Penelitian mengenai kekerabatan tanaman pasak bumi dilaksanakan di Laboratorium Genetika, Departemen Silvikultur Fakultas Kehutanan IPB, sedangkan untuk dokumentasi hasil PCR dilaksanakan di Laboratorium Biorin, PAU IPB. Waktu Penelitian selama 5 bulan (Nopember 2007-Maret 2008). Alat dan bahan
Untuk analisis keragaman genetik tanaman pasak bumi alat yang digunakan adalah tube, gelas piala, gelas ukur, sarung tangan, UV transiluminator, kamera digital, mortar dan pestel, hotplate, stirer, neraca analitik, vortex dan
Peltier Thermal Cycler, pipet, freezer dan sentrifuse.
Bahan tanaman yang digunakan adalah sampel daun pasak bumi asal Jambi sebanyak 20 buah hasil perbanyakan generatif yang berumur 7 bulan. Sedangkan bahan kimia yang digunakan adalah buffer TE, PVP (polyvinylpyrrolidone) 2%, agarose, ethidium bromida (EtBr), buffer ekstrak, CTAB, cloroform IAA, pheol, propanol, NaCl, etanol 100%, green go Taq dan primer.
Metode Penelitian
Metode analisis DNA dengan RAPD dibagi menjadi tiga tahapan yaitu ekstraksi, RAPD dan analisis data. Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada Gambar 7.
Pengambilan sampel daun Ekstraksi dan isolasi DNA
Seleksi primer PCR RAPD
Interpretasi dan analisis data
Popgene versi 3.2 NTSYS
Ekstraksi dan isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Milligan 1989) yang meliputi beberapa kegiatan yaitu: ekstraksi, pemurnian dan presipitasi.
Pada kegiatan ekstrasi sampel daun digerus dalam pestel dengan penambahan larutan buffer ekstraksi sebanyak 300-500 µl dan larutan PVP 2% sebanyak 100 µl sampai berbentuk serbuk. Hasil gerusan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung plastik steril yang kemudian diisi dengan buffer
pengekstrak CTAB dengan komposisi seperti Tabel 5, sebanyak 500 µl dan 100 µl PVP 2%. Tabung kemudian ditutup rapat, kemudian buffer dan sampel dikocok lalu diinkubasi dalam water bath selama 45 menit – 1 jam pada suhu 65 0C. Setiap 15 menit sekali tabung-tabung tersebut diangkat dari water bath untuk dikocok perlahan-lahan.
Tabel 5 Komposisi bahan untuk ekstraksi DNA
No. Nama Bahan 1 sampel reaksi X sample reaksi 1. Tris-HCl 1 M 100 mikro liter X x 100 mikro liter 2. NaCl 5 M 280 mikro liter X x 280 mikro liter 3. EDTA 0.5 M 40 mikro liter X x 40 mikro liter 4. CTAB 10% 200 mikro liter X x 200 mikro liter 5. Merkapetanol 5 mikro liter X x 5 mikro liter 6. PVP 1% 100 mikro liter X x 100 mikro liter 7. Akuades 280 mikro liter X x 280 mikro liter
Setelah inkubasi selesai, tabung diangkat dan didinginkan pada suhu ruang selam 15 menit dan dicuci dengan menambahkan 500 µl Cloroform IAA dan phenol 10 µl, campuran digoyang perlahan dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dipindahkan ke tabung baru dengan penambahan kembali 500 µl Cloroform IAA dan phenol 10 µl dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 2 menit.
Tahap presipitasi adalah memindahkan supernatan hasil pemurnian ke tabung steril baru kemudian ditambahkan isopropanol dingin dan NaCl masing- masing sebanyak 500 µl dan 300 µl, dikocok kemudian disimpan pada freezer
selama 60 menit. Setelah itu dilakukan sentrifugasi kembali selama 2 menit , dan cairan dalam tube dibuang sehinga yang tertinggal adalah pellet DNA. Ditambah etanol 100% sebanyak 300 µl, kemudian disentrifugasi kembali dan cairan tesebut dibuang, selanjutnya ditambahkan etanol lagi dan disentrifugasi. Setelah proses
24
selesai kemudian dikeringanginkan dalam desikator selama 15 menit. Tambahkan TE 20 µl kemudian dicampur dan disentrifugasi kembali.
Uji kualitas DNA
Untuk uji kualitas DNA, selama proses pengeringan pellet DNA disiapkan agarose 1% (0,33 gram agarose dalam 33 ml TAE). Untuk proses elektroforesis ditambahkan TE 20 µl pada pellet DNA lalu sentrifugasi, diambil 3 µl DNA ditambahkan 2 µl BJ (blue Juice) 10x dan running/elektroforesis pada tegangan 100 volt selama ± 24 menit. Hasil elektroforesis kemudian direndam dalam larutan etidium bromide (EtBr) 10 µl per 200 ml aquades selama 5-10 menit dan selanjutnya dilihat pada UV transiluminator dan didokumentasikan dengan menggunakan foto gel.
Seleksi primer
Pada kegiatan seleksi primer, dilakukan seleksi terhadap 28 primer secara
random yaitu primer golongan OPO dan OPY yang diproduksi oleh Operon Technology. Selanjutnya dari 28 primer tersebut dipilih 5 primer yang menghasilkan fragmen DNA polimofik. Urutan basa nukleotida dari 28 primer produksi Operon Technology yang digunakan, disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6 Urutan basa nukleotida 28 primer (Operon Technology) No. Primer Urutan Basa No. Primer Urutan Basa
1 OPO-05 5' CCCAGTCACT '3 1 OPY-10 5' CAAACGTGGG '3 2 OPO-06 5' CCACGGGAAG '3 2 OPY-11 5' AGACGATGGG '3 3 OPO-07 5' CAGCACTGAC '3 3 OPY-12 5' AAGCCTGCGA '3 4 OPO-08 5′ CCTCCAGTGT '3 4 OPY-13 5' CACAGCGACA '3 5 OPO-11 5' GACAGGAGGT '3 5 OPY-14 5' GGTCGATCTG '3 6 OPO-13 5' GTCAGAGTCC '3 6 OPY-15 5' AGTCGCCCTT '3 7 OPO-14 5' AGCATGGCTC '3 7 OPY-16 5' GGGCCAATGT '3 8 OPO-16 5' TCGGCGGTTC '3 8 OPY-17 5' GACGTGGTGA '3 9 OPY-01 5' GGTGGCATCT '3 9 OPY-18 5' GTGGAGTCAG '3 10 OPY-05 5' AGCCGTGGAA '3 10 OPY-19 5' TGAGGGTCCC '3 11 OPY-06 5' AAGGCTCACC '3 11 OPY-20 5' AGCCGTGGAA '3 12 OPY-7 5'AGAGGGGTGA '3 12 OPC 4 5' CCGCATCTAC '3 13 OPY-08 5' AGGCAGAGCA '3 13 OPC 5 5' GATGACCGCC '3 14 OPY-09 5' GTGACCGAGT '3 14 OPC 7 5' GTCCCGACGA '3
Untuk proses PCR, DNA hasil ekstraksi diambil masing-masing 1 µl dicampur menjadi satu kemudian diencerkan dengan 99 µl aquibides. Ambil
komponen campuran untuk reaksi PCR (green go Taq 7,5 µl, nuclease-free water
2,5 µl, DNA mix masing-masing 2 µl dan primer masing-masing 1,5 µl disentrifugasi selama 5-10 detik, kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR.
DNA hasil PCR kemudian dieletroforesis dengan menggunakan agarose 2% (0,30 g agarose, 15 ml TAE) pada tegangan 90 volt selama 24 menit, selanjutnya dilihat pada UV transiluminator. Primer yang menghasilkan pita atau jumlah amplifikasi yang terbanyak selanjutnya digunakan untuk amplifikasi DNA dari 20 sampel yang diuji.
Amplifikasi dengan PCR (Polimerase Chain Reaction)
Sebelum melakukan amplifikasi PCR, DNA hasil ekstraksi diencerkan dengan aquabides. Perbandingan antara DNA dengan aquabides tergantung pada resolusi pita genomik hasil ekstrasi (misalnya pengenceran 100x artinya 99 µl aquabides dan 1 µl DNA hasil ekstrasi).
Proses amplifikasi dilakukan dengan metode RAPD menggunakan mesin PCR MJ Research PTC-100. Untuk proses ampifikasi DNA dengan PCR terdapat empat komponen yang digunakan antara lain green go Taq, DNA sampel dari bibit tanaman, primer dan aquaidest. Komposisi bahan untuk PCR disajikan pada Tabel 7.
Tabel 7 Komposisi bahan untuk reaksi PCR
No. Nama Bahan 1 sampel reaksi X sample reaksi 1 H2O 2 mikro liter X x 2 mikro liter
2 green go Tag 7.5 mikro liter X x 7.5 mikro liter 3 Primer 1.5 mikro liter X x 1.5 mikro liter 4 Cetakan DNA 2 mikro liter X x 2 mikro liter
DNA hasil PCR dielektroforesis dengan menggunakan konsentrasi agarose 2% (0,66 gram agarose dan 33 ml TAE), di running pada tegangan 90 volt selama 24 menit, kemudian direndam dalam larutan etidium bromide 10 µl per 200 ml aquades selama 5-10 menit. Visualisasi fragmen DNA dilakukan pada
UV transiluminator. Seragam tidaknya DNA diamati dari pita yang dihasilkan. Selanjutnya hasil running tersebut didokumentasikan dengan menggunakan Foto gel. Pengaturan suhu pada mesin PCR MJ Research PTC-100 disajikan pada Tabel 8.
26
Tabel 8 Pengaturan suhu dalam beberapa tahapan dalam proses PCR Tahapan Suhu (oC) Waktu (menit) Jumlah siklus
Pre denaturasi 95 2 1 Denaturasi Annealing Extension 95 37 72 1 2 2 45 Final Extension 72 10 1 Analisis hasil PCR
Berdasarkan foto DNA kemudian dilakukan scoring dan diterjemahkan dalam data biner berdasarkan ada tidaknya pita dengan ketentuan nilai 0 (nol) untuk tidak ada pita dan nilai 1 (satu) untuk adanya pita pada suatu posisi yang sama dari setiap individu yang dibandingkan (Gambar 10). Data yang diperoleh, diolah dengan menggunakan software Popgene versi 3.2.
Lokus Individu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1 L-2 Individu Lokus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 L-2 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1
Gambar 8 Cara penilaian pita dengan sistem skoring (1 = ada pita, 0 = tidak ada pita).
Variabel genetik yang diukur pada studi kekerabatan genetik pasak bumi adalah:
1. Persentase pita DNA polimorfik 2. Keragaman (He)
