Penyebaran dan Habitat
MATERI DAN METODE PENELITIAN
Pendekatan Populasi Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian lapangan dilakukan pada bulan Februari sampai dengan Mei tahun 2005. Survei dan koleksi data populasi dilakukan pada dua populasi lokal monyet ekor panjang di Kawasan Jawa Timur yaitu Pura Giri Sloka Alas Purwo (PgsAP) dan Bama Baluran (BmBL); enam populasi lokal di Pulau Bali yaitu Pura Pulaki (PrPL), Alas Kedaton (AK), Pura Uluwatu (PrUW), Sangeh (SG), Wanara Wana Ubud (WwUB), dan Pura Bukit Gumang (PrBG); serta dua populasi lokal di Pulau Lombok yaitu Gunung Pusuk (PS) dan Pura Gunung Pensong (PrGP) (Gambar 2). Alasan utama pemilihan populasi lokal tersebut adalah anggota populasi sudah terhabituasi dengan baik sehingga peluang ditangkap cukup besar untuk keperluan pencuplikan darah. Selain itu, pencuplikan dilakukan pada populasi lokal antar pulau yang berdekatan untuk melihat pola penyebaran keragaman genetik dari barat ke timur (Gambar 2).
Gambar 2 Populasi lokal monyet ekor panjang yang diteliti untuk struktur populasi dan fenotipe kualitatif. ?: lokasi populasi lokal.
Koleksi dan Analisis Data
Data populasi dikoleksi melalui survei dan sensus di masing-masing populasi lokal. Survei dan sensus dilakukan bersamaan dengan pengambilan data lainnya (fenotipe kualitatif dan contoh darah). Koleksi data diawali dengan identifikasi jumlah kelompok sosial berdasarkan pada informasi petugas jaga
19 yang kemudian dikonfirmasi dengan pengamatan pendahuluan. Setelah penentuan kelompok sosial, penghitungan anggota masing-masing kelompok sosial dilakukan secara langsung. Anggota populasi dikelompokkan menjadi empat yaitu jantan dewasa, betina dewasa, muda, dan anakan. Monyet jantan ditandai oleh wajah dengan cambang kurang lebat, berkumis, bantalan duduk kiri dan kanan menyatu, dan adanya skrotum (tetes). Monyet jantan dikelompokkan ke jantan dewasa apabila badannya besar, taringnya panjang, dan tingkah lakunya relatif superior. Monyet betina ditandai oleh wajah dengan cambang yang lebat, berjenggot, bantalan duduk kiri dan kanan terpisah, dan adanya vulva vagina. Monyet betina dikelompokkan menjadi betina dewasa apabila ambing dan puting susunya sudah menggelantung (pendulus). Pada kelompok muda, jenis kelamin tidak dibedakan melainkan digabung menjadi satu karena kesulitan untuk membedakannya di lapangan. Monyet jantan yang badannya lebih kecil dan tingkah lakunya permisif terhadap jantan dewasa yang ada saat itu, dan betina yang belum menunjukkan puting susu menggelantung dikelompokkan sebagai monyet muda. Batas bawah umur monyet muda adalah berubahnya warna rambut hitam di kepala menjadi ke abu-abuan. Sementara, monyet baru lahir dan monyet yang masih memiliki warna hitam pada rambut kepala dikelompokkan sebagai anakan. Jumlah anggota masing-masing kelompok sosial, selanjutnya, digabung menjadi satu data populasi lokal. Penghitungan secara langsung bisa dimulai dari kelompok anakan atau jantan dewasa atau lainnya sesuai situasi dan kondisi. Luas habitat masing-masing populasi lokal juga dicatat, tetapi luasan tersebut tidak mencerminkan daerah jelajah populasi. Luas habitat didapatkan melalui dua cara yaitu diberikan oleh masyarakat atau pemerintah (data sekunder) dan pendekatan untuk populasi lokal Gunung Pusuk (PS), Pura Giri Sloka Alas Purwo (PgsAP), dan Bama Baluran (BmBL). Pada cara “pendekatan”, luas area dihitung dengan membuat segi empat panjang bayangan setelah panjang dan lebar area didapatkan. Panjang dan lebar area ditentukan atas dasar lokasi terluar kelompok sosial yang teramati saat pengamatan. Data lain, sebagai pelengkap, yang dikoleksi adalah pendapat masyarakat setempat mengenai keberadaan populasi lokal monyet ekor panjang. Data ini didapatkan melalui penyebaran kuesioner yang meliputi persetujuannya terhadap keberadaan populasi lokal
20 monyet di sekitar lingkungan mereka, pengamatannya terhadap keberadaan monyet di dalam habitat, pengetahuannya mengenai pemberian pakan tambahan dan penangkapan monyet.
Data yang telah dikoleksi pada masing-masing populasi lokal dianalisis mengenai jumlah kelompok sosial, struktur populasi, dan kepadatan (ekor/ha). Struktur populasi meliputi jumlah anggota populasi lokal, komposisi umur, rasio jantan dewasa dengan betina dewasa, ukuran populasi efektif (Ne), dan rasio ukuran populasi efektif dengan jumlah monyet dewasa sensus (N). Ukuran populasi efektif dihitung menggunakan rumus dari Nozawa et al. (1996). Data populasi dianalisis menggunakan program R Version 2.3.1 dan ditampilkan secara deskriptif.
21
Pendekatan Morfologi Eksternal (Fenotipe Kualitatif) Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian di lapangan dilakukan pada bulan Februari sampai dengan Mei 2005, bersamaan dengan pengambilan data populasi dan pencuplikan darah. Pengamatan fenotipe kualitatif monyet ekor panjang dilakukan pada populasi lokal yang sama dengan yang disurvei untuk data populasi. Populasi lokal tersebut adalah PgsAP dan BmBL di Kawasan Jawa Timur; PrPL, AK, PrUW, SG, WwUB, dan PrBG di Pulau Bali; PS dan PrGP di Pulau Lombok (Gambar 2).
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan untuk pengambilan data fenotipe kualitatif antara lain dengan teropong binokuler, kamera, kertas dan alat tulis.
Koleksi dan Analisis Data Fenotipe
Sebanyak 344 monyet ekor panjang dewasa dari sepuluh populasi lokal telah diambil data fenotipe kualitatifnya (Tabel 1). Pengamatan dilapangan menggunakan alat bantuan teropong untuk meyakinkan tipe karakter fenotipe pada pengamatan yang cukup jauh. Demikian juga, jika memungkinkan, karakter yang diamati difoto menggunakan kamera digital. Pengamatan fenotipe kualitatif monyet ekor panjang dilakukan setelah proses pencuplikan darah selesai. Pengamatan fenotipe kualitatif dikenakan pada monyet ekor panjang jantan yang dewasa (dalam beberapa kasus diamati juga yang subdewasa) dan betina dewasa. Pengenaan pengamatan fenotipe kualitatif hanya pada monyet jantan dan betina dewasa dimaksudkan untuk memperoleh informasi yang definitif terutama fenotipe warna rambut. Tujuh kelas fenotipe kualitatif yang diamati meliputi warna mahkota, warna rambut punggung, warna rambut paha lateral, warna kulit abdomen, cambang, jambul, dan pusaran kepala. Untuk kelas fenotipe cambang, pengamatan diarahkan pada dua tipe yaitu infrazigomatikus (rambut di depan telinga mengarah ke belakang sehingga menutupi telinga) dan transzigomatikus (rambut di depan telinga mengarah ke depan). Untuk kelas fenotipe jambul,
22 pengamatan difokuskan pada posisi (di kanan, di tengah, atau di kiri garis median kepala) dan kecondongannya (ke kiri, tegak, atau ke kanan). Sementara, untuk kelas fenotipe pusaran kepala, pengamatan ditujukan pada posisi (di kanan, di depan, atau di kiri jambulkepala) dan arah pusarannya (searah putaran jarum jam atau berlawanan arah jarum jam). Data fenotipe kualitatif yang berasal dari monyet jantan dan betina dewasa digabung dan dianalisis menggunakan software
R version 2.3.1 serta ditampilkan secara deskriptif. Analisis korespondensi berganda terhadap profil karakter fenotipe dilakukan untuk melihat perbedaan antar populasi lokal dan jenis kelamin. Analisis korespondensi berganda menggunakan program CORAN (Lebart et al. 1984) dan pemetaan koordinat pada bidang dua dimensi menggunakan software R version 2.3.1.
Tabel 1 Jumlah monyet ekor panjang dewasa yang diamati untuk data fenotipe kualitatif di masing-masing populasi lokal
Pulau/
kawasan Lokasi (populasi lokal) Kode
?
(ekor) ? (ekor) N (ekor)
Pura Giri Sloka Alas Purwo PgsAp 11 13 24 Jawa
Timur Bama Baluran BmBL 13 12 25 Pura Pulaki PrPL 18 26 44 Alas Kedaton AK 12 19 31 Pura Uluwatu PrUW 13 14 27 Sangeh SG 20 30 50 Wanara Wana Ubud WwUB 12 19 31 Bali
Bukit Gumang PrBG 20 9 29 Gunung Pusuk PS 21 20 41 Lombok
Pura Gunung Pengsong PrGP 17 15 32 Jumlah 334
23
Pendekatan Genetik (Mikrosatelit)
Waktu dan Lokasi Penelitian
Sejumlah 159 contoh darah monyet ekor panjang dari sepuluh populasi lokal berhasil dikoleksi. Pencuplikan contoh darah monyet ekor panjang dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan Mei 2005 bersamaan dengan pengambilan data populasi dan fenotipe kualitatif, kecuali pada lima populasi lokal di Pulau Bali, pencuplikannya dilakukan pada tahun 2000 dan telah tersedia dalam bentuk DNA (Tabel 2 dan Gambar 3). Analisis genetik dilakukan di Laboratorium Zoologi, Jurusan Biologi, FMIPA IPB, Gunung Gede pada bulan Juli 2005 sampai dengan Mei 2006.
Tabel 2 Jumlah contoh darah monyet ekor panjang pada masing-masing populasi lokasi
Pulau Lokasi (populasi lokal) Kode Jumlah (ekor) Pura Giri Sloka Alas Purwo PgsAp 15
Jawa Timur
Bama Baluran BmBL 14 Pura Pulaki PrPL 13 * Alas Kedaton AK 17 * Pura Uluwatu PrUW 16 * Sangeh SG 18 * Wanara Wana Ubud WwUB 13 * Bali
Bukit Gumang PrBG 20 Gunung Pusuk PS 17 Lombok
Pura Gunung Pengsong PrGP 16 Jumlah 159
Keterangan: * pencuplikan tahun 2000 dan telah tersimpan dalam bentuk DNA
Gambar 3 Lokasi pencuplikan darah monyet ekor panjang. ?: pencuplikan darah tahun 2005 dan ¦: pencuplikan darah tahun 2000.
24 Penyertaan contoh DNA tahun 2000 untuk analisis genetik pada penelitan saat ini tidak akan mengurangi kebermaknaan dari hasil penelitian. Frekuensi suatu alel berfluktuasi dari generasi ke generasi. Namun, perubahan frekuensi alel (alel netral) karena mutasi atau pengaruh faktor peluang dalam satu generasi sangat rendah (Li 1991; Perwitasari-Farajallah 1998). Frekuensi alel yang ditemukan dari contoh DNA populasi monyet tahun 2000 tidak akan berbeda secara nyata jika dibandingkan dengan hasil pencuplikan contoh pada populasi yang sama tahun 2005 (satu generasi monyet ekor panjang 5-7 tahun).
Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian antara lain alat suntik 10 ml, seperangkat alat tulup, tabung Eppendorf, pipet mikro, pipet Pasteur, alat pemusing, tabung mikro, tip, rak tabung mikro, boks es, seperangkat alat PCR, seperangkat alat elektroforesis, seperangkat alat visualisasi, seperangkat alat pewarnaan, dan timbangan elektrik.
Bahan yang digunakan antara lain kapas, alkohol 70%, Ketamin HCl,
EDTA 10%, lysis buffer (NaCl 0,2%, EDTA 1 mM), bufer pencuci (NaCl 0,9%,
EDTA 1mM), larutan 1x STE, larutan SDS 10%, larutan NaCl 10 M, urealysis
buffer, proteinase K, RNAse, membran dialisis (VISKING® Seamless cellulose tubing), fenol, kloroform isoamilalkohol, bahan untuk PCR, bahan untuk pembuatan gel agarose dan poliakrilamid, bahan untuk elektroforesis, bahan untuk pemuatan contoh, dan bahan untuk pewarnaan.
Primer Mikrosatelit
Sejumlah sembilan lokus mikrosatelit digunakan sebagai penanda molekul pada penelitian ini. Polimorfisme masing-masing lokus mikrosatelit diungkapkan dengan menggunakan sepasang primer mikrosatelit manusia. Primer mikrosatelit
tersebut adalah D1S533, D1S548, D1S550, D2S367, D2S1368, D3S1768,
D4S243, D4S2456, dan D5S820. Pemilihan lokus tersebut sebagai penanda molekul karena beberapa pertimbangan. Lokus tersebut bukan saja bermotif tetra
25 nukleotida sehingga alelnya mudah dibedakan dengan cara elektroforesis, tetapi juga amplifikasinya melalui PCR sangat konsisten. Selain itu, lokus tersebut menunjukkan polimorfisme pada berbagai penelitian yang telah dilakukan terutama pada monyet Rhesus.
Pengambilan Contoh Darah Monyet Ekor Panjang
Monyet dibius dengan Ketamin HCl (dosis 10 mg/kg bobot badan) dengan cara ditulup. Sebanyak 5-10 ml darah diambil dari vena femoralis dengan menggunakan alat suntik 10 ml yang telah diisi EDTA 10% 0,1-0,4 ml sebagai antikoagulan. Darah dipisahkan menjadi tiga bagian yaitu plasma darah, buffy coat (mengandung sel darah putih), dan sel darah merah dengan pemusingan 3500 rpm (maksimum 1500 g) selama 15 menit. Untuk pencuplikan tahun 2000,
buffy coat disimpan pada 0o sampai 4o C sebelum diproses lebih lanjut, atau disimpan di dalam alat pembeku (freezer) untuk diproses selanjutnya di lain waktu. Sebaliknya, untuk pencuplikan tahun 2005, buffy coat langsung dituangkan ke dalam tabung yang telah berisi larutan urea lysis buffer.
Ekstraksi dan Purifikasi DNA Total
Ekstraksi dan purifikasi DNA total untuk buffy coat tahun 2000 menggunakan metode Kan et al. (1977) dalam Perwitasari-Farajallah (1998). Ekstraksi menggunakan fenol-kloroform dan purifikasi dengan membran dialisis. Membran dialisis disiapkan dengan cara seperti yang diterangkan dalam Sambrook et al. (1989).
Langkah ekstraksi dan purifikasi DNA total sebagai berikut. Satu ml contoh darah (buffy coat) dimasukkan ke dalam tabung polipropilen 15 ml (tabung Falcon). Ditambahkan ke dalamnya lysis buffer (NaCl 0,2%, EDTA 1 mM) 4-5 kali volume contoh, kemudian dikocok hingga tersuspensi, dan selanjutnya dipusingkan pada 3000 rpm (maksimum 1000 g) selama 15 menit. Setelah pemusingan, supernatannya dibuang dan ditambahkan lysis buffer (NaCl 0,2%, EDTA 1 mM) 10 ml. Dikocok sebentar sebelum dipusing 3000 rpm (maksimum
26 1000 g) selama 10-15 menit. Selanjutnya, supernatan dibuang lalu ditambahkan bufer pencuci (NaCl 0,9%, EDTA 1mM) 10 ml. Dipusingkan pada 3000 rpm (maksimum 1000 g) selama 10 menit. Supernatan dibuang setelah pemusingan selesai. Dimasukkan ke dalamnya larutan 1x STE 2 ml, dikocok perlahan sampai tercampur, lalu ditambahkan Proteinase K (10 mg/ml) 30 l dan SDS 10% 0,5 ml. Diinkubasi pada suhu 55oC sambil diputar pelan selama dua jam atau sampai suspensi homogen. Selesai diinkubasi, dituangkan ke dalamnya larutan NaCl 5 M sebanyak 1/10x volume, fenol 0,5-1,0x volume dan larutan kloroform isoamil alkohol (CIAA) 0,5-1,0x volume, kemudian diputar pelan dalam suhu ruang selama 75-120 menit. Setelah itu, pemusingan 3000 rpm (maksimum 1000 g) dilakukan selama 20 menit. Fase air (lapis atas) dipindahkan ke kantong dialisis dengan pipet Pasteur. Setiap kantong dialisis diberi nomor dengan klip plastik. Dialisis dilakukan dalam dua liter larutan 1x TE 4o C selama minimal lima jam atau semalam sambil dikocok pelan. Selanjutnya, sol DNA dari kantong dialisis dipindahkan ke tabung Falcon. Ditambahkan RNase 30 l, dan dikocok pelan beberapa kali. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit dalam
waterbath. Setelahnya, ditambahkan larutan 5 M NaCl 1/10x volume dan Proteinase K 30 l. Diinkubasi pada 55oC selama dua jam sambil diputar perlahan. Selesai inkubasi, ditambahkan fenol dan CIAA masing-masing 0,5 kali volume. Diputar pelan pada suhu ruang selama 75-120 menit. Kemudian, dipusingkan pada 3000 rpm (maksimum 1000 g) selama 15 menit. Fase air (lapis atas) dipindahkan ke kantong dialisis dan didialisis dalam dua liter larutan 1xTE 4oC selama minimal lima jam atau semalam. Selanjutnya, sol DNA dari kantong dialisis dipindahkan ke botol penyimpan DNA dan diisi dengan dua tetes CIAA. Botol penyimpan DNA diberi label dan disimpan pada suhu 4oC.
Ekstraksi dan purifikasi DNA total contoh buffy coat tahun 2005 menggunakan larutan fenol-kloroform dan membran dialisis. Sebagai pelisis dan denaturan protein digunakan urea lysis buffers. Langkah ekstraksi dan purifikasi DNA total sebagai berikut. Satu ml buffy coat dimasukkan ke dalam tabung polipropilen 15 ml (tabung Falcon) dan ditambahkan ke dalamnya urea lysis buffers 2 ml. Campuran dikocok sampai homogen, kemudian ditambahkan SDS 10% 0,5 ml, fenol 1,5 ml, CIAA 1,5 ml, dan NaCl 5 M 0,3 ml. Diputar pelan
27 pada suhu kamar selama dua jam. Selesai pemutaran, tabung dipusingkan 3500 rpm (maksimum 1500 g) selama 15 menit. Fase air (lapis atas) dipindahkan ke kantong dialisis dengan pipet Pasteur. Dialisis dilakukan dalam dua liter larutan 1x TE 4o C semalam sambil dikocok pelan. Selanjutnya, sol DNA dari kantong dialisis dipindahkan ke botol penyimpan DNA yang sebelumnya telah dilabel.
Dua tetes CIAA ditambahkan ke dalam sol DNA dan disimpan pada suhu 4oC.
Hasil purifikasi dilihat dengan cara elektroforesis pada gel agarose 0,5% volume 80 ml dalam larutan 1xTAE (Tris Acetat EDTA, pH 8,0). Fragmen dimunculkan dengan pewarna etidium bromida setelah dimigrasikan selama 35 menit dengan voltase 50 V. Penanda yang digunakan adalah DNA ? HindIII untuk mengetahui adanya fragmen DNA dengan berat molekul tinggi (high molecular weight DNA). Fragmen DNA yang terwarnai divisualisasikan pada foto dengan kamera Polaroid di bawah sinar ultraviolet.
Amplifikasi Lokus Mikrosatelit
Mikrosatelit diamplifikasi melalui Polymerase Chain Reaction (PCR).
Setiap unit reaksi PCR mengandung 1x bufer PCR; 3 mM MgCl2; masing-masing
0,16 mM dNTP; masing-masing 0,48 mM sepasang primer; dan sebanyak 0,25 U Taq DNA Polimerase. Setiap reaksi PCR dibuat dengan volume 12,5 l dengan komposisi 10x buffer A 1,25 l (Fisher Scientific), MgCl2 25 mM 0,75 l (Promega), dNTP 10 mM mix 0,2 l, primer Reverse dan Forward 20 mM masing-masing 0,3 l, Taq DNA Polymerase 5 U/ l (Fisher Scientific) 0,05 l,
template DNA 2 l, dan air deionase 7,65 l. Urutan pencampuran dilakukan secara bebas, kecuali Taq DNA Polimerase dicampur untuk yang terakhir. Campuran divorteks dan dipusingkan sebentar (Hillis et al. 1996).
Amplifikasi menggunakan mesin TaKaRa PCR Thermal Cycler MP. Kondisi PCR untuk masing-masing primer mikrosatelit sebagai berikut. Pra PCR: denaturasi 94 oC selama lima menit; PCR: denaturasi 94 oC 45 detik, annealing
(56 oC untuk primer D1S533, D1S550, D2S367, D3S1768, D4S2456, 58 oC untuk primer D1S548, D2S1368, D4S243, dan 60 oC untuk primer D5S820)
28 selama satu menit, dan elongasi 72 oC selama satu menit; dan post PCR: elongasi 72 oC selama lima menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.
Variasi alel mikrosatelit dipisahkan secara elektroforesis pada gel poliakrilamid 7% dalam larutan 1x penyangga TBE (Tris Borak EDTA, pH 8.0) dengan voltase 160 V selama 120 menit. Sejumlah 1µl produk PCR dicampur dengan 0,2 µl penyangga pemuat (5x dye), selanjutnya dimasukkan ke dalam sumur gel poliakrilamid yang telah disiapkan. Pita dimunculkan dengan pewarnaan perak dan panjang basa diukur dengan membandingkan terhadap penanda standard 100 bp DNA ladder (Gibco BRL, Life Technologies).
Peubah Genetika Populasi
Pita yang muncul pada gel poliakrilamid adalah suatu alel mikrosatelit. Keragaman alel mikrosatelit dapat dilihat dari beda jarak migrasi alel pada gel (Lessa dan Applebaum 1993; Krawczak dan Schmidtke 1994). Genotipe ditentukan berdasarkan variasi pita alel. Genotipe untuk monyet jantan dan betina tidak dibedakan karena penanda molekul yang digunakan terletak pada kromosom somatik sehingga variasi pasangan alel sama-sama berasal dari kedua induk secara acak. Selanjutnya, frekuensi masing-masing alel setiap lokus mikrosatelit di masing-masing populasi lokal dihitung dengan menggunakan rumus Nei (1987).
Peubah genetika populasi yang akan dihitung meliputi keragaman genetik, Keseimbangan Hardy-Weinberg untuk mengetahui pola kawin acak dalam populasi lokal , diferensiasi genetik populasi lokal dalam dan antar pulau, aliran genetik (gene flow), dan jarak genetik antar populasi lokal.
Analisis Data Mikrosatelit
Keragaman genetik diukur dengan rataan heterosigositas (H) yang dihitung untuk semua lokus, baik lokus polimorfik atau monomorfik. Rataan heterosigositas (H) dihitung menggunakan rumus Nei (1987).
29 Untuk menganalisis Keseimbangan Hardy-Weinberg dalam populasi lokal monyet ekor panjang, digunakan indeks fiksasi (FIT). Di bawah asumsi tidak terjadi seleksi terhadap alel kodominan, penyimpangan nilai FIT dari nol (tidak terjadi inbreeding) diuji dengan uji ?2 dengan derajat bebas satu (Nei 1987).
Diferensiasi genetik antar populasi lokal dihitung dengan menggunakan penduga FST atau GST (Nei 1987; Nei dan Kumar 2000). Dalam hal ini, keragaman genetik total (HT) dipilah menjadi dua komponen yaitu keragaman genetik dalam (HS) dan antar populasi lokal (DST). Diferensiasi genetik mengukur besarnya defisit keragaman genetik populasi lokal relatif terhadap heterosigositas genetik total.
Aliran genetik dihitung dengan menggunakan model pulau (Avise 1994). Pada model ini, setiap kelompok akan menerima imigran dengan laju m secara random dari sebuah populasi yang anggotanya besar. Aliran genetik diekspresikan dengan jumlah efektif migran setiap generasi (Nem).
Jarak genetik antar populasi lokal dihitung menggunakan jarak genetik standar Nei (Ds) (Takezaki dan Nei 1996)di bawah asumsi infinite allele model. Jarak genetik tersebut dijadikan dasar untuk membuat dendogram dengan metode
unweighted pair-group method with arithmetic average (UPGMA). Jarak genetik standar Nei (DS) dan dendogram dibuat dengan menggunakan program Phylip (Phylogeny InferencePackage) Version 3.6 dari Felsenstein (2004).