Perhitungan kadar karbohidrat di lakukan dengan cara by difference, yaitu pengurangan dari total kandungan gizi dengan presentase kadar lemak, kadar protein, kadar air, dan kadar abu. Perhitungan rumus kadar karbohidrat (by difference) sebagai berikut:
Kadar karbohidrat (%) = 100% - (% kadar lemak + % kadar air + % kadar protein + % kadar abu)
3.3.4 Pengujian profil total mineral (Reitz et al. 1987)
Prinsip pengujian total mineral yaitu mengetahui nilai absorpsi logam dengan menggunakan metode (AAS). Sebanyak 10 gram sampel daging kerang darah yang sudah dicacah dimasukkan ke dalam erlenmeyer ukuran 125 ml kemudian ditambahkan 5 ml HNO3, didiamkan selama 1 jam pada suhu ruang di ruang asam. Selanjutnya dipanaskan diatas hot plate dengan suhu 120 oC selama 4 jam. Penambahan asam nitrat ini bertujuan untuk melarutkan kandungan anorganik. Sampel dibiarkan selama semalam dalam keadaan tertutup. Setelah dingin sebanyak 0,4 ml H2SO4 ditambahkan ke dalam erlenmeyer yang bertujuan untuk menguapkan kandungan organik pada sampel, lalu dipanaskan diatas hot plate sampai larutan berkurang atau lebih pekat, biasanya ±1 jam. Sebanyak 2-3 tetes larutan campuran HClO4: HNO3 dengan perbandingan 2:1 kemudian
ditambahkan ke dalam sampel. Sampel masih tetap diatas hot plate, karena pemanasan terus dilanjutkan sampai ada perubahan warna dari coklat menjadi kuning tua lalu berubah lagi menjadi kuning muda, biasanya memakan waktu ±1 jam. Sampel kemudian dipindahkan, didinginkan, dan ditambahkan 2 ml akuades dan 0,6 ml HCl. Sampel dipanaskan kembali selama ±15 menit agar larut, kemudian dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml. Apabila ada endapan disaring dengan kertas Whatman no.42 sampai didapatkan larutan yang jernih.
Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merk Shimadzu 7000 dengan panjang gelombang dari masing-masing jenis mineral, kemudian diukur absorbansi atau tinggi puncak standar, blanko, dan contoh pada panjang gelombang dan parameter yang sesuai untuk masing-masing mineral. Perhitungan kadar mineral dalam sampel dihitung dengan rumus sebagai berikut.
kadar mineral ( g basis basah) =
Keterangan : fp = faktor pengenceran w = bobot sampel
3.3.5 Pengujian kelarutan mineral (Santoso et al. 2006)
Sebanyak 20 gram sampel yang sudah dicacah ditambahkan dengan akuades, asam asetat 2,5%, asam sitrat 2,5%, dan asam format 2,5% yang sudah diukur nilai pH nya terlebih dahulu. Sampel kemudian direndam selama 30 menit menggunakan stirrer pada kecepatan 5000 rpm untuk menghasilkan fraksi terlarut. Setelah proses perendaman selesai, dilakukan proses pengukuran pH akhir. Sampel selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 9000 rpm, suhu 2 ºC selama 10 menit. Hasil yang didapatkan disaring dengan kertas Whatman no.42, dan diambil supernatannya untuk dilanjutkan proses analisis mineral terlarut 21
dengan menggunakan alat (AAS) merk Shimadzu 7000 dengan panjang gelombang yang sesuai dengan masing-masing jenis mineral.
3.3.6 Pengujian kelarutan protein (Apriyantono et al. 1989)
Pengujian kelarutan protein dilakukan menggunakan supernatan yang dihasilkan setelah proses sentrifugasi dengan metode Lowry. Metode ini memiliki prinsip adanya reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan (merupakan residu protein) akan mengahsilkan warna biru. Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat, oleh karena itu warna yang terbentuk tegantung pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein. Metode Lowry mempunyai keuntungan karena 100 kali lebih sensitif dari metode Biuret.
Cara kerja uji kelarutan protein dilakukan dengan membuat larutan standar
bovine serum albumin sebanyak 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 ml di dalam tabung reaksi. Akuades ditambahkan ke dalam masing-masing tabung sampai volume total 4 ml. Untuk mengetahui nilai kelarutan protein yang dihasilkan pada penelitian, supernatan yang dihasilkan pada proses sebelumnya disiapkan sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan akuades hingga volumenya 4 ml. Kedalam masing-masing tabung reaksi ditambahkan pereaksi yang terdiri dari natrium karbonat 2% dalam larutan NaOH 0,1 N dan tembaga sulfat 0,5% dalam larutan NaK tartarat 1% sebanyak 5,5 ml. Larutan dicampur merata dan dibiarkan selama 10-15 menit pada suhu kamar. Pereaksi Folin Ciocalteau selanjutnya ditambahkan ke dalam masing-masing tabung reaksi sebanyak 0,5 ml, dan kocok merata dengan cepat menggunakan vortex. Larutan dibiarkan selama 30 menit hingga warna biru terbentuk. Larutan standar dan contoh lalu dialirkan ke dalam Spektrofotometer UV-VIS merek LW UV-200-RS dengan panjang gelombang 650 nm kemudian diukur absorbansi yang dihasilkan.
3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh perendaman asam terhadap kelarutan mineral dan protein adalah metode rancangan acak lengkap (RAL) dengan satu faktor dan 4 taraf (perendaman akuades, perendaman
asam asetat, perendaman asam sitrat, dan perendaman asam format). Semua perlakuan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Data dianalisis dengan Analysis Of Variance (ANOVA) atau uji F. Model rancangan analisis ANOVA atau uji F adalah sebagai berikut:
Y
ij = μ + τi+ εij
Keterangan :Yij = Nilai pengamatan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j (j=1,2)
μ
= Nilai tengah atau rataan umum pengamatanτi
= Pengaruh metode pengolahan pada taraf ke-i (i=1,2,3)εij
= Galat atau sisa pengamatan taraf ke-i dengan ulangan ke-jHipotesis terhadap data hasil kelarutan mineral akibat proses perendaman pada berbagai jenis asam organik adalah sebagai berikut:
H0= Metode perendaman asam organik tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan mineral.
H1= Metode perendaman asam organik memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan mineral.
Hipotesis terhadap data hasil kelarutan logam berat akibat proses perendaman pada berbagai jenis asam organik adalah sebagai berikut:
H0= Metode perendaman asam organik tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan logam berat.
H1= Metode perendaman asam organik memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan logam berat
.
Hipotesis terhadap data hasil kelarutan protein akibat proses perendaman pada berbagai jenis asam organik adalah sebagai berikut:
H0= Metode perendaman asam organik tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan protein.
H1= Metode perendaman asam organik memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan protein.
Jika uji F pada ANOVA memberikan pengaruh yang berbeda terhadap kelarutan mineral dan protein maka dilanjutkan dengan uji Duncan, dengan rumus sebagai berikut:
Duncan = tα/2; dbs Keterangan :
KTS = Kuadrat tengah sisa dbs = Derajat bebas sisa r = Banyaknya ulangan