebih dari 10 kb karena pita DNA berada di atas marker yang digunakan. DNA tersebut merupakan DNA genom sapi FH yang ukurannya 3 giga basa (National Institutes of Health, 2009).
Keenam sampel DNA tidak turun sempurna pada gel Agarosa. Masih banyak DNA yang berada di dalam sumur gel agarosa. Hal ini disebabkan oleh konsentrasi yang tinggi dari masing-masing sampel, T1 (108,8 ng/µl), T2 (329,7 ng/µl), T3 (230,4 ng/µl), T4 (433,8 ng/µl), T5 (252,4 ng/µl), dan T6 (222,8 ng/µl). Besarnya konsentrasi menyebabkan kecepatan pergerakan DNA dari kutub negatif ke kutub positif menjadi lambat sehingga banyak DNA yang tertinggal di sumur. Old dan Primrose (1985) menyatakan bahwa molekul-molekul DNA bermuatan negatif dan di dalam medan listrik molekul DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda tergantung ukurannya. Molekul DNA yang kecil dapat dengan mudah
DNA (>10 kb)
22 melewati gel dan karenanya bergerak lebih cepat dibandingkan molekul yang lebih besar.
Banyak faktor yang mempengaruhi kecepatan perpindahan DNA dari kutub negatif ke kutub positif. Faktor-faktor tersebut yaitu ukuran molekul DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, voltase yang digunakan, adanya etidium bromida di dalam gel, dan komposisi larutan buffer (Muladno, 2002). Faktor yang lain mempengaruhi permindahan DNA yang menyebabkan DNA masih tertinggal di dalam sumur selain besar molekul DNA, diduga adalah konsentrasi gel agarosa. Gel agarosa yang digunakan dalam penelitian ini adalah konsentrasi 0,8%. Konsentrasi gel tersebut kemungkinan terlalu tinggi jika sampel yang dianalisis berukuran 3 giga pasang basa. Muladno (2002) menyatakan bahwa migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi. Nicholl (1996) menyatakan konsentrasi gel yang normal untuk elektroforesis yaitu antara 0,3%-2,0% dan untuk DNA yang berukuran 1000-50000 menggunakan gel agarosa yang berkonsentrasi 0,3%. Selain itu, NaCl diduga masih terdapat di dalam sampel DNA sehingga menampakkan pita DNA yang tidak tajam pada hasil elektroforesis.
DNA yang berasal dari darah segar sapi berhasil diisolasi dengan baik, karena tidak ada pita-pita lainnya yang tampak pada gambar pada setiap sampel (single band). Elektroforesis DNA menghasilkan pita tunggal pada keenam sampel. Hal ini menunjukkan bahwa DNA yang diperoleh berkualitas baik. DNA yang dihasilkan murni tidak bercampur dengan RNA. High salt method efektif untuk menghilangkan RNA tanpa bantuan RNAse karena rasio OD260/OD280 tidak melebihi dua. DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 lebih dari dua (Khosravinia et al., 2007). Tidak perlunya penggunaan RNAse pada high salt method dapat meringankan biaya yang dikeluarkan untuk keperluan penelitian karena harga RNAse sangat mahal.