METODE ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI - Penentuan Prevalensi Cemaran Campylobacter Jejuni Sampel

Pada penelitian ini digunakan dua metode isolasi C. jejuni yaitu metode modifikasi I dan modifikasi II BAM 2001. Tahapan – tahapan dalam penelitian ini, meliputi tahap pengambilan sampel karkas ayam, tahap persiapan media isolasi (CBPA dan mCCDA), tahap persiapan sampel, isolasi dan penentuan prevalensi cemaran C. jejuni dengan dua metode isolasi modifikasi BAM 2001, serta tahap pengidentifikasian dan pengawetan isolat C. jejuni.

1. Pengambilan sampel karkas ayam

Sampel karkas ayam diambil secara acak dengan metode purposive sampling technique dari 2 wilayah yaitu Bogor dan Jakarta. Purposive sampling merupakan salah satu non probality sample yang tidak menghiraukan prinsip-prinsip probability. Pemilihan sampel tidak secara random dan hasil yang diharapkan merupakan gambaran kasar tentang suatu keadaan. Teknik purposive sampling ini dilakukan hanya atas dasar pertimbangan penelitinya saja yang menganggap unsur-unsur yang dikehendaki telah ada dalam anggota sampel yang diambil (Nasution, 2003).

Wilayah Bogor dibagi kedalam tiga kelompok lokasi pengambilan sampel yaitu Bogor Barat, Bogor Tengah dan Bogor Timur. Pada setiap kelompok, sampel diambil dari dua pasar tradisonal dan dua pasar modern (supermarket). Sehingga ada 6 pasar tradisional dan 6 pasar modern (supermarket) sebagai lokasi pengambilan sampel. Pada setiap pasar, sampel diambil dari dua pedagang karkas ayam yang berbeda dengan dua kali ulangan. Total sampel karkas ayam dari wilayah Bogor adalah 3 x 2 x 2 x 2 x 2 = 48 sampel. Sedangkan wilayah Jakarta dibagi kedalam lima kelompok lokasi pengambilan sampel yaitu Jakarta Barat, Jakarta Pusat, Jakarta Utara, Jakarta Timur, dan Jakarta Selatan. Total sampel karkas ayam dari wilayah Jakarta adalah 36 sampel, dengan perincian sebanyak 18 sampel diambil dari pasar tradisional, dan 18 sampel dari pasar modern (supermarket). Total sampel karkas ayam yang diteliti adalah 84 sampel

Proses pemvakuman dilakukan dengan memasukkan sampel karkas ayam kedalam plastik khusus vakum yang salah satu ujung plastiknya telah di- seal. Ujung plastik yang lain kemudian diletakkan pada bantalan karet alat pemvakum. Setelah itu, plate logam dari alat pemvakum diturunkan menuju ujung plastik yang berada diatas bantalan karet. Panas plate logam menyebabkan plastik ter-seal. Proses sealing ini, diawali dengan pengeluaran udara yang terdapat didalam plastik berisi sampel dengan bantuan penghisap vakum yang berada disekitar bantalan karet. Sehingga, disaat proses sealing selesai kondisi didalam plastik juga telah menjadi vakum. Proses pemvakuman sampel karkas ayam memerlukan waktu tidak lebih dari 5 menit 2. Persiapan media isolasi C. jejuni

Media yang digunakan untuk isolasi bakteri Campylobacter jejuni pada penelitian ini adalah mCCDA (Modified Campylobacter Blood-Free Selective Agar Base) dan CBPA (Columbia Blood Preston Agar). Digunakannya kedua media ini bertujuan untuk membandingkan pengaruh keberadaan darah lisis untuk isolasi C. jejuni. Media mCCDA merupakan media yang tidak memerlukan tambahan darah yang dilisiskan, sedangkan media CBPA memerlukan tambahan darah untuk penyiapan medianya.

Media mCCDA dibuat dengan cara melarutkan 22.75 gram mCCDA kedalam 500 mL akuades. Untuk membantu proses pelarutan media, maka dilakukan pemanasan diatas hot plate sambil dilakukan pengadukan. Selain untuk membantu melarutkan media, proses pemanasan juga dapat meningkatkan optimalisasi pembentukan agar mCCDA (Bridson, 1998). Setelah media larut dalam akuades, kemudian dilakukan proses sterilisasi media menggunakan otoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. Setelah itu dilakukan plating pada cawan petri steril. Proses plating dapat dilakukan setelah suhu media turun mencapai suhu 50 0C dengan sebelumnya ditambahkan dengan 1 vial CCDA selective supplement (Oxoid SR0155). Diagram alir persiapan media agar mCCDA dapat dilihat pada Lampiran 1.

Media CBPA dibuat dengan cara melarutkan 18.5 gram CAB (Columbia Agar Base) kedalam 500 mL akuades. Untuk membantu proses pelarutan media, dilakukan pemanasan diatas hot plate sambil dilakukan pengadukan. Setelah media larut dalam akuades, kemudian dilakukan proses sterilisasi media menggunakan otoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. Setelah itu dilakukan plating pada cawan petri steril. Proses plating dapat dilakukan setelah suhu media turun mencapai suhu 50 0C dengan sebelumnya ditambahkan dengan 5% darah kuda lisis dan 1 vial Campylobacter Selective Supplement Preston (Oxoid SR0117). Diagram alir persiapan media agar CBPA dapat dilihat pada Lampiran 2.

3. Persiapan sampel, isolasi, dan penentuan prevalensi cemaran C. jejuni

Sampel karkas ayam yang diambil dari masing-masing pasar, kemudian dianalisis keberadaan C. jejuni nya dengan menggunakan 2 media isolasi yaitu mCCDA dan CBPA yang telah disiapkan sebelumnya. Sebelum sampel digunakan, perlu dilakukan persiapan sampel terlebih dahulu untuk mengkondisikan sampel agar dapat diisolasi C. jejuni nya.

3.1. Persiapan sampel

Pada metode modifikasi I BAM 2001 persiapan sampel dilakukan dengan memasukkan 150 gram bagian karkas ayam kedalam plastik steril yang telah berisi 50 ml Bolton Broth, kemudian dilakukan rinsing (digosok- gosok) selama + 2 menit. Cairan bekas cucian karkas ayam kemudian dimasukkan kedalam botol gelap steril.

Pada metode modifikasi II BAM 2001 persiapan sampel dilakukan dengan memasukkan 150 gram bagian karkas ayam kedalam plastik steril yang telah berisi 50 ml Buffered Pepton Water (BPW) 0.1%, kemudian dilakukan rinsing (digosok-gosok) selama + 2 menit. Cairan bekas cucian karkas ayam kemudian dimasukkan kedalam 50 ml tabung sentrifuse dan dilakukan sentrifuse selama 20 menit dengan putaran rotor 7.000 x g (3.500

rpm). Setelah sentrifuse selesai akan didapatkan cairan supernatan, dan pelet. Pelet ini kemudian digunakan dalam tahap isolasi C. jejuni.

3.2.Isolasi C. jejuni dan penentuan prevalensi cemaran C. jejuni

Pada metode modifikasi I BAM 2001, botol gelap yang berisi cairan bekas cucian karkas ayam kemudian ditambahkan dengan 5% darah kuda lisis dan 0.2 ml suplemen preston. Botol berisi campuran media ini kemudian dimasukkan kedalam jar anaerob, dan dilakukan pengkondisian mikroaerofilik dengan bantuan anoxomat. Setelah itu, dilakukan inkubasi pada suhu 37 0C selama 2-3 jam, dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 42 0C selama 48 jam. Cairan hasil inkubasi ini kemudian diinokulasikan sebanyak 1-2 loop kedalam media agar mCCDA dan CBPA menggunakan teknik gores kuadran. Media yang telah digores kuadran dengan cairan hasil inkubasi kemudian diinkubasi pada suhu 42 0C selama 42 jam. Setelah inkubasi selesai akan dapat diketahui sampel yang positif C. jejuni dengan cara melakukan pengamatan pada koloni yang tumbuh dan melakukan beberapa uji pengidentifikasian C. jejuni. Tahap persiapan sampel dan isolasi C. jejuni dengan metode modifikasi I BAM 2001 dapat dilihat pada Gambar 3.

Pada metode modifikasi II BAM 2001, pelet hasil sentrifuse kemudian disuspensikan sebanyak 5 ml kedalam 20 ml campuran media (Bolton Broth + 5% darah kuda lisis + suplemen preston + FBP). Setelah itu, dilakukan inkubasi pada suhu 37oC selama 2-3 jam dibawah kondisi mikroaerofilik, dan dilanjutkan pada suhu 42 0C selama 48 jam juga dengan kondisi yang sama. Kondisi mikroaerofilik dapat dicapai menggunakan bantuan anoxomat dengan sebelumnya memasukkan campuran media kedalam jar anaerob. Cairan hasil inkubasi ini, kemudian diambil 1-2 loop untuk digoreskan pada media selektif mCCDA dan CBPA yang telah disediakan. Penggoresan dilakukan dengan teknik gores kuadran. Setelah itu, kedua media yang sudah digores, diinkubasi pada suhu 420C selama 48 jam dalam kondisi mikroaerofilik. Setelah inkubasi akan diketahui ada tidaknya C. jejuni pada sampel karkas ayam dengan cara melakukan pengamatan pada koloni yang tumbuh dan melakukan beberapa uji

pengidentifikasian C. jejuni. Diagram alir tahap persiapan sampel dan isolasi Campylobacter jejuni dengan metode modifikasi II BAM 2001 dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 3. Diagram Alir Persiapan Sampel dan Isolasi C. jejuni dengan Metode Modifikasi I BAM 2001

Sampel (150 gr karkas ayam)

Dimasukkan dalam plastik steril berisi 50 ml Bolton Broth, rinsing selama + 2 menit

Cairan pencuci karkas dimasukkan ke dalam botol gelap steril Ditambahkan dengan 5% darah kuda

lisis + suplemen preston

Diinkubasi pada 37oC selama 2-3 jam dalam kondisi mikroaerofilik

Diinkubasi kembali pada 42oC selama 48 jam dalam kondisi mikroaerofilik

Media mCCDA Media CBPA

Diinkubasi pada 42oC selama 48 jam dalam kondisi mikroaerofilik 1–2 loop cairan hasil inkubasi

Gambar 4. Diagram Alir Persiapan Sampel dan Isolasi C. jejuni dengan Metode Modifikasi II BAM 2001

Sampel (150 gr karkas ayam)

Dimasukkan dalam plastik steril berisi 50 ml BPW 0.1%, Rinsing selama + 2 menit

Disentrifuse dengan kecepatan 7.000 x g (3500 rpm) selama 20 menit Cairan pencuci karkas dimasukkan ke

dalam 50 ml tabung sentrifuse

Cairan supernatan Pelet

Diinkubasi pada 37oC selama 2-3 jam dalam kondisi mikroaerofilik

Diinkubasi kembali pada 42oC selama 48 jam dalam kondisi mikroaerofilik

Media mCCDA Media CBPA

Diinkubasi pada 42oC selama 48 jam dalam kondisi mikroaerofilik 1–2 loop cairan hasil inkubasi

kemudian digores kuadran pada :

Disuspensikan kedalam 20 ml campuran media (Bolton Broth + 5% darah kuda lisis + suplemen preston + FBP)

Dari seluruh hasil sampel yang positif C. jejunii, akan didapatkan besarnya prevalensi cemaran C. jejuni pada sampel karkas ayam di berbagai pasar tradisional dan pasar modern (supermarket) di wilayah Bogor dan Jakarta.

4. Pengidentifikasian dan pengawetan isolat C. jejuni 4.1. Pengidentifikasian C. jejuni

4.1.1. Uji Katalase

Uji katalase dilakukan pada koloni yang diduga C. jejuni. Pada uji katalase, sebanyak 1-2 loop koloni yang diduga C. jejuni dipindahkan kedalam gelas preparat. Kemudian kedalam gelas preparat diteteskan larutan H2O2 tepat diatas koloni. Setelah diteteskan larutan H2O2, koloni yang positif C. jejuni akan kelihatan muncul gelembung gas (O2) yang menunjukkan bakteri positif terhadap uji katalase.

4.1.2. Pewarnaan bakteri

Pewarnaan bakteri dilakukan untuk membantu pengamatan terhadap morfologi bakteri yang ada pada koloni yang diduga C. jejuni. Pewarnaan dilakukan dengan teknik pewarnaan sederhana menggunakan pewarna fuchsin Ziehl. Pewarnaan bakteri dimulai dengan memindahkan 1-2 loop koloni yang diduga C. jejuni kedalam gelas preparat yang sebelumnya telah ditetesi dengan 1-2 loop akuades steril. Koloni kemudian diratakan, dan ditetesi dengan pewarna fuchsin Ziehl. Setelah itu dilakukan pencucian terhadap kelebihan pewarna pada gelas preparat dengan menggunakan akuades steril. Kemudian dilakukan fiksasi, dan preparat siap diamati dibawah mikroskop cahaya pada perbesaran 1000 x dengan sebelumnya ditetesi dengan minyak imersi. Untuk melihat motilitas bakteri dapat dilakukan dengan menghilangkan tahapan fiksasi, dan menutup gelas preparat dengan kaca penutup. Bakteri C. jejuni akan tampak berwarna merah dengan pewarnaan fuchsin Ziehl, memiliki bentuk spiral, batang bergelombang dan bersifat motil.

4.1.3. Uji API-Campy

Sebelum dilakukan pengawetan isolat, perlu dilakukan uji API-Campy untuk memastikan bahwa isolat hasil isolasi merupakan bakteri C. jejuni. Pada uji API-Campy dibutuhkan koloni tunggal dalam jumlah cukup banyak dari bakteri yang akan diidentifikasi. Untuk memperbanyak koloni tunggal maka dipindahkan 1 loop koloni diduga C. jejuni kedalam media mCCDA atau CBPA dengan teknik goresan langsung. Media mCCDA atau CBPA hasil goresan langsung, kemudian diinkubasi pada suhu 42 0C selama 48 jam. Setelah inkubasi selesai, akan diperoleh koloni tunggal yang cukup banyak untuk digunakan dalam uji API-Campy.

Uji API-Campy dimulai dengan pembuatan suspensi bakteri dari koloni tunggal bakteri yang akan diidentifikasi. Pada uji API-Campy diperlukan konsentrasi C. jejuni yang cukup banyak yaitu kekeruhan dari suspensi bakteri pada uji yang setara dengan kekeruhan Mc. Farlan No.6. Suspensi ini kemudian dipindahkan kedalam mikrotube pada strip-strip API- Campy dan diinkubasi suhu 36o + 2oC selama 48 jam pada kondisi mikroaerofilik untuk setengah strip dan kondisi aerob untuk setengah strip yang lainnya. Setelah diinkubasi, kemudian dilakukan uji dengan API-Campy test kit untuk menguatkan dan mengidentifikasi bahwa isolat tersebut adalah C. jejuni.

4.2. Pengawetan isolat Campylobacter jejuni

Koloni yang positif C. jejuni setelah diuji dengan API-Campy test kit kemudian diperbanyak atau disegarkan dengan menggunakan BHI Broth. Perbanyakan dilakukan dengan cara memindahkan 1-2 loop koloni positif C. jejuni kedalam 10 ml BHI Broth. Setelah itu, dilakukan inkubasi pada suhu 42 0

C dibawah kondisi mikroaerofilik. C. jejuni dalam media BHI Broth setelah inkubasi dapat disimpan pada refrigerator (suhu sekitar 4oC) selama 7 hari, atau dibuat pengawetan kultur.

Pengawetan isolat C. jejuni dapat dilakukan dengan cara membuat pengawetan kultur yaitu dengan memindahkan sebanyak 1,6 ml BHI Broth hasil inkubasi ke dalam tabung 5 ml yang berisi manik-manik dan 0,4 ml

gliserol 98% yang telah disterilkan terlebih dahulu, kemudian isolat C. jejuni tersebut dapat disimpan pada suhu beku (-20oC). Pengawetan kultur juga dapat dilakukan dengan langsung memindahkan 1-2 ose koloni positif C. jejuni yang berasal dari media mCCDA atau CBPA kedalam tabung 5 ml yang berisi manik-manik dan 0,4 ml gliserol 98% yang telah disterilkan dan telah ditambahkan 0.4 ml FBP atau Growth Factor Supplement

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. PROSES PENGAMBILAN SAMPEL (SAMPLING)

Sampel yang diteliti akan keberadaan Campylobacter jejuni dalam penelitian ini berupa karkas ayam bagian punggung sampai ekor. Hal ini berdasarkan literatur yang menyebutkan bahwa Campylobacter jejuni hampir 98% dapat diisolasi dari bagian karkas ayam. Sampel karkas ayam diambil secara acak dengan metode purposive sampling technique dari 2 wilayah yaitu Bogor dan Jakarta. Purposive sampling merupakan salah satu non probality sample yang tidak menghiraukan prinsip-prinsip probability. Pemilihan sampel tidak secara random dan hasil yang diharapkan merupakan gambaran kasar tentang suatu keadaan. Teknik purposive sampling ini dilakukan hanya atas dasar pertimbangan penelitinya saja yang menganggap unsur-unsur yang dikehendaki telah ada dalam anggota sampel yang diambil (Nasution, 2003).

Total sampel karkas ayam yang diteliti adalah 84 sampel; sebanyak 48 sampel diambil dari wilayah Bogor dan 36 sampel diambil dari wilayah Jakarta. Jumlah sampel masing-masing wilayah dapat dilihat pada Tabel 5.

Pengambilan sampel karkas ayam dari pasar tradisional dan pasar modern (supermarket) dimaksudkan untuk melihat perbandingan prevalensi cemaran Campylobacter jejuni pada karkas ayam di kedua jenis pasar tersebut. Data lengkap jumlah, nama pasar, lokasi pengambilan sampel dan hasil isolasi C. jejuni pada sampel karkas ayam dapat dilihat pada Lampiran 3 dan 4.

Tabel 5. Jumlah sampel di wilayah Bogor dan Jakarta

Wilayah

Jumlah Sampel

Total Pasar

Tradisional Pasar Modern

Bogor 24 24 48

Jakarta 18 18 36

Total 42 42 84

Pada pasar modern (supermarket), karkas ayam dijual dalam bentuk siap pakai, dengan dikemas dalam steroform dan ditutup dengan wraping plastic. Karkas ayam tersebut dikondisikan pada suhu rendah dengan

menggunakan refrigerator sehingga daging ayam lebih awet. Pada pasar tradisional, karkas ayam dapat diambil dari para pedagang daging ayam. Umumnya, karkas ayam dan bagian daging ayam yang lain ditata diatas meja tanpa pengkondisian suhu rendah, misalnya dengan penambahan es batu. Oleh para pedagang, karkas ayam harus habis terjual pada hari itu juga. Hal ini untuk menghindari proses pembusukan oleh mikroba, seperti Pseudomonas jika dilakukan penyimpanan untuk dijual di hari berikutnya. Penataan karkas ayam pada pasar tradisional tampak pada Gambar 5.

Gambar 5. Penataan karkas ayam dan bagian ayam yang lain di pasar Tradisional

Proses pengambilan sampel dilakukan dengan membeli 250 gram karkas ayam bagian punggung sampai ekor per sampel untuk sampel dari pasar tradisional dan satu paket potongan karkas ayam bagian punggung sampai ekor yang telah dikemas untuk sampel dari pasar modern (supermarket). Sampel ini kemudian dimasukkan ke dalam plastik steril yang telah disiapkan untuk mencegah terjadinya kontaminasi mikroba dari lingkungan. Dengan cara ini, diharapkan jumlah mikroba awal pada sampel karkas ayam dapat dipertahankan seperti kondisi awal saat sampel karkas ayam dibeli dari para pedagang selama proses pengambilan sampel. Sampel kemudian dibawa menggunakan cool box menuju laboratorium untuk dianalisis. Penggunaan Cool box suhu dingin bertujuan untuk mempertahankan jumlah mikroba awal, termasuk C. jejuni yang mungkin ada didalam sampel karkas ayam. Menurut Stern et al. (1992), C. jejuni lebih cepat mati pada suhu ruang (25oC) daripada suhu dingin pada cool box (sekitar 0-4oC). Selain itu, penggunaan Cool box suhu dingin juga bertujuan untuk memperlambat laju proses pembusukan akibat adanya mikroba pembusuk.

Untuk sampel wilayah Bogor, proses pengambilan sampel dilakukan secara bertahap berdasarkan kelompok lokasi pengambilan sampel. Hal ini dikarenakan terbatasnya kapasitas peralatan di laboratorium untuk analisis keberadaan C. jejuni pada sampel dengan jumlah sampel yang banyak. Kondisi ini memberikan nilai positif, yaitu sampel masih dalam keadaan segar saat dilakukan analisis. Selain itu, sampel karkas ayam yang diambil dari setiap kelompok lokasi pengambilan sampel di wilayah Bogor juga dapat langsung dianalisis keberadaan C. jejuni kurang dari 4 jam setelah sampel tersebut diambil dari para pedagang. .

Proses pengambilan sampel untuk wilayah Jakarta, hanya dilakukan sekali untuk 36 sampel. Hal ini disebabkan jarak dan butuh waktu yang lama untuk proses pengambilan sampel, sehingga tidak mungkin jika sampel diambil dalam jumlah kecil, bertahap dan langsung dilakukan analisis seperti halnya proses pengambilan sampel di wilayah Bogor. Proses pengambilan sampel di wilayah Jakarta sama seperti proses pengambilan sampel di wilayah Bogor, yaitu sampel yang dibeli dimasukkan kedalam plastik steril dan kemudian diletakkan didalam Cool box untuk dibawa ke laboratorium Sampel yang telah diambil tidak semuanya dianalisis pada hari yang sama. Untuk itu, dilakukan penyimpanan vakum terhadap sampel pada frezer bersuhu – 40 0C.

Proses pemvakuman terhadap sampel karkas ayam dimulai dengan memasukkan sampel karkas ayam kedalam plastik khusus vakum yang salah satu ujung plastiknya telah di-seal. Ujung plastik yang lain kemudian diletakkan pada bantalan karet alat pemvakum. Setelah itu, plate logam dari alat pemvakum diturunkan menuju ujung plastik yang berada diatas bantalan karet. Panas plate logam menyebabkan plastik ter-seal. Proses sealing ini, diawali dengan pengeluaran udara yang terdapat didalam plastik berisi sampel dengan bantuan penghisap vakum yang berada disekitar bantalan karet. Sehingga, disaat proses sealing selesai kondisi didalam plastik juga telah menjadi vakum. Proses pemvakuman sampel karkas ayam ini hanya memerlukan waktu tidak lebih dari 5 menit.

Sampel yang telah mengalami proses pemvakuman kemudian disimpan pada frezer bersuhu -40 0C. Kondisi vakum dikombinasikan dengan

suhu rendah dapat memperlambat metabolisme mikroba pada sampel, sehingga sampel dapat disimpan pada waktu yang cukup lama dengan kondisi yang tetap baik. Sampel karkas ayam tersebut mampu bertahan sampai beberapa minggu, sebelum dilakukan analisis keberadaan C. jejuni di laboratorium.

B. METODE ISOLASI CAMPYLOBACTER JEJUNI

Pada penelitian ini digunakan dua metode dalam isolasi Campylobacter jejuni. yaitu metode modifikasi I BAM 2001 dan metode modifikasi II BAM 2001. Kedua metode ini merupakan modifikasi dari metode standar isolasi C. jejuni berdasarkan BAM tahun 2001. Perbedaan tahapan-tahapan kedua metode isolasi C. jejuni dengan metode standar isolasi C. jejuni dapat dilihat pada Tabel 6.

Pada metode modifikasi I BAM 2001, dilakukan beberapa modifikasi terkait tahap persiapan sampel, dan tahapan plating. Menurut BAM (2001), pada tahap persiapan sampel, sampel karkas ayam dibilas menggunakan larutan BPW 0,1%. Hal ini bertujuan sebagai tahapan pra pengkayaan terhadap sampel yang akan dianalisis keberadaan C. jejuni.

Tabel 6. Perbedaan tahapan-tahapan kedua metode penelitian dengan metode standar isolasi C. jejuni BAM 2001

Metode Persiapan

sampel _Pengkayaan _Sentrifuse _Inkubasi Pengenceran

Plating Pengamatan Modifikasi I BAM 2001 Pembilasan / rinsing 150 gram sampel Enrichment dengan 50 ml Bolton Broth - 37 0C selama 2 jam, dan 42 0C selama 48 jam Tanpa pengenceran, Plating dengan teknik gores kuadran Katalase, mikroskop dengan pewarnaan sederhana Modifikasi II BAM 2001 Pembilasan / rinsing 150 gram sampel Pre-Enrichment dengan 50 ml BPW 0.1% dan Enrichment dengan 20 ml Bolton Broth Kecepatan putaran 7.000 x g (3.500 rpm) selama 20 menit 37 0C selama 2 jam, dan 42 0C selama 48 jam Tanpa pengenceran, Plating dengan teknik gores kuadran Katalase, mikroskop dengan pewarnaan sederhana BAM 2001 Pembilasan / rinsing 25 gram sampel Pre-Enrichment dengan 200 ml BPW 0.1% dan Enrichment dengan 100 ml Bolton Broth Dilakukan filtrasi kemudian disentrifuse dengan kecepatan putaran 16.000 x g (8.000 rpm) selama 15 menit 37 0C selama 4 jam, dan 42 0C selama 48 jam dengan shaking atau 52 jam tanpa shaking pengenceran 1:100 (0.1 ml kedalam 9.9 ml 0.1% Pepton Water), Plating dengan teknik tuang Mikroskop dengan preparat basah, pewarnaan gram

Namun, pada metode modifikasi I BAM 2001, larutan BPW 0,1% sebagai bahan pembilas digantikan dengan Bolton Broth, yang sebenarnya merupakan media pengkaya untuk pertumbuhan C. jejuni. Sehingga dapat dikatakan bahwa pada metode modifikasi I, tidak ada tahapan pra pengkayaan terhadap sampel yang akan dianalisis. Penggantian larutan pembilas BPW 0.1 % dengan Bolton Broth didasarkan pada penelitian sebelumnya (Abdi, 2007), yang menyatakan bahwa pembilasan dengan larutan BPW 0,1% atau langsung menggunakan Bolton Broth sebagai bahan pembilas sampel tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap hasil isolasi C. jejuni.

Selain itu, pada persiapan sampel dengan metode modifikasi I juga tidak dilakukan proses sentrifuse terhadap cairan bekas pembilasan sampel. Hal ini dilakukan karena diduga bakteri C. jejuni berada dalam jumlah yang cukup banyak pada sampel karkas ayam, sehingga tidak perlu dilakukan proses sentrifuse untuk mengkonsentrasikan bakteri yang ada pada cairan bekas pembilasan sampel karkas ayam tersebut.

Pada metode BAM 2001, sebelum plating, cairan hasil inkubasi diencerkan 1:100 (0.1 ml kedalam 9.9 ml 0.1% Pepton Water). Setelah itu sebanyak 1 ml dipindahkan secara aseptis kedalam cawan petri dan dilakukan penuangan dengan media agar isolasi yang telah dipersiapkan. Setelah media agar mengeras, maka dilakukan inkubasi pada suhu 42 0C selama 24 – 48 jam

Dalam dokumen Penentuan Prevalensi Cemaran Campylobacter Jejuni Sampel Potongan Karkas Ayam di Wilayah Bogor dan Jakarta Menggunakan Metode Modifikasi Bam 2001 (Halaman 51-75)