Tempat dan Waktu Penelitian
Pengambilan dan pemeriksaan semen babi dilakukan di Balai Inseminasi Buatan Daerah (BIBD) Unit Pelaksana Teknis Dinas (UPTD) Peternakan Propinsi Bali di Baturiti selama tiga bulan (Desember 2006 - Maret 2007). Selanjutnya dilakukan pemeriksaan semen secara lebih akurat selama satu bulan (Maret - April 2007) di Laboratorium Fisiologi dan Reproduksi Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Materi Penelitian Sumber Semen
Ternak yang digunakan sebagai sumber semen pada penelitian ini adalah tiga ekor babi jantan dewasa kelamin, dari bangsa Yorkshire, umur tiga tahun, dalam kondisi sehat, dan mempunyai kualitas semen baik, yaitu konsentrasi spermatozoa lebih dari 150 x 106sel/ml dan motilitas spermatozoa lebih dari 60%. Penampungan semen dilakukan pada pagi hari, dua kali seminggu, dengan metode manual (glove hand method) dibantu peralatan tabung penampungan (Gambar 7). Pemisahan fraksi gelatin dilakukan dengan melapisi kain kassa pada mulut tabung.
(a) (b)
Gambar 7 Metode penampungan semen babi : a) Metode manual (glove- hand method); b) Alat penampungan semen.
Kandang dan Pakan
Pejantan babi dipelihara dalam kandang, lantainya terbuat dari beton, dinding kandang dibuat dari anyaman besi berukuran 2 x 3 x 1 meter dan atapnya asbes. Masing-masing kandang pejantan dilengkapi dengan tempat pakan dan kran air otomatis (water nipple). Pakan yang diberikan untuk pejantan mengandung protein 18% dan energi 16 MJ (3824.16 kkal/kg), yang terdiri dari dedak padi, dedak jagung, polar, gandum, konsentrat 152, mineral, lisin, dan starbio, dengan total pemberian pakan sebanyak 2,5 kg/ekor/hari, serta air minum diberikan ad libitum (selalu tersedia).
Induk
Babi induk yang digunakan sebagai akseptor IB sebanyak 18 ekor, dengan kondisi induk sudah pernah beranak kedua atau ketiga yang ditempatkan dalam kandang model batterey. Masing-masing kandang induk dilengkapi dengan tempat pakan dan kran air otomatis (water nipple).
Alat dan Bahan
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah dummy-sow, penampung semen babi, water bath (pemanas air), gelas ukur, timbangan analitik dalam satuan miligram sampai gram, tabung berskala, epemdorf, mikropipet, pipet tetes, spuit, pH meter, termometer, obyek gelas, kotak preparat, api bunsen, meja pemanas, mikroskop-binokuler, sperm-vision, plastic shocket (plastik semen), lemari es, kotak styrofoam, dan alat-alat bantu lainnya yang dipergunakan sesuai dengan fungsinya.
Bahan
Bahan pengencer semen yang digunakan dalam penelitian ini adalah Beltsville Thawing Solution (BTS), Modifikasi BTS (M-BTS) dengan mengganti sumber karbohidrat (glukosa) menjadi fruktosa, dan Modifikasi Zorlesco (M-Zorlesco) dengan menambahkan fruktosa sebagai sumber karbohidrat, dan mengganti sistein dengan glisin sebagai sumber nutrisi dan protein. Penggunaan
glisin sebagai pengganti sistein karena glisin mudah diperoleh dan memiliki fungsi yang sama dengan sistein. Komposisi bahan pengencer yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 6.
Bahan-bahan pewarnaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahan pewarnaan eosin-nigrosin dan pewarnaan Williams. Penggunaan pewarnaan eosin-nigrosin dan pewarnaan Williams bertujuan untuk mengamati morfologi dan morfometri spermatozoa. Pewarnaan eosin-nigrosin terdiri atas 20 gr nigrosin, 1.5 gr sodium sitrat, 300 ml aquabidest, dan 3.3 gr eosin yellow. Pewarnaan Williams terdiri atas 10 gr basic fuchsin dalam 100 ml alkohol 95%, saturated bluish eosin dalam alkohol 95% dan 10 ml basic fuchsin (hasil larutan pertama) dalam 170 ml larutan fenol 5%.
Tabel 6 Komposisi bahan pengencer semen babi
Bahan Kimia (g/100ml) BTS M-BTS M-Zorlesco
Glukosa 3.7 - 1.15
Fruktosa - 3.7 0.9
EDTA 0.125 0.125 0.23
Sodium-sitrat 0.6 0.6 1.17
Sodium-bikarbonat 0.125 0.125 0.125
Tris (hydroxymethyl) aminomethan - - 0.65
Pottasium Klorida 0.075 0.075
Asam-sitrat - - 0.41
Glisin - - 0.01
BSA - - 0.5
Pennisilin (IU) : Streptomisin (mg) 100,000 : 100 100,000 : 100 -
Aquabidest (ml) 100 100 100
Ket : BTS (Beltsville Thawing Solution), M-BTS (Modifikasi BTS), M-Zorlesco (Modifikasi
Zorlesco), BSA (Bovine Serum Albumin), EDTA (Ethylenediamine-tetra-acetic acid).
Metode Penelitian
Karakteristik Semen Segar
Sebelum dilaksanakan penampungan semen, bahan pengencer dibuat terlebih dahulu pada hari penampungan dengan komposisi seperti pada Tabel 6 dan dihangatkan pada temperatur 37 °C. Penampungan semen dilakukan dua kali
dalam satu minggu pada pagi hari sebanyak satu ejakulat menggunakan alat penampung semen untuk babi, dengan metode manual (glove hand method), dan betina pemancing berupa dummy-sow. Pemisahan fraksi gel dilakukan dengan memasang kain kassa beberapa lapis pada mulut tabung koleksi.
Semen yang diperoleh dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi secara makroskopis meliputi pemeriksaan volume (ml), warna, pH dan pemeriksaan konsistensi atau kekentalan. Evaluasi secara mikroskopis meliputi gerakan massa ( 0, +, ++ dan +++), konsentrasi spermatozoa (106 sel/ml), persentase sperma motil (M%) dan persentase sperma hidup (SH%) dengan pewarnaan eosin-nigrosin, serta persentase normalitas dan abnormalitas spermatozoa dengan pewarnaan Williams.
Evaluasi Semen
Semen yang telah ditampung dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Segera setelah semen diperoleh pemeriksaan makroskopis dilakukan meliputi volume, pH, konsistensi dan warna, sedangkan pemeriksaan mikroskopis ditujukan untuk mengetahui kualitas spermatozoa.
Pemeriksaan mikroskopis meliputi :
a) Gerakan massa diperiksa dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 10 x 10, dengan penilaiannya adalah sangat baik (+++), baik (++), cukup (+), dan kurang (-),
b) Konsentrasi spermatozoa menggunakan haemositometer dan kamar hitung Neubauer dan cairan hipertonis (50 ml aquabides, 1 ml eosin 2%, dan 1 ml cairan NaCl 3%),
c) Motilitas spermatozoa menggunakan obyek gelas yang ditutup dengan gelas penutup dan diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 10 x 40. Persentase motilitas dapat dinilai secara subyektif dengan membandingkan spermatozoa motil bergerak kedepan (progresif) dengan yang tidak progresif (linear). Penilaian yang diberikan dari angka 0% (tidak motil) sampai 100% (motil semua),
d) Persentase hidup spermatozoa dilakukan dengan menggunakan pewarna eosin-nigrosin, kemudian dilakukan ulasan secara cepat dan dikeringkan.
Pemeriksaan dilakukan dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 10 x 40 pada sepuluh lapang pandang atau dua ratus spermatozoa,
e) Persentase abnormalitas dilakukan dengan pewarnaan Williams, dilanjutkan dengan pemeriksaan di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 10 x 40 pada sepuluh lapang pandang atau lima ratus spermatozoa.
Semen yang telah dievaluasi dan memenuhi syarat, dapat diproses lebih lanjut. Adapun syarat-syarat yang dimaksud adalah volume lebih dari 150 ml, motilitas lebih dari 60%, konsentrasi lebih dari 150 x 106 sel/ml, persentase spermatozoa hidup minimal 65%, dan persentase spermatozoa abnormal tidak lebih dari 20%.
Teknik Pewarnaan
Pewarnaan spermatozoa berfungsi untuk membantu proses pengamatan morfologi dan morfometri spermatozoa. Berbagai metode pewarnaan dapat dilakukan dilapangan, seperti pewarnaan eosin-nigrosin dan pewarnaan Williams.
Pewarnaan eosin-nigrosin dilakukan untuk mengamati morfologi spermatozoa hidup dan spermatozoa mati. Preparat ulas dibuat dengan cara melarutkan semen segar menggunakan eosin-nigrosin satu berbanding dua, selanjutnya dibuat preparat ulas tipis dan dikeringkan di atas meja pemanas (heating table). Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 40 pada sepuluh lapang pandang atau minimal dua ratus sel. Spermatozoa yang mati akan menyerap warna (merah keunguan), sedangkan spermatozoa yang hidup tidak menyerap warna (putih).
Pewarnaan Williams dilakukan untuk mengamati morfologi dan morfometri spermatozoa yang berkaitan dengan abnormalitas spermatozoa. Preparat ulas tipis semen segar di atas obyek gelas dikeringudarakan dan disimpan dalam boks preparat, selanjutnya dilakukan pewarnaan Williams di laboratorium. Pewarnaan dilakukan dengan memfiksasi preparat ulas yang disimpan dalam boks preparat diatas api bunsen dan selanjutnya dicuci dalam alkohol absolut selama empat menit lalu dikeringudarakan. Preparat dimasukkan kedalam larutan 0.5% chloramin selama 1 - 2 menit, sambil dicelupkan berkali-kali dengan tujuan menghilangkan mukus dan ulasan terlihat jernih. Selanjutnya dicuci dalam
distilled water, kemudian dalam alkohol 95% dan diwarnai dengan larutan Williams selama 8 - 10 menit. Kemudian dicuci pada air mengalir dan dikeringkan. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 40, pada sepuluh lapang pandang atau minimal lima ratus sel. Abnormalitas dapat terjadi pada bagian kepala dan ekor spermatozoa.
Pengenceran dan Penyimpanan Semen
Semen yang telah dievaluasi dan memenuhi syarat, selanjutnya diencerkan menggunakan bahan pengencer BTS, M-BTS dan M-Zorlesco (Tabel 6) dengan perbandingan 1 : 3. Asumsi berdasarkan dosis IB yakni konsentrasi spermatozoa motil mencapai 2000 - 3000 x 106 sel dalam 80 ml. Kemudian masing-masing dibagi menjadi tiga bagian dalam plastik semen 80 ml, dan disimpan pada tiga tempat yang berbeda yaitu pada ruang terbuka (22 °C), lemari es (15 °C), dan kotak styrofoam (18 °C), masing-masing selama 42 jam. Pengaturan temperatur di dalam lemari es dengan cara memformat pada low temperatur dan semen ditempatkan pada rak yang paling bawah. Sedangkan pengaturan temperatur di dalam kotak styrofoam yang memiliki ketebalan dua sentimeter, dengan cara menambahkan lapisan handuk di atas es (ice block).
Inseminasi Buatan
Dosis Inseminasi
Semen cair yang digunakan adalah semen yang ditampung pada hari yang sama dalam pengencer berbeda (Tabel 6). Dosis yang digunakan untuk satu kali IB adalah 80 ml dengan konsentrasi spermatozoa sebesar 2000 - 3000 x 106 sel, serta motilitas ≥ 60%. Apabila motilitas spermatozoa lebih rendah daripada 60% saat digunakan untuk inseminasi maka dosis IB khususnya volume semen, ditingkatkan untuk mencapai konsentrasi spermatozoa berdasarkan standar IB, dengan menggunakan rumus:
Motilitas IB
Volume per dosis = x volume IB Motilitas semen
Contoh perhitungan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 7. Semen cair yang akan digunakan, dihangatkan kembali dalam temperatur 37 °C selama lima menit untuk mengaktifkan kembali spermatozoa.
Teknik Inseminasi
Pengamatan terhadap induk dilakukan setiap hari untuk mengetahui munculnya tanda-tanda berahi yaitu adanya perubahan tingkah laku yang cenderung agresif, perubahan ukuran dan warna vulva serta adanya mucus pada vulva. Inseminasi buatan dilakukan 2 - 3 jam setelah dilakukan uji tekan punggung (menunjukkan reaksi diam saat punggung ditekan), dan IB dilakukan dua kali pada masing-masing induk dengan rentang waktu 18 jam setelah inseminasi pertama.
Inseminasi dilakukan dengan semen cair yang dimasukkan secara transcervical, dengan menggunakan sebuah kateter (panjang: 50 - 55 cm). Ujung kateter dibasahi dengan sedikit semen sebagai pelumas, kemudian bibir vulva dibuka dengan jemari tangan. Secara perlahan ujung kateter dimasukkan ke dalam saluran kelamin betina dengan arah sedikit miring ke atas sambil diputar ke arah kiri melewati servik sampai terasa mengganjal dan terkunci. Selanjutnya pangkal kateter ditekuk ke atas, dan semen cair dalam kemasan semen dimasukkan pada lubang kateter.
Semen dalam kemasan akan mengalir dengan sendirinya mengikuti kontraksi saluran kelamin betina. Jika semen di dalam kemasan masih ada, dan kemasan semen mengempes hingga semen tidak mengalir maka kemasan semen dicabut dan biarkan udara masuk, kemudian pasang kembali kemasan semen pada kateter.
Setelah semen habis mengalir, biarkan beberapa saat kemudian kateter dikeluarkan dengan cara memutar kateter ke arah kanan sambil ditarik keluar ke arah atas. Selesai menginseminasi, induk dibiarkan tenang dan makanan diberikan setelah enam jam dari waktu inseminasi. Hasil positif dari IB dapat dideteksi sesuai dengan siklus berahi babi yaitu pada hari ke-21, dengan tidak munculnya tanda-tanda berahi. Rangkaian kegiatan inseminasi pada babi diperlihatkan dalam Lampiran 8.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Faktorial In-time (faktorial dengan pengamatan berulang). Faktor perlakuan yang digunakan yaitu bahan pengencer, tempat penyimpanan, dan waktu pengamatan. Bahan pengencer yang digunakan adalah BTS, MBTS dan MZorlesco. Tempat penyimpanan adalah pada ruang terbuka (22 °C), kotak styrofoam (18 °C), dan lemari es (15 °C). Waktu pengamatan dilakukan setiap enam jam baik pada tempat penyimpanan di ruang terbuka, kotak styrofoam maupun lemari es, mulai dari pengamatan jam ke-0 hingga jam ke-42 penyimpanan. Pejantan sebanyak tiga ekor digunakan sebagai ulangan. Penampungan semen dilakukan dua kali seminggu pada pagi hari. Semua sampel yang diberi perlakuan masing-masing diulang sebanyak tiga kali.
Induk yang digunakan sebagai akseptor IB sebanyak 18 ekor. Dosis IB untuk masing-masing induk yakni semen cair dengan pengencer BTS, MBTS dan MZorlesco, yang disimpan dalam kotak styrofoam (18 °C) selama 6 - 12 jam, volume 80 ml/dosis, konsentrasi spermatozoa sebesar 2000 - 3000 x 106 sel/80 ml, serta motilitas lebih dari 60%. Bagan alur penelitian dijelaskan dalam Gambar 8.
Parameter yang Diamati
Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah :
1 Karakteristik semen segar meliputi volume, konsistensi, pH, gerakan massa, konsentrasi, persentase sperma motil, persentase spermatozoa hidup, dan persentase morfologi (normalitas) spermatozoa.
2 Viabilitas spermatozoa setelah pengenceran dan penyimpanan, meliputi persentase sperma motil, dan persentase spermatozoa hidup.
3 Fertilitas spermatozoa dinilai dari angka konsepsi atau Conception Rate (CR) dengan melihat jumlah betina yang bunting dibagi jumlah betina yang diinseminasi dikali 100% untuk tiap program inseminasi.
Gambar 8 Alur penelitian
Semen segar hasil tiap kali penampungan dari masing-masing tiga ekor pejantan Yorkshire
20 ml 20 ml 20 ml 20 ml Tanpa Pengencer + BTS (1 : 3) + M-BTS (1 : 3) + M-Zoc (1 : 3) S I M P A N
Ruang Terbuka Kotak Styrofoam Lemari Es ( 22 °C) ( 18 °C) ( 15 °C)
Pengamatan
Motilitas (%), Sperma Hidup (%) (0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 Jam)
Pelaksanaan IB Menggunakan semen cair Evaluasi semen
Makroskopis dan Mikroskopis
Model Matematika
Model matematika yang digunakan menurut Steel dan Torrie (1993) adalah sebagai berikut : ijkl ijk jk ik k ij l ij j i ijkl Y =
μ
+α
+β
+αβ
+δ
( ) +γ
+αγ
+βγ
+αβγ
+ε
dengan : i=1,2,3 j=1,2,3 k=1,2,...,7 l=1,2,3 Keterangan : ijklY = nilai pengamatan pada pengencer ke-i tempat penyimpanan ke-j waktu pengamatan ke-k dan ulangan ke-l
μ = rataan umum i
α = pengaruh aditif dari pengencer ke-i j
β = pengaruh aditif dari tempat penyimpanan ke-j ij
αβ = pengaruh interaksi antara bahan pengencer ke-i dengan tempat penyimpanan ke-j
l(ij)
δ = pengaruh galat dari bahan pengencer ke-i tempat penyimpanan ke-j dan ulangan ke-l
k
γ = pengaruh waktu pengamatan ke-k ik
αγ = pengaruh interaksi antara bahan pegencer ke-i dengan waktu pengamatan ke-k
jk
βγ = pengaruh interaksi antara tempat penyimpanan ke-j dengan waktu pengamatan ke-k
ijk
αβγ = pengaruh interaksi antara bahan pengencer ke-i dengan suhu penyimpanan ke-j dan waktu pengamatan ke-k
ijkl
Σ = pengaruh galat dari bahan pengencer ke-i, tempat penyimpanan ke-j, waktu pengamatan ke-k, serta ulangan ke-l
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisa dengan analisis of variance (ANOVA) menggunakan program SAS dan bila terdapat perbedaan yang nyata (P<0.05) atau sangat nyata (P<0.01) dilanjutkan dengan uji Duncan (Steel dan Torrie 1993).
