BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
L. Metode Uji Anti-inflamasi
Metode yang digunakan untuk uji daya anti-inflamasi dalam penelitian ini adalah metode radang telapak kaki oleh Langford dkk (1972) yang telah dimodifikasi. Dasar metode ini adalah dengan membuat udema pada telapak kaki belakang mencit menggunakan karagenin 1%, kemudian kaki dipotong pada sendi
torsocrural dan ditimbang. Persentase efek anti-inflamasi dapat dihitung dari perubahan berat kaki hewan uji. Beberapa metode uji anti-inflamasi lainnya yaitu :
1. Uji eritrema
Pada uji ini sebaiknya digunakan mencit putih. Iritan yang digunakan untuk membentuk eritrema atau udema antara lain : minyak kroton, ester-ester phorbol terisolasi, asam arakhidonat,. Dan etil fenil propionat yang masing-masing dilarutkan dalam aseton. Antagonis yang digunakan adalah ekstrak tumbuhan dan sebagai antagonis pembanding dapat dipakai indometasin, quersetin, hidrokortison, mepyramin, thianizole, atau propanolol. Metode ini
diawali dengan mengelompokkan hewan uji, tiap kelompok terdiri dari 5-7 ekor dan tiap kelompok mewakili tiap peringkat dosis. Ekstrak tanaman atau bahan anti radang diberikan pada ujung telinga menggunakan mikropipet 15 menit sebelum diberika iritan (pada area yang sama). Eritrema pada telinga tikus merupakan percobaan yang paling mudah dilakukan pada mencit yang mempunyai telinga yang transparan dimana kemerahan akan terlihat jelas. Penilaian eritrema dilakukan dengan pengamatan pada telinga mencit. Jika terjadi eritrema secara nyata diberi tanda ++, ringan +, dan jika tidak ada 0, sedangkan penilaian udema dilakukan dengan pemotongan salah satu telinga, kemudian ditimbang dan diukur ketebalannya (Williamson, Okpako, Evans, 1996). Keuntungan dari uji ini adalah sederhana tapi membutuhkan latihan bagi penggunanya untuk menggunakan fotometer refleksi dengan tujuan untuk menghilangkan penilaian subjektif (Vogel, 2002).
2. Radang telapak kaki belakang
Pada metode ini induksi udem dilakukan pada kaki hewan percobaan yaitu tikus jantan atau betina, dengan cara penyuntikan suspensi karagenin secara sublantar pada telapak kaki kiri bagian belakang. Ukuran udema kaki diukur dengan alat plestimometer segera setelah injeksi. Aktivitas anti-inflamasi obat ditunjukkan oleh kemampuannya mengurangi udem yang diinduksi pada kaki tikus (Vogel, 2002).
Metode uji udema dilakukan pada kaki tikus atau mencit. Bahan peradang yang digunakan adalah karagenin 1% dalam NaCl 0,9% b/v dengan volume 1 ml untuk tikus dan 0,05 ml untuk mencit. Selain karagenin dapat juga
digunakan capsaicin dalam 10% etanol atau 10% tween 80 atau 0,9 salin, dextrin 6% b/v dalam gom akasia 2% b/v dan kaolin 5% yang disuspensikan dalam 0,9% salin atau 2% gom akasia. Tetapi bahan peradang yang sering digunakan adalah karagenin. Metode ini dilakukan dengan cara hewan uji dibagi dalam kelompok yang terdiri dari 6-8 hewan uji. Ekstrak tanaman yang diuji dan antagonis yang dipilih diberikan 1 jam sebelum bahan peradang. Penghambatan udema pada kaki digunakan sebagai ukuran dari aktivitas anti-inflamasi. Udema dibentuk dengan injeksi agonis secara subplantar dari kaki kanan belakang. Volume kaki diukur pada selang waktu 1 selama 5 jam. Udema digambarkan sebagai penungkatan rata-rata volume kaki secara berarti dibandingkan dengan kontrol pelarut, penghambtan digambarkan dengan persen peningkatan atau penurunan volume udema. Pada mencit pengukuran dilakukan dengan mengorbankan hewan uji lalu memotong kaki belakang pada pergelangannya, kemudian udema diukur dengan membandingkan volume kaki yang dibengkakkan dengan kaki yang tidak diudemkan (Williamson dkk, 1996).
Reaksi inflamasi yang diinduksi karagenin mempunyai dua fase: fase awal dan akhir. Fase awal berakhir setelah 60 menit dan dihubungkan dengan pelepasan histamin, serotonin, dan bradikinin. Fase akhir terjadi antara 60 menit setelah injeksi dan berakhir setelah tiga jam. Fase ini dihubungkan dengan pelepasan prostaglandin dan neutrofil yang menghasilkan radikal bebas, seperti hidrogen peroksida, superoksida, dan radikal hidroksil (Suleyman, Demircan, Karagoz, Ozta, Suleyman, 2004).
3. Tes granuloma
Hewan uji berupa tikus betina atau jantan galur SD yang dicukur punggungnya dan diinjeksi secara subkutan dengan 20 ml udara, kemudian diinjeksi 0,5 ml campuran minyak kroton dengan minyak wijen sebagai senyawa iritan yang merangsang pembentukan udema. Hari kedua setelah terbentuk kantong, udara dihampakan dan hewan diinjeksi larutan uji atau larutan standar (Vogel, 2002). Empat sampai empat belas hari setelahnya respon inflamasi dievaluasi dengan dasar volume cairan yang diambil dari kantung sama seperti berat dan tebal dinding kantung (Gryglewski, 1977).
Model percobaan ini lebih selektif untuk uji obat antiinflamasi golongan steroid daripada nonsteroid. Sebagai iritan dapat digunakan larutan minyak kroton, turpentin, mikrobakterial tambahan, fosfolipase A2 atau karagenin. Analisis dilakukan berdasarkan volume dan bobot cairan yang terbentuk serta tebalnya dinding kantong (Bonta, 1977).
4. Radang sendi
Hewan uji yang digunakan adalah tikus galur Charles Foster dengan berat badan 120-180 gram dan mencit galur Swiss dengan berat badan 18-26 gram. Hewan uji diinjeksi sublantar susupensi yang mengandung 0,5%
mycobacterium tuberculosis mati disuspensikan dalam 0,5% b/v dalam parafin cair secara intradermal pada kaki belakang (0,5 ml untuk tikus dan 0,025 ml untuk mencit). Pemberian obat untuk anti-inflamasinya sudah diberikan satu hari sebelum injeksi bahan penginduksi dan dilanjutkan maksimal sampai 28 hari untuk memberikan informasi tentang perkembangan arthritis dan pengobatan
kronik. Untuk mengetahui adanya radang dilihat saat benjolan muncul (biasanya pada hari ke-13), kemudian diukur volumenya menggunakan metode pemindahan seperti pada metode uji pembentukan udema. Ekstrak tanaman yang diuji disuspensikan dalam gom akasia atau pada pelarut lain yang sesuai (Williamson dkk, 1996).
5. Tes radang selaput dada (pleurisy)
Radang selaput dada dikenal sebagai fenomena inflamasi eksudatif pada manusia (Vogel, 2002). Radang selaput dada pada tikus dapat disebabkan injeksi intrapleural dari turpentine, evans blue, gum arab, glikogen, dekstran, perak nitrat, atau karagenin. Pada waktu tertentu setelah injeksi iritan hewan uji dibunuh dan eksudat dipindahkan, lebih baik dengan mencuci rongga dada dengan sejumlah larutan Hank’s yang diketahui volumenya untuk memastikan didapatnya eksudat dan sel utuh yang lengkap (Gryglewski, 1977). Radang selaput dada yang disebabkan karagenin dipertimbangkan sebagai model inflamasi akut yang paling sempurna dimana keluarnya cairan, migrasi leukosit, dan parameter biokimia lain yang ada dalam respon inflamasi dapat diukur dengan mudah dari eksudat (Vogel, 2002).
6. Uji permeabilitas pembuluh darah
Uji ini menggunakan hewan uji tikus jantan Sprague-Dawley dengan berat badan antara 160 – 200 gram. Sisi ventral pada tikus dicukur. Sebanyak 5 ml/kg larutan Evan’s blue 1% diinjeksikan secara intravena pada tikus. Satu jam kemudian tikus diobati dengan senyawa uji secara peroral atau intrapertonial atau dengan bahan pembawa. Untuk masing-masing kelompok uji dan kontrol
digunakan 10 tikus. Tiga puluh menit kemudian, tikus disuntik anestesi dengan eter dan 0,05 ml dari 0,01% larutan senyawa 48/80 diinjeksikan secara intrakutn pada 3 sisi pada kedua bagian kiri dan ventral. Sembilan puluh menit setelah injeksi senyawa 48/80, tikus dikorbankan dengan anestesi eter. Kulit abdominal pada tikus dihilangkan dan daerah yang merembes dari kulit diukur.
Diameter dari daerah perembesan diukur pada skala milimeter dalam dua arah tegak lurus dan nilai rata-rata pada semua sisi injeksi pada satu tikus dapat diukur. Selanjutnya dilakukan perhitungan persen penghambatan pada kelompok perlakuan dibandingkan dengn kelompok kontrol. Kelompok perlakuan yang menunjukkan nilai kurang dari 50% dari kelompok kontrol dapat disimpulkan positif. Nilai ED50 pada kelompok ini dapat dihitung (Vogel, 2002).
7. Penghambatan adhesi leukosit terhadap venula mesenterik tikus
Pada uji ini menggunakan hewan uji tikus Sparague-Dawley. Keseimbangan leukosit menuju endothelium, mmebran dasar dan permukaan lain merupakan peristiwa penting pada pembentukan inflamasi. Leukosit tersebut masuk ke dalam jaringan dengan dikontrol oleh interaksi dinamis antara molekul adhesi yang diperlihatkan oleh sel dan endothelium. Sel darah putih yang beredar dalam darah memiliki kecenderungan untuk menempel pada dinding pembuluh darah, dengan terjadinya inflamasi kecenderungan ini semakin meningkat. Adhesi leukosit pada dinding pembuluh darah diinduksi secara buatan oleh penggunaan formyl-methionyl peptide fMet-Leu-Phe (FMLP). Formyl peptide dilepaskan dari bakteri dan mitokondria pada jaringan yang rusak sehingga peptida menyediakan sinyal khusus sebagai penanda adanya serangan bakteri atau terjadinya kerusakan
jaringan. Densitas dari reseptor FMLP di antara 104 hingga 105 per sel, tergantung pada tipe sel. Aktivasi leukosit melalui reseptor ini menghasilkan perubahan bentuk L-selectin (LECAM-1) yang cepat pada permukaan sel yang menyebabkan sel berputar-putar sepanjang permukaan endothelial. LECAM-1 lepas dari permukaan leukosit dengan sangat cepat, dan integrin mengatur adhesi dan migrasi berikutnya menuju jaringan (Vogel, 2002).
8. Edema telinga terinduksi oksazolon pada mencit
Pada uji ini menggunakan hewan uji mencit jantan atau mencit betina dengan berat badan 25 gram. Sebelum mencit digunkan, terlebih dahulu menyiapkan larutan oxazolone (4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one) dalam aseton 2% yang dibuat baru. Mencit dirangsang dengan menggunakan 0,1 ml pada kulit abdominal yang dicukur atau 0,01 ml pada bagian dalam kedua telinganya di bawah pemakaian anestesi halothane. Mencit diberi perlakuan 8 hari kemudian di bawah pemakaian anestesi dengan menggunakan 0,01 ml larutan oksazolon 2% pada bagian dalam telinga kanan (kontrol) atau 0,01 ml larutan oksazolon dimana senyawa uji atau standar dilarutkan. Pada uji ini menggunakan pipet khusus 0,1 ml atau 0,01 ml. Kelompok yang terdiri dari 10 – 15 mencit diberi perlakuan dengan diiritasi sendiri atau dengan lautan senyawa uji. Telinga sisi kiri tidak diberi perlakuan. Inflamasi maksimum terjadi 24 jam kemudian. Pada waktu itu, mencit dikorbankan menggunakan anestesi dan dipotong dengan diameter 8 mm pada kedua telinganya. Potongan tersebut ditimbang. Selisih berat dari keduanya merupakan indikator inflammatory edema (Vogel, 2002).
9. Edema telinga oleh minyak kroton pada tikus dan mencit
Untuk uji pada mencit senyawa iritan dibuat dengan komposisi sebagai berikut (v/v) : 1 bagian minyak Kroton, 10 bagian etanol, 20 bagian piridin, 69 bagian etil eter. Sedangkan untuk uji pada tikus senyawa iritan dibuat dengan komposisi sebagai berikut (v/v) : 4 bagian minyak Kroton, 10 bagian etanol, 20 bagian piridin, 66 bagian etil eter. Senyawa standar dan senyawa ujidilarutkan dalam larutan iritan. Untuk uji pada mencit menggunakan mencit jantan NMRI dengan berat 22 gram, sedangkan untuk uji pada tikus menggunakan tikus jantan Sprague-Dawley dengan berat badan 70 gram. Untuk masing-masing kelompok perlakuan dan kelompok kontrol menggunakan 10 hewan uji. Senyawa uji dilarutkan pada konsentrasi 0,03 mg/ml sampai 1 mg/ml untuk mencit dan pada konsentrasi 3 – 10 lebih tinggi untuk tikus pada larutan iritan. Larutan ini disuntikkan pada kedua sisi telinga kanan sebanyak 0,01 ml pada mencit dan 0,02 ml pada tikus. Kelompok kontrol hanya menerima larutan iritan. Telinga kiri tidak diberi perlakuan apa-apa. Iritan diberikan menurut pemberian anestesi eter. Empat jam setelah pemberian, hewan uji dikorbankan menggunakan anestesi. Kedua telinga dipotong dan pada keduanya dipotong dengan diameter 8 mm. Potongan tersebut ditimbang. Selisih berat diantara telinga yang diberi perlakuan dengan yang tidak diberi perlakuan menunjukkan nilai inflammatory edema (Vogel, 2002).
10. Synovitis terinduksi urat
Pada percobaan ini menggunakan hewan uji anjing dengan berat badan antara 18 – 25 kg. Kulit di atas lutut dicukur, dibersihkan, dan disuntikkan jarum
21-gauge steril ke dalam jaringan otot. Satu jam sebelum penyuntikan urate crystal, hewan diberi perlakuan dengan senyawa uji dan standar. Sepasang anjing diuji setiap 2 hari. Pada hari pertama, hanya satu anjing menerima obat tersebut. Satu minggu kemudian lutut anjing tersebut disuntik sedangkan yang lain diberi obat (Vogel, 2002).
11. Percobaan in vitro
Percobaan in vitro berguna untuk mengetahui peran dan pengaruh substansi-substansi fisiologis seperti histamin, prostaglandin dan lain-lain dalam terjadinya inflamasi. Contoh beberapa percobaan invitro adalah : ikatan reseptor bradikinin-H3, ikatan reseptor neurokinin, dan uji kemotaksis leukosit polimorfonuklear (Vogel, 2002).