Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret-Mei 2011 di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Udang Uji dan Bakteri Probiotik
Udang uji yang digunakan pada penelitian ini adalah udang vaname L.
vannamei dengan berat rata-rata + 3,5 g. Udang dipelihara pada akuarium
berukuran 60x35x30 cm3 yang diisi air sebanyak 40 liter dengan kepadatan 10 ekor/akuarium selama 28 hari. Sebelum digunakan dalam perlakuan, udang diadaptasikan terlebih dahulu selama 7 hari dan diberikan pakan komersil dengan kadar protein 40% sebanyak 5 kali sehari. Bakteri probiotik yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri Vibrio alginolyticus SKT-b (Widanarni et al. 2003).
Produksi Prebiotik (Oligosakarida) Pembuatan tepung ubi jalar
Ubi jalar segar dibersihkan dan dikupas, lalu diiris dengan menggunakan pisau pada ketebalan ±1 mm. Setelah itu, ubi jalar tersebut dikeringkan dalam oven pengering suhu 550C selama 5 jam atau hingga irisan ubi jalar dapat dipatahkan dengan tangan. Irisan ubi jalar kemudian digiling dengan willey mill dan diayak 60 mesh. Tahapan dalam pembuatan tepung segar ubi jalar dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Tahapan pembuatan tepung ubi jalar.
Ekstraksi oligosakarida (Muchtadi 1989)
Sebanyak 500 gram tepung ubi jalar ditambahkan air dengan perbandingan 1:1 (w/v) dan dikukus pada suhu 1000C selama 30 menit. Hasil pengukusan tersebut dikeringkan dalam oven pada suhu 550C selama 18 jam. Tepung ubi jalar digiling dan disaring dengan ayakan hingga tepung kukus ubi jalar dapat terkumpul. Pada proses ekstraksi, sebanyak 100 gram tepung kukus ubi jalar disuspensikan ke dalam 1 L etanol 70% dan diaduk selama 15 jam menggunakan
magnetic stirer pada suhu ruang. Penyaringan dilakukan dengan menggunakan
kertas saring Whatman no.1 dan residu dibilas dengan menggunakan etanol 70%. Filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator vakum pada suhu 400C. Hasil pemekatan disentrifuse pada 5000 rpm selama 10 menit untuk mengendapkan kotoran, sehingga ekstrak mudah disterilisasi dengan kertas saring. Tahapan ekstraksi oligosakarida dapat dilihat pada Gambar 3.
Persiapan ubi jalar Pengupasan
Pengirisan
Pengeringan pada 550C, 5 jam
Penggilingan dengan willey mill Pengayakan dengan 60 mesh
Tepung segar ubi jalar 14
Gambar 3. Ekstraksi oligosakarida ubi jalar.
Pengukuran konsentrasi oligosakarida (total padatan terlarut)
Total padatan terlarut (TPT) diukur berdasarkan metode Apriyantono et al. (1989). Pengukuran TPT bertujuan untuk mengetahui kepekatan padatan terlarut prebiotik yang diperlukan pada pengujian in vivo. Cawan porselin dikeringkan selama 2 jam dalam oven bersuhu 1000C, kemudian didinginkan dalam desikator hingga diperoleh berat tetap. Cawan tersebut kemudian ditimbang (a gram). Sebanyak 1 ml oligosakarida yang diekstraksi dari ubi jalar ditempatkan dalam cawan porselen tersebut dan ditimbang (b gram). Kemudian dimasukan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu 1000C. Setelah kering, cawan didinginkan dalam desikator selama 10 menit atau hingga berat cawan stabil, kemudian cawan tersebut ditimbang (c gram). Total padatan terlarut dihitung dari hasil perbandingan berat ekstrak setelah dikeringkan dengan berat ekstrak sebelum dikeringkan. Rumus yang digunakan untuk menghitung TPT yaitu sebagai berikut:
Tepung kukus ubi Ekstraksi dengan etanol 70%
Pengadukan selama 15 jam Penyaringan
Pemekatan dengan evaporator vakum Sentrifuse
Penyaringan Ekstrak oligosakarida Tepung ubi jalar, dikukus pada
suhu 1000C selama 30 menit 15
TPT= x 100%
Keterangan: a = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida b = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida
c = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida dan dioven 24 jam
Perlakuan dan Rancangan Penelitian
Pengujian ini bertujuan untuk membandingkan efektivitas dari probiotik, prebiotik dan sinbiotik terhadap kelangsungan hidup, respon imun dan pertumbuhan udang vaname. Pengujian ini terdiri dari 5 perlakuan dan 3 kali ulangan sebagai berikut :
P0 (-) : Pemberian pakan tanpa penambahan probiotik dan prebiotik serta tidak diinfeksi bakteri V. harveyi (kontrol (-))
P0 (+) : Pemberian pakan tanpa penambahan probiotik dan prebiotik namun diinfeksi bakteri V. harveyi (kontrol (+))
P1 : Pemberian pakan dengan penambahan probiotik sebesar 1% (Wang 2007) dan diinfeksi bakteri V. harveyi
P2 : Pemberian pakan dengan penambahan prebiotik sebesar 2% (Mahious et
al 2006) dan diinfeksi bakteri V. harveyi
P3 : Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik (1% probiotik + 2% prebiotik) dan diinfeksi bakteri V. harveyi
Pelaksanaan Penelitian
Uji probiotik, prebiotik dan sinbiotik pada udang
Bakteri probiotik (SKT-b) dengan konsentrasi 106 CFU/ml sebanyak 1% dan prebiotik dengan TPT 5% (Marlis 2008) sebanyak 2% (Mahious et al. 2006) dicampurkan ke dalam pakan dengan menambahkan kuning telur sebesar 2% sebagai perekat. Pencampuran dilakukan dengan cara disemprotkan secara merata menggunakan spuit (Wang 2007), setelah itu pakan dikering-anginkan.
Pakan yang digunakan untuk pemeliharaan adalah pakan udang komersil dengan protein 40%. Udang diberi pakan 5 kali sehari pada pukul 06.00, 10.00, 14.00, 18.00 dan 22.00 WIB dengan Feeding Rate (FR) 10 % dari bobot biomassa. Pemberian pakan perlakuan dilakukan satu kali pada sore hari selama 16
14 hari masa pemeliharaan. Pada hari ke-15 udang dipuasakan dan selanjutnya pada hari ke-16 udang diuji tantang dengan injeksi V. harveyi 0,1 ml/ekor dengan konsentrasi 106 CFU/ml yang merupakan dosis LD50. Setelah di uji tantang, udang dipelihara selama 14 hari dan dilakukan pengamatan mengenai kematian udang. Parameter kualitas air yang diamati selama penelitian meliputi suhu, pH, DO dan amoniak (NH3). Parameter suhu diamati setiap hari, sedangkan DO, pH dan amoniak dilakukan 3 kali yaitu awal, tengah dan akhir penelitian. Untuk menjaga kualitas air pada wadah pemeliharaan, maka dilakukan penyiponan setiap hari sebanyak 10% dari total volume air tiap akuarium.
Parameter Pengamatan
Parameter yang diamati dalam penelitian meliputi tingkat kelangsungan hidup udang, jumlah bakteri dalam usus, parameter respon imun dan
pertumbuhan.
Kelangsungan hidup (survival rate)
Kelangsungan hidup udang diamati 2 minggu selama pemberian probiotik, prebiotik dan sinbiotik serta 2 minggu setelah uji tantang dengan bakteri patogen
V. harveyi. Tingkat kelangsungan hidup udang dihitung dengan menggunakan
rumus sebagai berikut:
Keterangan:
SR = Tingkat kelangsungan hidup
Nt = Jumlah udang yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No = Jumlah udang pada awal pengamatan
Populasi bakteri di usus
Populasi bakteri yang dihitung adalah total bakteri Vibrio dalam usus. Organ diambil dan ditimbang, lalu dimasukkan ke dalam larutan PBS dengan perbandingan 1:9. Selanjutnya, organ digerus sampai homogen dengan larutan PBS, lalu diambil sebanyak 0,1 ml dan dilakukan pengenceran bertingkat kemudian dituang dalam cawan petri dengan metode agar tuang pada media TCBS dengan 2 ulangan dan diinkubasi selama 24-48 jam. Pada media TCBS, koloni Vibrio SKT-b berwarna kuning sedangkan koloni V. harveyi berwarna hijau berpendar.
Respon Imun
Pengukuran parameter respon imun udang dilakukan sebanyak 9 kali yaitu hari ke 0, 7 dan 14 setelah perlakuan probiotik, prebiotik dan sinbiotik, serta pada jam ke-6, 12, 24, 72 dan 168 setelah uji tantang. Parameter respon imun yang diukur adalah total hemosit, diferensial hemosit, indeks fagositik dan aktivitas phenoloksidase.
Total hemosit (Blaxhall dan Daishley 1973)
Hemolim diambil sebanyak 0,1 ml dibagian pangkal kaki jalan ke 5 dengan syringe 1 ml yang sudah berisi antikoagulan Na-sitrat sebanyak 0,3 ml, kemudian dihomogenkan selama 5 menit. Tetesan pertama hemolim pada syringe dibuang, selanjutnya hemolim diteteskan ke haemositometer dan dihitung jumlah selnya per ml dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 kali. Total hemosit dihitung dengan menggunakan rumus :
!
Keterangan:
FP = Faktor Pengenceran
Diferensial hemosit (Martin dan Graves 1995)
Hemolim yang telah diambil dari udang uji diteteskan pada gelas objek dan dibuat ulasan, kemudian dikeringudarakan dan difiksasi dengan metanol 100% selama 5 menit. Setelah itu dikeringudarakan kembali dan diwarnai dengan larutan giemsa 10% selama 10 menit, dicuci dalam air mengalir selama 30 detik dan dibiarkan kering. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 kali dan dibedakan menurut jenisnya yaitu sel hialin, semi granular dan granular. Persentase jenis hemosit dihitung dengan menggunakan rumus :
! " # " $ %# "
Indeks fagositik (Anderson dan Siwicki 1993)
Hemolim 0,1 ml dimasukkan ke dalam mikroplate dan dicampur secara merata dengan 25 l bakteriV. harveyi dan diinkubasi selama 20 menit. Hemolim
sebanyak 5 l diteteskan pada gelas objek dan dibuat preparat ulas lalu 18
dikeringkan. Fiksasi dengan metanol 100% selama 5 menit dan diwarnai dengan giemsa selama 15 menit. Indeks fagositik diukur berdasarkan persentase sel-sel fagosit yang melakukan fagositosis. Indeks fagositik dihitung dengan menggunakan rumus :
&"' ( ) # * ( )# * ( ) " ( )
Aktivitas phenoloksidase (PO) (Liu dan Chen 2004)
Aktivitas phenoloksidase diukur berdasarkan formasi dopachrome yang dihasilkan oleh L-DOPA. Pengukuran PO dikerjakan berdasarkan prosedur yang dikemukakann oleh Liu dan Chen (2004). Pertama, 0,1 ml campuran hemolim ditambah 0,9 ml antikoagulan disentrifuse pada 1000 rpm selama 20 menit pada temperatur 4 0C. Kemudian supernatan dikeluarkan dan pellet disuspensikan kembali secara perlahan-lahan ke dalam larutan cacodylate-citrate buffer (0,01 M sodium cacodylate; 0,45 M sodium choride; 0,10 M trisodium citrate, pH 7) dan disentrifuse kembali. Pellet kemudian diambil dan disuspensikan dalam 200 µl cacodylate buffer (0,01 M sodium cacodylate; 0,45 M sodium choride; 0,01 M calcium chloride; 0,26 M magnesium chloride; pH 7). Setelah itu, 100 µl aliquot diinkubasi dengan 50 µl trypsin (1 mg/ml cacodylate buffer) sebagai aktifator selama 10 menit pada temperatur 25-26 0C. Selanjutnya ditambahkan 50 µl L-DOPA (3mg/ml cocadylate buffer), setelah 5 menit, ditambahkan 800 µl cacodylate buffer. Optical density (OD) diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Larutan standar mengandung 100 µl suspensi hemosit, 50 µl cacodylate buffer (pengganti trypsin) dan 50 µl L-DOPA digunakan untuk mengukur background aktivitas PO pada semua larutan uji. OD dari aktivitas PO pada semua kondisi uji dinyatakan sebagai formasi dopacrome dalam 50 µl hemolim.
Laju pertumbuhan harian (Specific Growth Rate)
Laju pertumbuhan harian dihitung dengan menggunakan formula dibawah ini (Huisman 1987):
+ ,-1 . 0. / 2 3
Keterangan :
SGR = Laju pertumbuhan harian (Specific Growth Rate) (%) Wt = Bobot rata-rata udang pada akhir perlakuan (g) Wo = Bobot rata-rata udang pada awal pemeliharaan (g) t = Periode pemeliharaan (hari)
Analisis Statistik
Penelitian ini menggunakan rancangan percobaan berupa Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari lima perlakuan dan tiga ulangan. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan program SPSS 17. Untuk melihat perbedaan perlakuan maka dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan pada selang kepercayaan 95%.