Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB; Laboratorium Imunologi Veteriner Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner dan Unit Pengelola Hewan Laboratorium, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB mulai September 2014 hingga Maret 2016.
Metode Penelitian Amplifikasi SCSMV dengan Teknik RT-PCR
Ekstraksi RNA total. Isolat SCSMV asal Pasuruan diperoleh dari koleksi Laboratorium Virologi Tumbuhan, Fakultas Pertanian, IPB. RNA total diisolasi dari 0.1 g daun terinfeksi SCSMV dengan metode Cethyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) (Doyle dan Doyle 1990). Sebanyak 1 g daun tebu yang menunjukkan gejala infeksi SCSMV digerus dengan nitrogen cair pada mortar steril, setelah itu ditambahkan 500 L bufer ekstraksi. Hasil gerusan dimasukan ke
dalam tabung mikro 2 mL dan diinkubasi pada suhu 65 oC selama 30 menit. Pada masa inkubasi, tabung dibolak-balik setiap 10 menit untuk membantu proses lisis. Sebanyak 500 L fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1) ditambahkan dan disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 mL dan ditambahkan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak 1x volume supernatan dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikro baru dan ditambahkan etanol 70 % sebanyak 1x volume supernatan. Tabung mikro disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm selama 5 menit. RNA total dikeringanginkan dan dilarutkan dalam 50 L bufer TE.
Sintesis cDNA. RNA hasil ekstraksi disintesis menjadi cDNA berdasarkan metode Damayanti et al. (2010). Premiks untuk sintesis cDNA dicampurkan pada tabung mikro yang terdiri atas 2.5 µL RNA total yang berfungsi sebagai cetakan, 1 µL 10 µM 3’-primer oligo d(T)20, 0.5 µL 10 mM dNTP (deoksi ribonukleotida triphosphat), dan air bebas nuklease ditambahkan hingga konsentrasi campuran 7 µL. Premiks didenaturasi selama 5 menit pada suhu 65 °C dan selanjutnya didinginkan pada es. Pada premiks selanjutnya ditambahkan 2 µL 5x RT bufer, 0.5 µL RNAse Inhibitor (40 U µL-1) (Ribolock, Thermo Scientific), 1 µL 50 mM DTT (dithiothreitol), dan 0.5 µL MMuLV (200 U µL-1) (Revertaid, Thermo Scientific), diinkubasi selama 1 jam pada suhu 42 °C dan selama 5 menit pada suhu 95 °C untuk inaktivasi enzim.
PCR. Amplifikasi dilakukan dengan total volume premiks PCR sebanyak 25
L yang terdiri atas 1 µL cDNA, 1 µL 10 µM primer forward, 1 µL 10 µM primer reverse, 12.5 µL Go Taq Green (Thermo Scientific), dan 9.5 µL air bebas nuklease. Primer forward SCSMV-BamF4 (5’
-AAGGATCCGGAGAGCAAGGAACACA-3’) dan primer reverse SCSMV-HindR3 (5’-TATAAGCTTTCAGTGCTGGGCG CG-3’) (Damayanti 2014, komunikasi pribadi) yang masing-masing disisipi situs
restriksi BamHI dan HindIII (garis bawah) digunakan untuk mengamplifikasi gen CP-SCSMV. Amplifikasi dilakukan berdasarkan metode Damayanti et al. (2010) menggunakan program predenaturasi pada 94 oC selama 5 menit dan dilanjutkan dengan program amplifikasi yang terdiri atas 35 siklus dengan tahapan denaturasi pada suhu 94 oC selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 47 oC selama 1 menit, dan pemanjangan DNA pada suhu 72 oC selama 2 menit. PCR diakhiri dengan tahapan ekstensi pada suhu 72 oC selama 30 menit. Waktu ekstensi selama 30 menit bertujuan memperpanjang poly-(A) pada ujung amplikon sehingga memperbesar peluang menempelnya amplikon pada vektor TA pada tahap kloning.
Visualisasi hasil PCR. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1% dalam 0.5x TBE. Sebanyak 5 L penanda DNA 1 kb (Thermo Scientific) dan 5 L
DNA hasil PCR masing-masing dimasukkan ke dalam sumur gel dan dielektroforesis selama 50 menit pada tegangan 50 V. Gel selanjutnya direndam pada 0.1% etidium bromida selama 15 menit dan air steril selama 5 menit. Gel kemudian divisualisasi di bawah UV transluminator.
Persiapan Sel Kompeten Escherichia coli
Sel kompeten merupakan sel bakteri yang digunakan dalam proses transformasi plasmid pada tahapan kloning (E. coli JM107) dan subkloning (E. coli BL21(DE3) dan Rosetta-gami(DE3)pLysS). Pembuatan sel kompeten dilakukan berdasarkan metode Sambrook dan Russel (2001). Ketiga strain E. coli masing-masing dikultur dalam 5 mL media LB dan diinkubasi bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam pada suhu 37 oC. Sebanyak 300 L hasil kultur ditambahkan ke dalam 60 mL media luria bertani (LB) dan diinkubasi bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC hingga nilai OD600 = 0.2-0.25. Hasil kultur kedua kemudian dipindahkan ke tabung mikro sebanyak 2 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet bakteri yang terbentuk diresuspensi dengan menggunakan 1 mL 50 mM CaCl2 dan diinkubasi di dalam wadah berisi es selama 30 menit. Setelah diinkubasi, bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Pelet diresuspensi dengan 50 mM CaCl2 20% gliserol sebanyak 50 µL. Suspensi tersebut disimpan di dalam lemari es suhu -80 oC untuk digunakan dalam proses transformasi.
Kloning Gen CP-SCSMV pada pTZ57R/T
Kloning merupakan teknik untuk menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro sehingga diperoleh molekul DNA rekombinan sesuai dengan yang diharapkan. Secara umum, tahapan kloning adalah ligasi, transformasi, dan konfirmasi transforman.
Ligasi. Ligasi merupakan proses penyambungan antara DNA vektor dan DNA sisipan dengan bantuan T4 DNA ligase. Vektor kloning yang digunakan adalah pTZ57R/T yang memiliki T-overhang (Gambar 2). Ligasi dilakukan mengikuti protokol InsTAclone PCR Cloning Kit, pembuat ligase dan plasmid pTZ57R/T (Thermo Scientific). Reaksi ligasi terdiri atas 3 µL DNA hasil amplifikasi PCR, 1 µL DNA vektor pTZ57R/T (55 ng L-1), 2 L 5x bufer ligasi,
1 L T4 DNA ligase (5 U L-1), dan ditambahkan ddH2O sampai mencapai volume akhir 10 L. Premiks ligasi kemudian diinkubasi pada suhu 4 oC selama 16 jam. Hasil ligasi pTZ57R/T dan CP-SCSMV selanjutnya disebut pTZ-SCSMV.
Gambar 2 Vektor kloning pTZ57R/T. a. Peta vektor kloning pTZ57R/T yang mengandung beberapa situs restriksi. b. Sisi penyisipan hasil PCR dan sikuen pada daerah multiple cloning site (MCS) pTZ57R/T (Thermo Scientific 2012)
Transformasi. Plasmid pTZ-SCSMV selanjutnya ditransformasi ke E. coli JM107 kompeten dengan metode perlakuan kejut panas (heat shock) berdasarkan Sambrook dan Russel (2001). Transformasi dilakukan dengan mencampur 2.5 L
plasmid rekombinan hasil ligasi dengan 50 L sel kompeten dan diinkubasi selama
15-30 menit pada es. Selanjutnya dilakukan perlakuan kejut panas pada suhu 42 °C selama 45-60 detik dan segera diinkubasi pada es selama 2 menit. Sebanyak 500
L medium SOC (2% tripton, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukosa) ditambahkan pada bakteri dan diinkubasi bergoyang 150 rpm selama 1 jam pada suhu 37 °C. Bakteri disentrifugasi
pada kecepatan 4000 rpm selama 3 menit. Sebanyak 400 L supernatan dibuang dan pelet dihomogenisasi dengan LB yang tersisa. E. coli JM107 yang ditransformasi pTZ-SCSMV ditumbuhkan dalam media LB agar yang mengandung
ampisilin 50 g mL-1 (LBA-ampisilin).
(a)
Konfirmasi Transforman. Konfirmasi transfoman dilakukan untuk menentukan koloni bakteri yang membawa plasmid rekombinan pTZ-SCSMV dengan teknik PCR koloni, isolasi plasmid, restriksi plasmid, dan perunutan basa nukleotida plasmid pTZ-SCSMV.
a. PCR Koloni
PCR koloni dilakukan dengan menggunakan sepasang primer yang digunakan saat amplifikasi awal gen CP-SCSMV dengan campuran reaksi sebagai berikut: 12.5 L Go Taq Green, 1 L 10 mM primer BamF4, 1 L 10 mM primer HindR3, dan ddH2O ditambahkan hingga volume 25 L. Selanjutnya koloni bakteri diambil dengan ujung tip dan dilarutkan pada larutan PCR koloni di atas. Replika dibuat untuk keperluan lebih lanjut dengan menggores ujung tip yang mengandung koloni bakteri pada LBA-ampisilin. Program amplifikasi PCR koloni dilakukan sesuai dengan program PCR saat amplifikasi DNA CP-SCSMV. Koloni yang diduga membawa plasmid rekombinan pTZ-SCSMV menghasilkan pita DNA berukuran ±850 pb.
b. Isolasi DNA Plasmid Rekombinan
Koloni bakteri yang diduga membawa plasmid pTZ-SCSMV diisolasi plasmidnya menggunakan Plasmid Miniprep Kit sesuai dengan prosedur yang direkomendasikan pembuatnya (Thermo Scientific). Satu koloni bakteri diinokulasi ke dalam 3 mL LBA-ampisilin dan diinkubasi bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam pada suhu 37 °C. Kultur bakteri selanjutnya dipindahkan ke tabung mikro 1.5 mL dan disentrifugasi pada 8000 rpm selama 2 menit. Sentrifugasi dilakukan 2 kali untuk 3 mL kultur bakteri. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, ditambahkan 250 µL resuspension solution yang mengandung 1% RNAse, dan
divorteks hingga homogen. Pada larutan ditambahkan 250 L lysis solution dan tabung dibolak-balik secara hati-hati sebanyak 6 kali. Langkah selanjutnya adalah
penambahan 350 L neutralization solution dan tabung dibolak-balik secara hati-hati sebanyak 6 kali. Sampel disentrifugasi pada 12 000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke column lalu disentrifugasi kembali pada 13 000 rpm selama 2 menit. Cairan pada collection tube dibuang, lalu ditambahkan 500 L
wash solution ke column dan disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 2 menit. Tahapan ini diulang sebanyak 2 kali. Cairan pada collection tube dibuang, kemudian column disentrifugasi kembali dengan keadaan kosong pada 13 000 rpm selama 2 menit. Column dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 mL dan dielusi dengan 50 L bufer elusi. Tabung didiamkan selama 2 menit pada suhu kamar dan disentrifugasi pada 13 000 rpm selama 3 menit. DNA hasil isolasi plasmid disimpan pada suhu -20 °C sampai DNA tersebut siap untuk digunakan.
c. Perunutan Basa Nukleotida pTZ-SCSMV
Plasmid pTZ57R/T yang menunjukkan hasil positif pada koloni PCR dan isolasi DNA plasmid rekombinan dikirim untuk perunutan basa nukleotida ke First Base, Malaysia menggunakan M13/pUC sequencing primer (-20) (5’ -GTAAAACGACGGCCAGT-3’) dan M13/pUC reverse sequencing primer (-26) (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’). Perunutan nukleotida plasmid pTZ-SCSMV dimaksudkan untuk menentukan klon yang akan digunakan pada tahapan selanjutnya dengan memastikan bahwa pada plasmid telah tersisipi gen CP-SCSMV dan memastikan sikuen gen CP-CP-SCSMV yang akan digunakan. Hasil perunutan nukleotida juga digunakan untuk analisis kesejajaran dengan sikuen nukleotida CP-SCSMV yang telah dideposit pada GenBank menggunakan program
Basic Local Alignment Search Tools (BLAST). Analisis tingkat homologi sikuen nukleotida dan asam amino diperoleh dengan program Clustalw multiple alignment dan sequences identity matrix menggunakan perangkat lunak Bioedit versi 7.05. Klon CP-SCSMV yang utuh; tidak ditemukan delesi atau mutasi titik dalam gen CP-SCSMV, dipilih untuk digunakan pada tahap subkloning ke vektor ekspresi pET-28a.
Subkloning Gen CP- SCSMV pada pET-28a
Tahapan subkloning secara garis besar sama dengan tahapan kloning yaitu ligasi, transformasi, dan konfirmasi transforman. Vektor ekspresi yang digunakan pada tahapan subkloning adalah pET-28a (Novagen) (Gambar 3). Sebelum ligasi dilakukan restriksi pada vektor ekspresi pET-28a dan plasmid pTZ-SCSMV masing-masing menggunakan BamHI dan HindIII. Campuran restriksi terdiri atas 18 L plasmid pTZ-SCSMV atau pET-28a, 6 L enzim BamHI (10 U L-1), 3 L enzim HindIII (10 U L-1), 6 L 10x bufer BamHI, dan ditambahkan air bebas nuklease hingga volume 60 L. Suspensi restriksi ditingkatkan menjadi 6 kali reaksi untuk mengoptimalkan jumlah DNA yang diperoleh. Campuran restriksi diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC dan dielektroforesis pada 1% gel agarosa selama 50 menit dengan tegangan 50 V. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV transluminator. DNA pada gel agarosa yang sesuai dengan ukuran CP–SCSMV dan pET-28a masing-masing dipotong dan diekstraksi menggunakan Gel/PCR DNA fragment extraction kit sesuai dengan yang direkomendasikan pembuatnya (Genaid).
Gambar 3 Vektor ekspresi pET-28a (Novagen 1998). Tanda panah tebal ( ) menunjukkan daerah multiple cloning site (MCS), Kan: resisten terhadap antibiotik kanamisin, ori: titik awal replikasi plasmid.
Ligasi dilakukan dengan mencampurkan 3 L CP-SCSMV hasil ekstraksi, 1 L pET-28a hasil ekstraksi, 1 L enzim T4 DNA ligase, 2 L 5x bufer ligasi, dan 3 L ddH2O. Ligasi dilakukan pada suhu 4 oC selama 16 jam dan menghasilkan pET-28a yang tersisipi gen CP-SCSMV (pET-SCSMV). Hasil ligasi selanjutnya ditransformasi dengan metode kejut panas (heat shock) ke E. coli BL21(DE3) dan Rosetta-gami(DE3)pLysS dan ditumbuhkan pada media LB agar yang mengandung kanamisin 25 µg mL-1 (kanamisin). Koloni yang tumbuh pada media LBA-kanamisin selanjutnya di PCR koloni dengan menggunakan primer SCSMV-BamF4 dan SCSMV-HindR3. Koloni bakteri yang positif mengandung CP-SCSMV yang ditandai dengan teramplifikasinya DNA berukuran ±850 pb selanjutnya digunakan untuk ekspresi gen CP-SCSMV. Analisis asam amino yang terbentuk dari fusi protein pET-SCSMV dilakukan menggunakan Server Expasy Proteomic.
Ekspresi Gen CP-SCSMV pada Bakteri Ekspresi
Optimasi Ekspresi Gen CP-SCSMV. Bakteri E. coli BL21(DE3) dan Rosetta-gami(DE3)pLysS yang positif membawa plasmid rekombinan pET-SCSMV masing-masing diinokulasi ke dalam 3 mL media cair LB-kanamisin. Biakan diinkubasi bergoyang pada 150 rpm selama 16 jam pada suhu 37 oC. Setelah inkubasi, sebanyak 1% biakan bakteri diinokulasi ke media cair LB-kanamisin dan diinkubasi pada suhu 37 oC pada shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm hingga mencapai OD600 = 0.5-0.7.
Optimasi kultur ekspresi dilakukan terhadap 3 faktor yaitu konsentrasi IPTG (0.25, 0.5, 0.75, 1 mM), suhu inkubasi (25, 30, 37 oC), dan waktu panen bakteri (3,
6, λ, 12, 18 jam) setelah diinduksi IPTG. Sebanyak 3 L bakteri dipeletkan dengan
disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit.
Analisis SDS-PAGE. Analisis SDS-PAGE dilakukan untuk mengetahui kondisi optimum ekspresi CP-SCSMV berdasarkan ketebalan pita protein sesuai berat molekul fusi protein CP-SCSMV dan vektor pET-28a. SDS-PAGE dilakukan berdasarkan prosedur Laemmli (1970) dengan menggunakan Vertical Gel Electrophoresis System model V-16-2. Pada SDS-PAGE digunakan 2 jenis gel yaitu separating gel dan stacking gel (Tabel 1). Separating gel 12.5% dimasukkan pada cetakan gel. Setelah separating gel membeku maka stacking gel 4% dituang di atas separating gel yang sudah membeku dan stacking gel ditunggu sampai membeku. Setelah stacking gel membeku, gel dipindahkan ke dalam alat elektroforesis.
Tabel 1 Komposisi gel SDS-PAGE (Sambrook dan Russel 2001)
Bahan Separating gel 12.5%
( L) Stacking Gel ( L) H2O 12 000 7200 Tris HCl 1.5 M SDS 0.4% pH 8.8 9 000 - Tris HCl 0.5 M SDS 0.4% pH 6.8 - 3000 Akrilamid 30% 15 000 1800 TEMED (tetramethylethylenediamine) 20 20 Amonium persulfat 10% 170 45
Penyiapan sampel dilakukan dengan meruspensikan pelet bakteri dengan bufer lisis pH 8.0 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol) dan diinkubasi bergoyang pada kecepatan 150 rpm selama 30 menit. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit dan dipisahkan antara pelet bakteri (insoluble) dan supernatan (soluble). Fraksi insoluble dilarutkan dengan 500 L bufer sampel (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 0.002 % bromophenol blue, 5% β-merkaptoetanol, 10% gliserol), dan fraksi soluble dicampur dengan 1x bufer sampel. Fraksi insoluble, soluble, dan penanda protein unstained (Thermo Scientific) didenaturasi pada suhu 95 oC selama 10 menit, didinginkan pada es, dan dimasukkan pada sumuran gel. Elektroforesis dilakukan menggunakan Bio-Rad power pac 300 selama 4 jam pada tegangan 150 V.
Pewarnaan gel dilakukan menggunakan PageBlueTM Protein Staining Solution (Thermo Scientific). Tahap awal dilakukan dengan meletakkan gel pada wadah dan ditambah 100 ml akuades steril. Gel dipanaskan di microwave selama 1 menit. Gel selanjutnya diagitasi selama 4 menit dan akuades sisa pencucian dibuang. Tahap ini diulang sebanyak 3x. Sebanyak 20 mL PageBlueTM Protein Staining Solution selanjutnya dituang pada wadah gel dan di-microwave selama 30 detik. Gel diagitasi selama 30 menit. Setelah itu gel dicuci kembali dengan akuades steril hingga pita protein tampak jelas.
Purifikasi Protein CP-SCSMV. Protein hasil ekspresi yang paling baik dipurifikasi untuk digunakan sebagai antigen. Purifikasi protein CP-SCSMV dilakukan pada kondisi denaturing menggunakan nickel nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) spin column dengan metode yang direkomendasikan pembuatnya (Qiagen).
Sebanyak 5 mL sel bakteri dicairkan selama 15 menit dan dilisiskan dengan 700 L
bufer B-7M urea (7 M urea, 0.1 M NaH2PO4, 0.01 Tris HCl, pH 8) dan ditambahkan dengan 15 U benzonase®nuclease, kemudian sel diinkubasi dengan agitasi selama 15 menit pada suhu ruang. Suspensi bakteri disentrifugasi pada 12 000 rpm selama 30 menit pada suhu ruang dan supernatan diambil untuk analisis SDS-PAGE. Ni-NTA spin column diekuilibrasi dengan 600 L bufer B-7M urea dan
disentrifugasi pada kecepatan 2λ00 rpm selama 2 menit. Sebanyak 600 L
supernatan hasil lisis dimasukkan pada Ni-NTA spin column yang telah diekuilibrasi dan disentrifugasi pada kecepatan 1600 rpm selama 5 menit. Cairan yang melewati column diambil untuk analisis SDS-PAGE. Sebanyak 600 L bufer
C (8 M urea, 0.1 M NaH2PO4, 0.01 Tris HCl, pH 6.3) dimasukkan pada Ni-NTA spin column untuk proses pencucian dan disentrifugasi pada 2900 rpm selama 2 menit. Pencucian ini dilakukan sebanyak dua kali. Protein pada column kemudian dielusi masing-masing dengan menggunakan 2 jenis bufer elusi yaitu bufer E (8 M urea, 0.1 M NaH2PO4, 0.01 Tris HCl, pH 4.5) dan bufer elusi dengan penambahan 500 mM imidazol (bufer C dengan 500 mM imidazol). Elusi dilakukan dengan
menambahkan 200 L bufer elusi pada column dan disentrifugasi pada 2900 rpm selama 2 menit sehingga diperoleh protein SCSMV.
Produksi Antiserum SCSMV
Tahapan umum dalam produksi antiserum adalah perlakuan imunisasi, pengumpulan darah, dan pengumpulan serum.
Imunisasi. Dua ekor kelinci betina strain New Zealand diimunisasi dengan antigen CP-SCSMV masing-masing dengan dosis antigen 150 g/ekor. Imunisasi dilakukan sebanyak 4 kali dengan selang waktu 3 minggu. Antigen pada imunisasi
pertama ditambah adjuvan Freund lengkap (Freund’s complete adjuvant) dengan perbandingan 1:1. Antigen pada imunisasi kedua dan ketiga ditambah adjuvan Freund tak lengkap (Freund’s incomplete adjuvant) dengan perbandingan 1:1. Imunisasi dengan adjuvan disuntikkan pada subkutan yaitu area bawah kulit pada lapisan lemak. Imunisasi keempat dilakukan tanpa menggunakan adjuvan dan disuntikkan pada daerah intravena yaitu pada pembuluh vena auricularis pada telinga kelinci.
Pengambilan Darah. Darah kelinci diambil sebanyak 1.5-2 mL melalui pembuluh vena auricularis dengan menggunakan disposable syringe 3 mL. Pengambilan darah dilakukan setiap dua minggu setelah imunisasi untuk mengecek titer antiserum. Pengambilan akhir darah kelinci dilakukan seminggu setelah imunisasi keempat yaitu pada saat titer antiserum SCSMV telah tinggi pada serum darah.
Pengumpulan Serum. Darah yang diambil dari kedua kelinci, diinkubasi pada suhu ruang hingga darah membeku dan serum darah telah terbentuk. Serum darah disentrifugasi pada kecepatan 2000 rpm selama 10 menit, dipisahkan, dan disimpan pada suhu 20 oC
Purifikasi Antiserum. Serum yang dihasilkan dimurnikan menggunakan metode presipitasi dengan amonium sulfat jenuh menurut Hampton et al. (1990). Amonium sulfat ditambahkan pada serum hingga konsentrasi akhir 40% dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu 4 oC. Campuran serum disentrifugasi pada kecepatan 3800 rpm selama 30 menit sehingga terbentuk supernatan dan presipitat. Presipitat selanjutnya diresuspensi pada PBS 0.01M sebanyak 0.4x volume awal serum. Campuran serum kemudian didialisis dalam PBS 0.01M pH 7.0 sebanyak 100x volume serum pada suhu 4 oC dengan 3 kali penggantian PBS setiap 6 jam.
Konsentrasi protein dalam serum yang menunjukkan konsentrasi antiserum dapat diketahui dengan mengukur nilai absorbansi pada panjang gelombang 280 nm. Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan nanodrop.
Pengujian Antiserum SCSMV
Antiserum yang dihasilkan diuji dengan metode serologi AGPT, I-ELISA, dan DBIA.
Agarose Gel Precipitation Test (AGPT). Reaksi antigen-antibodi pada AGPT dilakukan pada media 1% gel agarosa (Sigma, USA). Gel dibuat dengan melarutkan 0.1 g agarosa, 0.01 g natrium azida dalam 5 mL phosphate bufer saline (PBS) pH 7.2 dan 5 mL akuabides yang dipanaskan dalam microwave selama 1 menit. Agarosa cair tersebut kemudian dituangkan di atas kaca preparat setebal sekitar 2 mm dan dibiarkan pada suhu ruang sampai memadat. Setelah gel agarosa memadat, selanjutnya dibuat lubang-lubang pada gel agarosa tersebut dengan menggunakan cetakan (puncher) yang terdiri atas tujuh lubang berbentuk heksagonal. Suspensi antigen disiapkan dengan menggerus 0.1 gram daun tebu yang positif terserang SCSMV dalam 1x PBS dengan perbandingan 1:10 (b/v). Antigen berupa protein CP-SCSMV murni hasil purifikasi juga digunakan sebagai pembanding. Masing-masing antigen dan antiserum dimasukkan ke dalam lubang pada gel agarosa sebanyak 25 L dan. Gel agarosa tersebut kemudian diinkubasi selama 24−48 jam pada tempat yang lembab dan suhu ruang. Pengamatan terhadap terbentuknya garis presipitasi reaksi antigen-antibodi pada media gel agarosa diamati setiap hari dan didokumentasikan.
Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (I-ELISA). Pada metode ini dilakukan pengenceran antiserum 1:100, 1:250, 1:500, 1:750, 1:1000, dan 1:2000, dan juga dilakukan pengenceran cairan perasan tanaman sakit:bufer (b/v) yaitu 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, dan 1:1000. Sampel tanaman tebu sebagai antigen digerus dalam bufer coating [1.59 g Na2CO3, 0.293 g NaHCO3, 0.20 g NaN3, 20 g polyvinylpyrrolidone (PVP) dalam 1 L air steril, pH 9.6]. Sebanyak 100 L cairan
perasan diisi ke dalam sumuran ELISA dan diinkubasi semalam pada suhu 4 ºC. Setelah itu, plat dicuci sebanyak 4-8 kali dengan phosphate buffer saline Tween-20 (PBST) [8 g NaCl, 2 g KH2PO4, 1.15 g Na2HPO4, 0.2 g KCl 0.5 ml, Tween 20 yang dilarutkan dalam 1 L air steril, pH 7.4]. Sebanyak 100 L antiserum rekombinan CP-SCSMV yang telah dilarutkan dalam bufer conjugate [2 g bovine serum albumin, 20 g PVP, 0.2 g NaN3 dalam 1 liter air steril, pH 7.4] diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2 jam dan dicuci dengan PBST sebanyak 4-6 kali. Tiap sumuran selanjutnya diisi dengan 100 L antiserum goat anti rabbit-IgG alkaline phosphatase yang telah dilarutkan dalam bufer conjugate dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2 jam. Sumuran ELISA selanjutnya dicuci 4-6 kali dengan PBST. Setelah itu, tiap sumuran diisi dengan 100 l substrat p-nitrofenilfosfat (PNP). Setiap 1 tablet PNP (5 mg) dilarutkan dalam 5 mL bufer PNP [97 mL dietanolamin, 0.2 g NaN3, 0.1 g MgCl2 dalam 1 L air steril, pH 9.8] dan diinkubasi pada suhu ruang hingga terjadi perubahan warna menjadi kuning. Hasil ELISA dibaca secara kuantitatif dengan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Sampel dinyatakan positif jika nilai absorbansi ELISA (NAE) sampel uji 2 kali kali lebih besar dibandingkan dengan kontrol negatif (tanaman sehat).
Dot Blot Immunobinding Assay (DBIA). Reaksi antigen-antibodi pada DBIA berdasarkan prosedur yang digunakan Mahmood et al. (1997) dilakukan pada membran nitroselulosa.Tanaman tebu yang sehat, tanaman tebu terinfeksi SCSMV dan SCMV masing-masing digerus dengan menggunakan 1x tris buffer saline (TBS) (0.02 M Tris HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.5) dengan perbandingan 1 : 10. Cairan perasan tanaman selanjutnya diteteskan pada membran dan diinkubasi pada suhu ruang hingga cairan perasan terserap sempurna pada membran. Membran selanjutnya diblocking dengan larutan TBS yang mengandung skim milk 2% dan Triton X-100 2%, diinkubasi bergoyang pada 150 rpm selama 2 jam. Selanjutnya membran dicuci dengan direndam dalam akuades dan diinkubasi bergoyang selama 5 menit. Pencucian diulang sebanyak 5 kali. Membran kemudian direndam dalam antiserum rekombinan SCSMV yang dilarutkan pada TBS yang mengandung skim milk 2% dan dinkubasi bergoyang selama 2 jam. Pengeceran antiserum yang digunakan adalah 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, dan 1:10 000. Setelah itu, membran dicuci dengan tris buffer saline Tween-20 (TBST) (TBS + 0.05% tween 20) selama 5 menit dan diulang sebanyak 5x. Membran selanjutnya direndam pada antiserum goat anti rabbit-IgG alkaline phosphatase yang dilarutkan pada TBS + skim milk 2% perbandingan 1:5000. Membran dicuci dengan TBST selama 5 menit dan diulang sebanyak 5x. Selanjutnya dilakukan pewarnaan dengan merendam membran dalam substrat nitro blue tetrazolium (NBT) 75 mg mL-1 dan bromo chloro indolyl phosphate (BCIP) 50 mg mL-1 yang dilarutkan dalam bufer alkalin fosfatase (0.1 M Tris HCl, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl2). Reaksi positif SCSMV ditandai dengan perubahan warna sampel di membran menjadi ungu.
