BAHAN DAN METODE
B. Uji In vivo Ekstrak Metanol Daun Cengkeh pada Kelinci Pemeliharaan Hewan Uji
II. Kapasitas Antioksidatif Ekstrak Daun Cengkeh pada Jaringan Hati dan Ginjal Kelinci
II.1 Kadar Malondialdehid (MDA).
Prinsip metode ini berdasarkan kemampuan pembentukan komplek s berwarna merah jambu antara MDA dan asam tiobarbiturat (TBA) (Capeyron et al. 2002). Adapun persiapan sampel adalah sebanyak 1.25 gram hati dan ginjal kelinci yang telah disimpan dalam freezer -20oC, dicairkan terlebih dahulu sebelum dilakukan analisis pada suhu ruang. Hati dan ginjal dimasukkan ke dalam gelas piala, dicacah dengan siring yang telah dilepas jarumnya (dicacah dalam kondisi dingin), dengan ditambahkan 2.5 ml buffer fosfat yang mengandung 11.5 g/L kalium klorida dalam kondisi dingin pH 7.4 (disimpan pada suhu 5oC). Campuran ini disentrifus 4000 rpm 10 menit, diambil supernatan keruh dan disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit, sebanyak 1 ml supernatan jernih diambil dan ditambahkan 4 ml campuran larutan asam klorida dingin 0.25 N (2.23 ml asam klorida pekat/100 ml) yang mengandung 15% asam trikloroasetat (w/v); 0.38% asam tiobarbiturat dan 0.5% butilat hidroksitoluen. Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut dipanaskan dalam inkubator pada suhu 80oC selama 1 jam, selanjutnya didinginkan dengan air mengalir dan disentrifus 3500 rpm 10 menit. Supernatan hasil sentrifus tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 532 nm.
MDA (µmol/g protein) = A (µmol/g 50µL x 7.5 ml 1.25 g (bb)
A = Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva standar
II.2 Aktivitas Enzim Antioksidan Superoksida dismutase (SOD).
Aktivitas SOD diuji berdasarkan laju penghambatan reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh xantin/xantin oksidase. Terjadi oksidasi xantin menjadi asam urat dan anion superoksida yang terbentuk selanjutnya mereduksi ferris itokrom c. Reduksi ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang gelombang 550 nm.
Persiapan Larutan Standar. Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD murni (komersial) menjadi beberapa konsentrasi larutan, yaitu 0, 50, 100, 250, 300, dan 500 unit/H2O dan digunakan untuk membuat kurva baku/standar.
Persiapan Sampel. Potongan hati dan ginjal yang masih segar dianalisis dengan cara dihaluskan terlebih dahulu dengan menggunakan blender, kemudian ditambahkan buffer fosfat pH 7.4 dengan perbandingan tidak lebih dari 1: 0.5. Campuran ini kemudian disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit dan diambil supernatannya. Supernatan hati dan ginjal dengan segera disimpan pada suhu -20oC untuk dianalisis. Sebanyak 400 µl larutan kloroform/etano l dingin 37.5/62.5 (v/v) ditambahkan ke dalam 150 µl supernatan hati dan ginjal. Kemudian divorteks selama 3 detik dan disentrifuse pada kecepatan 4400 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Selanjutnya , supernatan disimpan pada suhu 2-8oC sampai saat akan dianalisis.
Prosedur Pengukuran Aktivitas SOD. Larutan yang dipersiapkan adalah buffer fosfat 50 mM yang mengandung EDTA 0,1 mM pH 7.8 (balanko), larutan xantin, dengan melarutkan xantin 0.76 mg ke dalam 10 ml 0.001 M NaOH kemudian ditambahkan 100 ml larutan sitokrom c ke dalamnya dan larutan xantin oksidase, dengan melarutkan xantin oksidase ke dalam buffer fosfat mengandung EDTA pH 7.8 dengan aktivitas 0.2 U/ml, dan disimpan pada suhu 4oC. Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25oC, larutan xantin oksidase harus tetap dalam
keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit) sebelum digunakan. Pengukuran akitivitas SOD dilakukan dengan cara memasukkan 2.9 ml larutan campuran larutan xantin dan larutan sitokrom c ke dalam tabung reaksi 3 ml. Selanjutnya ditambahkan 50 µl larutan sampel atau larutan kontrol (air destilasi) dan divorteks secara perlahan. Setelah itu, ditambahkan 50 µl larutan xantin oksidase dan divorteks secara perlahan. Untuk blanko digunakan buffer fosfat sebagai pengganti sampel. Perubahan absorbans yang terjadi diamati pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. (Rice-Evans & Anthony 1991). Pereaksi untuk analisis SOD dapat dilihat pada Lampiran 4 dan kurva standar SOD pada Lampiran 5.
Aktivitas (U/gram) = A (U/ml) x 0.67 ml 0.5 gram (bb) A= aktivitas yang diperoleh dari persamaan regresi
Persiapan sampel untuk analisis Katalase dan GPX.
Sebanyak 0.5 gram hati dan ginjal kelinci dihaluskan dan ditambahkan 1 ml larutan buffer fosfat dengan pH 7.4. Selanjutnya disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Kemudian, supernatan diambil dan disimpan dalam freezer pada suhu -20oC untuk kemudian digunakan dalam analisis enzim antioksidan (katalase dan glutation peroksidase).
Aktivitas Katalase
Prinsip metode yang dikembangkan oleh Sinha ini menggunakan zat warna sebagai indikator. Zat warna yang digunakan adalah potassium bikromat K2Cr2O7 5% dalam suasana asam asetat glasia (1:3). Ion bikromat, dalam suasana asam akan direduksi oleh H2O2 menjadi kromat yang memberikan warna pada panjang gelombang 570 nm. Satu unit aktivitas katalase dinyatakan sebagai banyaknya H2O2 dalam mol yang dapat digunakan oleh katalase permenit.
Cr+6 + H2O2 H+ Cr+3 + H2O + O2
Ekstraksi Sampel. Sebanyak 1 ml homogenat hati dan ginjal ditambahkan dengan 0,5 ml Triton X – 100 0.1%, kemudian disentrifus dengan kecepatan 4.000
rpm selama 5 menit pada suhu dingin. Selanjutnya, diambil supernatannya dan digunakan dalam mengukur aktivitas katalase.
Pengukuran aktivitas katalase. Sebanyak 1 ml sampel (supernatan) ditambahkan dengan 5 ml buffer fosfat 0,05 M pH 7.0 sambil divorteks. Selanjutnya, campuran ditambahkan 4 ml H2O2 0.2 M dan d iinkubasi selama 60 detik. Sebanyak 1 ml campuran larutan ditambahkan 2 ml lautan warna kalium bikromat, kemudian dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, serapan diukur pada panjang gelombang 570 nm (Lampiran 6)
Kurva standar dan perhitungan aktivitas katalase. Kurva standar dibuat dari larutan H2O2 30% menjadi larutan standar H2O2 pada konsentrasi 0.00, 0.04, 0.08, 12.00, 0.16 dan 0.20 M. Sebanyak 1 ml larutan standar H2O2 ditambahkan dengan 2 ml larutan bikromat 5% dan dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit. Setelah didinginkan, serapannya dibaca pada panjang gelombang 570 nm. Absorban pada sumbu y dan konsentrasi H2O2 pada sumbu x. Jumlah H2O2 yang dipakai katalase = 0.2 M – konsentrasi H2O2 terbaca. Pembuatan kurva standar H2O2 disajikan pada Lampiran 7.
Katalase (U/gram protein ) = A (U/ml x 1.14 ml 0.5 g (bb)
A = Konsentrasi katalase yang diperoleh dari persamaan regresi kurva standar
Aktivitas Glutation peroksidase (GPx)
Prinsip metode ini adalah glutation peroksidase mengkatalis glutation tereduksi menjadi glutation teoksidasi (Pigeolet et al. 1990). Glutation teroksidasi direduksi kembali menjadi glutation tereduksi oleh enzim glutation reduktase dengan kofaktor NADP dalam suasana asam. Jumlah glutation tereduksi diukur dengan menentukan jumlah mikromol NADPH sebagai pereduksi (Lampiran 8).
Persiapan sampel. 100 µl homogenat hati dan ginjal ditambah dengan 200 µl buffer fosfat pH 7.0 dan divortek s. Larutan disentrifuse pada 3.000 rpm selama 5 menit dalam kondisi dingin. Selanjutnya, diambil supernatannya dan digunakan dalam mengukur aktivitas glutation peroksidase (GSH-Px).
Pengukuran aktivitas glutation peroksidase. Sebanyak 200 µl buffer fosfat 0.1 M pH 7.0 mengandung 0.1 mM EDTA ditambahkan dengan 200 µl sampel, 200
µl glutation tereduksi (GSH) 10 mM, dan 200 µl enzim glutation reduktase 2.4 unit, selanjutnya diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37°C. Larutan yang telah diinkubasi ditambahkan 200 µl NADPH 1.5 mM, dan kemudian larutan tersebut diinkubasi lagi pada suhu yang sama selama 3 menit. Setelah diinkubasi, ditambahkan 200 µl H2O2 1.5 mM ke dalam larutan. Selanjutnya, serapan larutan dibaca di antara waktu 1-2 menit pada panjang gelombang 340 nm.
Perhitungan untuk mendapatkan mU GSH-Px
mUnit GSH-Px = ? abs x Vt x 2 x 1000 x 1 6.22 x Vs mg protein
? abs = perubahan absorban Vt = volume total dalam ml Vs = volume sampel dalam ml
6,22 = koefisien ekstensik dari NADPH
2 = 2 mol GSH yang setara dengan untuk mengoksidasi 1 mol NADPH 1000 = perubahan menjadi milliunit
III. Kandungan Antioksidan Cu,Zn-S OD pada Jaringan Hati dan Ginjal Secara