3 BAHAN DAN METODE
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Isolasi dan Karakterisasi Larvasida dalam Minyak Bij
Penentuan kandungan proksimat biji kamandrah masing-masing dianalisis dengan metode AOAC 934.01; 988.05; 920.05 dan 962.09 (AOAC 2000), berturut-turut untuk kadar air, protein, lemak, serat kasar, abu dan karbohidrat (by different) (Lampiran 1).
3.3.1.2. Penentuan efikasi larvasida dan sifat fisiko-kimia minyak kamandrah pada berbagai tingkat kematangan buah kamandrah
Buah kamandrah yang digunakan pada penelitian ini dipanen dari AWWI Balittri Sukabumi berdasarkan tingkat kematangan buah. Pemetikan buah didasarkan atas umur buah, dihitung dari hari setelah pembungaan (HSP) buah dan ragam warna kulit luar buah kamandrah yaitu W1 = umur buah 24 HSP (warna kulit buah hijau kecoklatan); W2 = umur buah 33 HSP (warna kulit buah coklat kehijauan); dan W3 = umur buah 42 HSP (warna kulit buah coklat penuh).
Buah kamandrah disortir untuk memisahkan buah yang baik dan yang rusak. Buah dikeringkan dibawah sinar matahari selama 3 hari sampai kulit luar kering, selanjutnya dikupas. Biji kamandrah disortasi kembali untuk memisahkan antara biji yang baik dan biji yang rusak. Biji dikeringkan pada suhu 50oC selama 3 jam, selanjutnya digiling menggunakan hammer mill sebanyak 2 kali agar ukurannya lebih kecil (lolos 40 mesh). Setiap kali proses ekstraksi minyak kamandrah dengan pengempaan digunakan 200g biji kamandrah yang telah dihaluskan. Biji ditimbang dan dimasukan dalam alat pengempa yang memiliki alat pemanas pada landasan tekan. Ekstraksi dilakukan dengan menekan tuas hidrolik secara berulang-ulang sampai dicapai tekanan piston yang diinginkan yaitu 10,54 MPa dan dibiarkan pada suhu pemanasan 65OC selama 15 menit. Bersamaan dengan penekanan, minyak akan keluar disela-sela plat pemanas. Selanjutnya minyak ditampung menggunakan gelas piala. Pengempaan diulang 3 kali dengan cara yang sama. Minyak disaring menggunakan kertas saring, hasil minyak pada setiap pengempaan dicampur dan ditimbang untuk mengetahui rendemen minyaknya. Minyak kamandrah yang dihasilkan dianalisis dengan uji larvasida dan sifat fisiko-kimianya (Lampiran 2 dan 3).
3.3.1.3. Identifikasi Asam Lemak Minyak Kamandrah Dengan Gas Chromatography (GC)
Komponen asam lemak yang terkandung dalam minyak kamandrah diidentifikasi menggunakan GC. Proses analisis dilakukan sebagai berikut : Sampel (minyak) ditimbang 0,2 g dalam tabung reaksi tertutup, kemudian ditambahkan 2 ml natrium hidroksida dalam metanol, dipanaskan pada suhu 80oC selama 20 menit, kemudian diangkat dan dibiarkan dingin. Selanjutnya ditambahkan 2 ml larutan boron trifluorida 20% dan dipanaskan kembali selama 20 menit, kemudian diangkat, dibiarkan dingin dan ditambahkan 2 ml natrium klorida jenuh serta 2 ml larutan heksan. Setelah itu campuran dikocok sampai merata, lalu lapisan heksannya diambil dan dimasukkan ke tabung uji (evendop).
Kondisi alat kromatografi gas yang digunakan untuk analisis asam lemak adalah:
Jenis alat (GC) : Hitachi 263-50
Detektor : Detektor ionisasi nyala (FID) Jenis kolom : DEGS
Laju alir nitrogen : 1 kgf/cm2 Laju alir hidrogen : 0,5 kgf/cm2 Suhu awal : 150oC Suhu akhir : 180oC Suhu injektor : 200oC Suhu detektor : 250oC Volume injek : 2 µl
Hasil preparasi kemudian diinjeksikan ke alat kromatografi gas ketika suhu menunjukkan 150oC. Tombol start pada rekorder dan alat ditekan, dan hasilnya akan keluar berupa kromatogram. Selanjutnya dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif. Berdasarkan kromatogram yang diperoleh, kemudian pencocokan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi asam lemak standar. Kadar asam lemak dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Lc Cs x V Kadar asam lemak (%) = x
Ls b Keterangan: Lc = luas area contoh
Ls = luas area standar Cs = konsentrasi standar V = volume akhir b = bobot contoh
3.3.1.4. Identifikasi Senyawa Aktif Minyak kamandrah dengan Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)
GC-MS digunakan untuk identifikasi senyawa aktif dari komponen mudah menguap serta mendapatkan bobot molekul dan pola fragmentasi dari senyawa yang terdapat pada minyak kamandrah. Sampel yang dianalisis disuntikan pada GC-MS sejumlah 1 µl dengan kondisi operasi yang telah disesuaikan, seperti disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5. Kondisi dan spesifikasi operasi alat GC-MS
Kondisi GC Metode I Metode II Metode III
Kolom Kolom kapiler (Agilent 19091J-433 tipe HP-5 dengan diameter 0,25 mm, panjang 30 m dan lebar 0,25 µm)
Kolom kapiler (Agilent 1520.51616 tipe DB-1 dengan diameter 250 µm, panjang 60 m dan lebar 0,25 µm)
Kolom kapiler (Agilent 1520.51616 tipe DB-1 dengan diameter 250 µm, panjang 60 m dan lebar 0,25 µm)
Detektor MS MS MS
Gas pembawa Helium Helium Helium
Teknik injeksi Split (1:40) Splitness Splitness Waktu injeksi 0 menit 0,5 menit 0,5 menit
Suhu injektor 150oC 50oC 50oC
Suhu detektor 250oC 250oC 250oC
Suhu awal 70 oC 70 oC 70 oC
Inlet Mode split Suhu 300oC
Kecepatan : 38,2 ml/min Total aliran : 42,2 ml/min Tekanan : 8,28 psi
Mode Splitness Suhu 250 oC
Kecepatan : 3 ml/menit Total aliran : 7 ml/min Tekanan : 16,090 psi
Mode Splitness Suhu 250 oC
Kecepatan : 3 ml/menit Total aliran : 7 ml/min Tekanan : 16,090 psi Oven Suhu awal : 70oC
Suhu akhir : 60oC Suhu maksimum : 330oC
Waktu operasi : 39,67 min
Suhu awal : 70oC Suhu akhir : 60oC Suhu maksimum : 330oC
Waktu operasi : 58 min
Suhu awal : 70oC Suhu akhir : 60oC Suhu maksimum : 330oC
Waktu operasi : 54,5 min Laju kenaikan suhu 15oC/menit hingga mencapai 290oC ditahan selama 25 menit Mencapai suhu 50oC selama 0 menit Mencapai suhu 50oC selama 0 menit Suhu pertengahan
5oC/menit hingga suhu mencapai 250oC ditahan selama 15 menit
4oC/menit hingga suhu mencapai 180oC selama 0 menit
Laju kenaikan suhu akhir
10oC/menit hingga suhu mencapai 250oC ditahan
selama 15 menit Kondisi MS
Solvent delay 3 menit 11 menit 11 menit
EMV Mode False Relative Relative
EM Voltage 2282 1824 1824 Scanparameter - Massa rendah - Ambang - Massa tinggi 35 150 800 40 150 500 40 150 500 MS Zones : MS Source MS Quad 150-200oC 250-300 oC 150-200oC 230-250 oC 150-200oC 230-250 oC
Interpretasi spekta massa dilakukan dengan bantuan komputer untuk membandingkan pola spektra massa suatu senyawa dengan pola spektra massa pada mass spectra library koleksi National InstituteStandar and Tecnology (NIST) yaitu NIST yang memiliki koleksi pola spektra massa lebih dari 62.000 pola. Selain itu dibandingkan juga dengan database Wiley, dan Pest.1. Interpretasi juga dilakukan secara manual yaitu dengan membandingkan pola spektra massa komponen pada sampel dengan yang terdapat pada jurnal atau buku (publikasi).
3.3.1.5. Identifikasi Gugus Fungsional Minyak kamandrah dengan Spektofotometer Fourier Transform Infra Red (FTIR)
Spektrofotometer FTIR berfungsi untuk mengukur serapan radiasi inframerah pada berbagai panjang gelombang. Ditimbang 1 mg sampel dan digerus dengan 100 mg kalium bromida (KBr) kering sampai homogen. Kemudian di tekan hingga berbentuk pelet yang transparan, dimasukkan ke dalam sel dan di ukur serapannya dengan spektrometer FTIR pada bilangan gelombang 4000-500 cm-1.