Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2008 sampai dengan September 2011 di Lab. Biotechnology Research Indonesia–The Netherlands (BIORIN) dan Lab. Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB Bogor. Konstruksi vektor ekspresi dilakukan di Gene Research Center, College of Agriculture Ibaraki University Jepang, dari Desember 2008 sampai dengan April 2009.
Bahan Penelitian
Plasmid pGEM®-T Easy (Promega) dalam bakteri E. coli DH5 yang membawa sisipan gen MaMt2 (Suharsono et al. 2009), digunakan sebagai sumber gen MaMt2. Plasmid pIG6 (Gene Research Center, Ibaraki Univ. Japan) dalam bakteri E. coli DH5 digunakan sebagai vektor ekspresi untuk gen MaMt2 (Gambar 3). Plasmid ini memiliki T-DNA yang mengandung gen hptII (hygromycin phosphotransferase) dan situs pengklonan ganda (multiple cloning sites, MCS) yang diapit oleh promoter Ubiquitin dari jagung dan terminator Nos (nopaline synthase). Plasmid ini mempunyai gen nptII (neomycin phosphotransferase) di luar T-DNA. Plasmid pRK2013 dalam E. coli DH1
digunakan untuk membantu proses transfer gen antar bakteri. Bakteri A. tumefaciens LBA4404 digunakan sebagai inang vektor biner pIG6 rekombinan.
Primer spesifik hptIIF (5‟-GGATATGTCCTGCGGGTAAA-3‟) dan hptIIR (5‟-ACACATGGGGATCAGCAATC-3‟), digunakan untuk mengetahui keberadaan gen hptII. Primer SMt2UF (5‟-TCATGGATCCATGTCTTGCT GTG GAGG-3‟) dan SMt2UR (5‟-GTCAACTAGTTCACTTGCAGGTGCAAG-3‟), digunakan untuk mengisolasi gen MaMt2 dari plasmid pGEMT-Easy yang mengandung gen MaMt2. Primer UbiF (5‟-TGATGATGTGGTCTGGGTTGG-3‟) dan NosTR (5‟-CTCATAAATAACGTCATGCATTACA-3‟), digunakan untuk mengetahui keberadaan gen MaMt2. N. benthamiana dan kedelai cv. Lumut yang
sensitif aluminium (Sopandie et al. 1996), digunakan sebagai tanaman sasaran transformasi dengan gen MaMt2.
Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui tiga tahapan, yaitu: a) konstruksi vektor ekspresi, b) perakitan tanaman N. benthamiana dan kedelai transgenik dan c) analisis tanaman N. benthamiana dan kedelai transgenik. Tahapan penelitian disajikan pada Gambar 4.
Gambar 4 Tahap perakitan tanaman N. benthamiana dan kedelai transgenik Perakitan tanaman transgenik Introduksi PCR Analisis kedelai transgenik *molekular pIG6 Analisis Nb transgenik *molekular *segregasi hpt Fragmen MaMt2 pIG6-MaMt2 A. tumefaciens LBA444 N benthamiana Kedelai pGEMT-Easy (MaMt2)
BamHI-SpeI BamHI-SpeI
Kedelai transgenik N benthamiana transgenik Konstruksi vektor ekspresi Analisis tanaman transgenik P35S hptII 35S polyA P Ubi. nptII pBR322 ori LB
HindIII BamHI
MCS NosT RB SpeI
Persiapan sumber eksplan N. benthamiana.
Biji-biji N. benthamiana disterilisasi permukaan dengan cara direndam dalam ethanol 70% selama 5 menit, lalu direndam dalam 20% larutan Bayclin (5.25% NaClO) selama 10 menit. Biji-biji selanjutnya dibilas dengan air steril sebanyak lima kali, kemudian dikeringanginkan di atas kertas tissue steril. Sebanyak 25 biji steril dikecambahkan pada media MS0 (garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 0.3% Gelrite) dalam cawan petri 100 x 20 mm dan dipelihara dalam ruang kultur pada suhu 26oC dalam gelap selama lima hari, dilanjutkan dengan pencahayaan lampu dengan fotoperiode 16 jam, selama satu bulan. Selanjutnya biji dipindahkan dalam botol kultur yang berisi media 1/2MS (1/2x garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 0.3% Gelrite), dan dipelihara dalam ruang kultur pada suhu 26oC dengan fotoperiode 16 jam, selama satu bulan.
Konstruksi vektor ekspresi plasmid pIG6
cDNA MaMt2 yang telah disisipkan ke dalam pGEMT-Easy (Suharsono et al. 2009) diisolasi dengan PCR. Campuran reaksi PCR yang digunakan adalah 10 ng DNA plasmid, 5x buffer PrimeStar (Takara Co.Ltd.), 0.2 mM dNTP mix, 0.5 µM primer SMt2UF, 0.5 µM primer SMt2UR, 1.25 U PrimeStar HS DNA polymerase (Takara Co.Ltd.) dan ditambahkan ddH2O hingga volume 20 µl. PCR
dilakukan sebanyak 30 siklus dengan kondisi pra-PCR 95oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 30 detik; penempelan primer 55oC, 30 detik; pemanjangan 72oC, 30 detik; pemanjangan akhir 72oC, 10 menit; dan pasca-PCR 20oC, 20 menit, menggunakan mesin PCR Perkin-Elmer. Hasil PCR dielusi dan dipotong dengan enzim restriksi BamHI (GGATTC) dan SpeI (ACTAGT), selanjutnya diligasikan dengan vektor pIG6 yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Hasil ligasi pIG6-MaMt2 kemudian dimasukkan ke dalam bakteri E. coli DH5α menggunakan metode elektroporasi (Electroporator ECM399, BTX Harvard Apparatus): 1450 V, 5 milidetik. Bakteri selanjutnya dipulihkan dengan 1000 μl media LB cair (Lampiran 1). Dari kultur tersebut diencerkan 100x dan 200x bakteri, kemudian dari masing-masing pengenceran bakteri tersebut diambil 80 μl dan disebar pada media LB padat yang mengandung 50 mg/l kanamisin, dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam.
Plasmid rekombinan diisolasi dari bakteri yang tumbuh di media seleksi menurut metode Suharsono (2002). PCR menggunakan plasmid rekombinan yang diisolasi dari bakteri yang mampu hidup dalam media seleksi sebagai cetakan dilakukan untuk memeriksa keberadaan gen hptII sebagai gen penanda seleksi dan gen MaMt2 sebagai gen sasaran. Primer hptIIF dan hptIIR digunakan untuk memeriksa keberadaan gen hptII. Sedangkan kombinasi primer UbiF dan SMt2UR serta UbiF dan NosTR digunakan untuk memeriksa keberadaan gen MaMt2 yang telah difusikan dengan promoter Ubiquitin dan NosT.
Introduksi vektor ekspresi ke dalam A. tumefaciens LBA4404
Vektor ekspresi pIG6-MaMt2 yang ada dalam E. coliDH5α dimasukkan ke dalam A. tumefaciens LBA4404 dengan bantuan plasmid penolong pRK2013 dalam E. coli DH1 menggunakan metode triparental mating (TPM). Satu koloni A. tumefaciens LBA4404 diambil dan dikultur dalam media LB cair yang mengandung 100 mg/l streptomisin, diinkubasi pada suhu 28oC dalam gelap, dengan penggoyangan pada kecepatan 220 rpm selama dua hari atau hingga OD650
= 1. Bakteri E. coli DH5 yang mengandung pIG6-MaMt2 dan bakteri E. coli DH1 yang mengandung plasmid pRK2013 masing-masing dikultur dalam media LB cair yang mengandung 50 mg/l Kanamisin pada suhu 37oC, selama 16-18 jam, digoyang dengan kecepatan 220 rpm. Dari ketiga kultur di atas, masing-masing diambil 20 µl dan dimasukkan dalam satu tabung mikro, divorteks selama 5 menit. Selanjutnya, campuran kultur diteteskan pada media LB padat tanpa antibiotik dan diinkubasi pada suhu 28oC, selama dua hari dalam gelap. Bakteri yang tumbuh pada media tanpa antibiotik diambil dengan ose, dimasukkan dalam media LB cair, divorteks, dan diteteskan di atas media LB padat yang mengandung 50 mg/l kanamisin dan 100 mg/l streptomisin, selama dua hari dalam gelap. Bakteri yang tumbuh diambil satu ose dan diencerkan dalam 500 µl LB cair (Lampiran 2), lalu divorteks selama 5 menit. Kemudian, 5 µl kultur bakteri di atas diambil dan dimasukkan dalam 495 µl LB cair, dicampur hingga homogen. Dari hasil pengenceran tersebut diambil 80 µl larutan dan disebar di atas media LB padat yang mengandung 50 mg/l kanamisin dan 100 mg/l streptomisin. Kultur selanjutnya dipelihara pada suhu 28oC selama dua hari. Bakteri A. tumefaciens
yang tumbuh diisolasi dan dibiakkan dalam media LB. Plasmid diisolasi dari bakteri ini dan keberadaan gen MaMt2 yang difusikan dengan promoter Ubiquitin diperiksa dengan PCR menggunakan primer spesifik UbiF dan SMt2UR serta UbiF dan NosTR.
Transformasi genetik N. benthamiana
Satu koloni A. tumefaciens LBA4404 yang membawa vektor rekombinan pIG6-MaMt2 dikultur dalam LB cair yang mengandung 50 mg/l kanamisin dan 100 mg/l streptomisin pada suhu 28oC, digoyang dengan pada kecepatan 220 rpm selama 2 hari atau hingga OD650 = 1. Sebanyak 1500 µl A. tumefaciens LBA4404
disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm, 5 menit dan endapannya diresuspensi dalam media infeksi (garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 0.5 mg/l BAP, dan 20 mM asetosiringon), hingga mencapai OD650 = 0.7-0.8. Daun N. benthamiana dari
kultur aseptik berumur 2 bulan dipotong dengan ukuran ± 1 cm2, menggunakan pisau bedah steril. Eksplan daun diinfeksi dengan A. tumefaciens LBA4404 selama 20 menit dengan penggoyangan, lalu dikeringanginkan di atas kertas tissue steril. Eksplan selanjutnya ditanam dalam media ko-kultivasi (garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 20 mM Asetosiringon, 0.3% Gelrite) dan dikokultivasi selama tiga hari dalam gelap. Kemudian eksplan dicuci dengan 200 mg/l cefotaxim, dikeringanginkan dan ditanam dalam media seleksi I (garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 1 mg/l BAP, 200 mg/l cefotaxim, 30 mg/l higromisin, 0.3% Gelrite). Setelah 2-3 minggu dalam media seleksi I, kalus mulai terbentuk dan eksplan dipindahkan ke dalam media seleksi II (garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 0.5 mg/l BAP, 100 mg/l cefotaxim, 50 mg/l higromisin, 0.3% Gelrite), selama 2-3 minggu sampai muncul tunas. Tunas-tunas yang telah mencapai tinggi ± 3-4 cm dipindahkan ke media induksi akar (1/2x garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, 0.1 mg/l IBA, 0.3% Gelrite) dan dipelihara selama 3-4 minggu. Pada setiap tahapan, kultur dipelihara dalam ruang kultur pada suhu 26oC dengan fotoperiode 16 jam. Tunas yang telah berakar diaklimatisasi ke media tanah dalam pot plastik yang berisi campuran tanah, kompos, dan sekam bakar (1:1:1), lalu dipelihara dalam ruang kultur selama seminggu. Tanaman yang tumbuh dengan baik diaklimatisasi di luar ruang selama seminggu. Selanjutnya tanaman dipindahkan ke pot
berdiameter 22 cm dengan media tanah-kompos (1:1) dan dipelihara di rumah kaca sampai dewasa.
Uji integrasi gen MaMt2 di dalam N. benthamiana
Integrasi transgen MaMt2 di dalam genom N. benthamiana transgenik diperiksa dengan melakukan PCR terhadap DNA genom yang diisolasi dari contoh daun tanaman T0 menggunakan Kit Plant DNA Preparation (sesuai prosedur Qiagen). Campuran reaksi yang digunakan adalah 100 ng DNA genom, 0.5 mM primer UbiF dan 0.5 mM primer NosTR, 10 µl PCR mix GoldTaq (Fermentas), ditambah dengan ddH2O hingga volume 20 µl. Kondisi PCR yang
digunakan adalah pra-PCR 95oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 60 detik; penempelan
primer 60oC, 60 detik; pemanjangan 72oC, 1 menit 20 detik; dan pemanjangan
akhir 72oC, 5 menit; serta pasca-PCR 20oC, 10 menit, sebanyak 25 siklus,
menggunakan mesin PCR MJ Research. Hasil PCR divisualisasi dalam 1.5% gel agarose (Vivantis) yang diwarnai dengan ethidium bromida (0.5 µg/ml).
Uji segregasi gen hptII di tanaman N. benthamiana transgenik T1
Tanaman N. benthamiana T0 transgenik dipelihara dalam rumah kaca sampai menghasilkan biji. Biji dari N. benthamiana T0 ini selanjutnya dipanen untuk ditanam dalam media seleksi. Sebelum ditanam, biji-biji disterilisasi permukaan dengan merendamnya dalam ethanol 70% selama 2 menit, Bayclin 20% selama 20 menit, dan dicuci dengan air steril lima kali. Biji-biji kemudian dikeringkan pada kertas steril selanjutnya ditanam dalam media seleksi (garam MS, vitamin MS, 3% sukrosa, Gelrite 0.3%, dan 50 mg/l higromisin) dalam cawan petri berdiameter 100 x 20 mm. Benih selanjutnya dimasukkan ke ruang gelap selama lima hari untuk mempercepat proses perkecambahan. Setelah benih mulai berkecambah yang ditandai dengan munculnya radikula, dipindahkan ke ruang kultur dengan fotoperiode 16 jam dan suhu 26oC selama 1 bulan. Kemudian kecambah yang hidup dan mati dihitung, kemudian dianalisis menggunakan uji Chi-kuadrat.
Persiapan eksplan kedelai
Biji-biji kedelai cv. Lumut disterilisasi permukaan dengan cara direndam dalam ethanol 70% selama 5 menit, kemudian direndam dalam larutan Bayclin 30% ditambah Tween-20 selama 20 menit. Biji-biji selanjutnya dibilas dengan air steril sebanyak lima kali, dan direndam dalam air pada suhu 28oC, dalam gelap ± 16 jam, untuk imbibisi. Selanjutnya biji dibilas dengan air steril sebanyak lima kali, kemudian kulit biji dikupas dengan pisau bedah steril untuk memisahkan kedua kotiledon dan membuang aksis embrionik serta hipokotil. Dengan cara ini setiap biji kedelai menghasilkan dua eksplan yang disebut dengan eksplan setengah biji.
Transformasi genetik kedelai dengan A. tumefaciens.
Prosedur transformasi mengikuti Paz et al. (2006). Eksplan setengah biji kedelai Lumut yang sudah disterilisasi diinokulasi dengan cara direndam dalam biakan A. tumefaciens LBA4404 yang membawa plasmid pIG6-MaMt2, dalam media inokulasi (garam MS, vitamin B5, 3% sukrosa, 7.5 µM BAP, 0.7 µM GA3, 3 mM MES, 20 µM Asetosiringon). Eksplan selanjutnya dikeringkan pada kertas saring steril, lalu dipindahkan ke media ko-kultivasi (garam MS, vitamin B5, 3% sukrosa, 7.5 µM BAP, 0.7 µM GA3, 3 mM MES, 20 µM asetosiringon, 0.3% Gelrite) dan diinkubasi dalam ruang gelap selama lima hari. Eksplan hasil ko- kultivasi kemudian dicuci dengan media pencucian (garam MS, vitamin B5, 3% sukrosa, 7.5 µM BAP, 20 mM MES, 200 mg/l cefotaxime, 10 mg/l higromisin). Selanjutnya, eksplan ditanam dalam media seleksi I (garam MS, vitamin B5, 7.5 µM BAP, 3% sukrosa, 50 mg/l L-glutamin, 50 mg/l L-asparagin, 200 mg/l cefotaxim, dan 10 mg/l higromisin, Gelrite 0.3%). Setelah 4-6 minggu, eksplan yang menghasilkan sejumlah tunas dipindahkan ke media seleksi II (garam MS,
vitamin B5, 7.5 µM BAP, 0,5 mg/l NAA, 50 mg/l L-glutamin, 0.05 mg/l L-asparagin, 200 mg/l cefotaxim, 20 mg/l higromisin, 0.3% Gelrite). Tunas
berukuran 3-4 cm selanjutnya dipisahkan dari eksplan, lalu dikulturkan pada media pengakaran (garam ½ MS, vitamin B5, 0.5 mg/l NAA, 0.3% Gelrite) selama 2-3 minggu (Pardal et al. 2004). Plantlet yang telah berakar diaklimatisasi ke media dalam pot yang berisi campuran tanah dan kompos (1:1) dan dibiarkan
di ruangan yang teduh sampai tiga hari. Selanjutnya tanaman T0 dipelihara di rumah kaca sampai dewasa hingga menghasilkan biji T1.
Uji integrasi transgen MaMt2 di dalam kedelai transgenik generasi T0 dan T1
Integrasi transgen MaMt2 di dalam genom kedelai transgenik putatif T0 dan keturunan tanaman transgenik generasi T0 (generasi T1), dianalisis dengan PCR. DNA genom diisolasi dari contoh daun tanaman menggunakan Kit Plant DNA Preparation (sesuai prosedur Qiagen Inc.). Campuran reaksi yang digunakan adalah 100 ng DNA genom, 0.5 mM primer UbiF dan 0.5 mM primer NosTR, 10 µl PCR mix GoldTaq (Fermentas), ditambah dengan ddH2O hingga volume 20 µl.
Kondisi PCR yang digunakan adalah pra-PCR 95oC, 5 menit; denaturasi 94oC, 60 detik; penempelan primer 60oC, 60 detik; pemanjangan 72oC, 1 menit 20 detik; dan pemanjangan akhir 72oC, 5 menit; serta pasca-PCR 20oC, 10 menit, sebanyak 25 siklus, menggunakan mesin PCR MJ Research. Hasil PCR divisualisasi dalam 1.5% gel agarose (Vivantis) yang diwarnai dengan ethidium bromida (0.5 µg/ml). Analisis tanaman kedelai transgenik generasi T1 dilakukan dengan prosedur yang sama dengan analisis tanaman transgenik generasi T0. Contoh DNA genom tanaman kedelai transgenik yang diuji adalah yang memberikan hasil PCR positif untuk gen MaMt2.
