Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan November 2008 di Laboratorium Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi-Bogor dan Laboratorium Bioindustri, Departemen Teknologi Industri Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan sebagai substrat utama dalam pembuatan etanol dan asam asetat dari pulp kakao jenis lindak dari perkebunan rakyat Bone, Makassar, sukrosa, gula, enzim selulase Penicillium nalgiovense SS240, PDA (agar-agar kentang-dekstrosa) miring, PDB (kentang-dektrosa cair),
Saccharomyces cerevisiae koleksi IPB dan Balitnak, Acetobacter aceti BTCC-618 koleksi LIPI Cibinong, dinitrosalicylic acid (DNS), glukosa, etanol absolute, K2Cr2O7, Na asetat, asam sulfat, Na2CO3, NaCl, aquades, medium Mandels.
Peralatan yang digunakan adalah erlenmeyer volume 250 ml, tabung reaksi, gelas ukur, autopipet 1000-5000 μl, inkubator bergoyang, vorteks, spektrofotometer, cawan conway, autoclave, pengaduk magnetik, bioreaktor berkapasitas 2 liter (Gambar 3).
Gambar 3. Penampang bioreaktor berkapasitas 2 liter. Metode Penelitian
• Pembuatan Media Agar Miring (Agar-Agar Kentang-Dekstrosa)
Bahan-bahan pembuatan media agar miring meliputi : aquades 150 ml, yeast extract 0.6 gr, potato dextrose agar 6 gr. Bahan-bahan tersebut dicampur dan dilarutkan dalam aquades dan dimasak selanjutnya dituang dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 οC selama 15 menit.
• Pembuatan Media Cair untuk Aktivasi (Kentang-Dektrosa Cair)
Bahan-bahan pembuatan media cair untuk aktifasi meliputi : kentang 200gr, aquades 500 ml, sukrosa 10gr. Bahan-bahan tersebut dimasak dalam aquades kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer (volume 500 ml) sebanyak 100 ml selanjutnya disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 οC selama 15 menit.
• Persiapan Inokulum
S. cerevisiae koleksi IPB dan Balitnak serta A. aceti dibiakkan pada PDA (agar-agar kentang-dekstrosa) miring selama 2 hari pada suhu ruang dalam tabung reaksi disuspensikan dengan NaCl sebanyak 5 ml selanjutnya dipindahkan sebanyak 2.5 ml dalam 50 ml PDB (kentang-dektrosa cair). PDB diinkubasi dalam inkubator bergoyang 150 rpm pada 30 οC selama 20 jam untuk selanjutnya digunakan sebagai inokulum.
• Produksi Enzim Selulase
P. nalgiovense SS240 ditanam pada media agar miring (agar-agar kentang-dekstrosa) selama 5 hari, ditambahkan larutan NaCl 0.85%. Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasi 2 ml inokulum pada 50 ml media Mandels (Lampiran 1) dengan 3% polard NaOH sebagai sumber karbon dalam labu erlenmeyer 250 ml. Diinkubasi pada suhu 30 οC dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama 4 hari. Supernatan yang merupakan enzim disimpan dalam freezer untuk digunakan dalam penelitian.
Pelaksanaan Penelitian Penelitian Pendahuluan
• Penentuan Galur S. cerevisiae untuk Produksi Etanol pada Media Pulp Kakao
Mengkaji fermentasi anaerob pada media pulp kakao oleh S. cerevisiae
koleksi IPB dan Balitnak. Masing-masing medium yang dikaji diencerkan 3x dan ditambahkan sukrosa 3.3% (b/v) sebagai kontrol tidak ditambahkan gula. Inokulum sebanyak 10% (v/v) dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang berisi medium fermentasi (volume kerja 150 ml) diinkubasikan pada suhu 30 οC selama 120 jam.
• Penentuan Aerasi dan Kadar Gula Total pada Medium Mandels ♦ Penentuan Aerasi Kultur Fed-Batch dan Batch
Mengkaji fermentasi alkohol pada medium Mandels dengan kadar gula total 6% (b/v) dan pengaturan aerasi fed-batch (anaerob ; anaerob dan aerob ; anaerob), batch (anaerob) . Substrat dimasukkan ke dalam erlenmeyer (volume 250 ml) sebanyak 200 ml, 10% (v/v) inokulum S. cerevisiae koleksi Balitnak. Pada jam ke-48 ke dalam kultur ditambahkan (fed) media baru dan diinkubasikan selama 120 jam.
♦ Peningkatan Optimasi Kadar Gula pada Substrat
Pada kondisi terbaik percobaan pengaturan aerasi penelitian dilanjutan dengan meningkatkan kadar gula total 6, 12 dan18 % (b/v) dengan kondisi kultur
fed-batch secara anaerob ; anaerob. Substrat dimasukkan ke dalam erlenmeyer (volume 250 ml) sebanyak 200 ml. Pada jam ke-48 ke dalam kultur ditambahkan (fed) media baru dan diinkubasikan selama 120 jam.
Penelitan Utama
• Fermentasi Alkohol dan Fermentasi Asam Asetat ♦ Kultur Batch
Perlakuan terbaik dari penelitian pendahuluan dilanjutkan dengan penelitian utama dimana sebanyak 1000 ml substrat (pulp kakao diencerkan 3x dengan medium Mandels) (Lampiran 1) ditambahkan sukrosa hingga total padatan terlarut 18% Brix). Inokulasi S. cerevisiae ke dalam substrat sebanyak 10% (v/v) (Lampiran 2) selanjutnya diinkubasi selama 48 jam.
Pada fermentasi alkohol beberapa perlakuan yang dilakukan pada kultur
batch ini meliputi :
o Kultur batch tanpa penambahan enzim selulase
o Kultur batch dengan penambahan enzim selulase 13.8 U/l medium fermentasi pada jam ke-0
Etanol yang dihasilkan dari fermentasi alkohol pada jam ke-48 dilanjutkan dengan fermentasi asam asetat dimana ke dalam bioreaktor ditambahkan inokulum A. aceti sebanyak 10% (v/v) (Lampiran 2) diinkubasi selama 96 jam dengan kecepatan agitasi 300 rpm dan aerasi 1.0 vvm.
♦ Kultur Fed-Batch
Sebanyak 1000 ml substrat (pulp kakao diencerkan 3x dengan medium Mandels) (Lampiran 1) ditambahkan sukrosa hingga kadar gula total substrat 18% Brix). Inokulasi S. cerevisiae ke dalam substratsebanyak 10% (v/v) (Lampiran 2) selanjutnya diinkubasi selama 96 jam. Pada jam ke-48 dilakukan pemanenan sebanyak 500 ml selanjutnya ke dalam kultur tersebut ditambahkan kembali substrat sebanyak 500 ml sehingga total substrat menjadi 1000 ml.
Pada fermentasi alkohol beberapa perlakuan yang dilakukan pada kultur
fed-batch ini meliputi :
o Kultur fed-batch tanpa penambahan enzim selulase
o Kultur fed-batch dengan penambahan enzim selulase 13.8 U/l medium fermentasi pada jam ke-48
Etanol yang dihasilkan dari fermentasi alkohol pada jam ke-96 dilanjutkan dengan fermentasi asam asetat dimana ke dalam bioreaktor ditambahkan inokulum A. aceti sebanyak 10% (v/v) (Lampiran 2) diinkubasi selama 96 jam dengan kecepatan agitasi 300 rpm dan aerasi 1.0 vvm. Bagan alir produksi asam asetat dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Diagram alir tahapan penelitian produksi asam asetat dari pulp kakao.
Fermentasi alkohol pada medium pulp kakao secara batch
dengan penambahan sukrosa 3.3% (b/v) dan inokulum 10%
(v/v) S. cerevisiae koleksi IPB dan Balitnak
Fermentasi alkohol pada medium Mandels
(gula 6% (b/v)) secara kultur fed-batch (anaerob ; anaerob
dan aerob ; anaerob) dan peningkatan optimasi kadar gula pada substrat 6, 12, dan 18% (b/v)
Fermentasi alkohol pada media pulp kakao secara kultur
batch dan fed-batch (anaerob) diencerkan 3x dengan
medium Mandels, total padatan terlarut substrat 18% Brix
Fed-batch Batch
Penambahan enzim selulase jam
ke-0 Tanpa penambahan
enzim selulase jam ke-0
Fed & Penambahan
enzim selulase jam ke-48
Fed &Tanpa
penambahan enzim selulase jam ke-48
Etanol jam ke-96 Etanol jam ke-96
Etanol jam ke-48 Etanol jam ke-48
Asam Asetat Asam Asetat
Penambahan 10% (v/v) inokulum
A. aceti, kecepatan agitasi 300
rpm, kecepatan aerasi 1.0 vvm
Penambahan 10% (v/v) inokulum
A. aceti, kecepatan agitasi 300
Parameter yang Diamati Parameter yang diamati meliputi :
1. Analisis kadar gula reduksi pada fermentasi alkohol (Lampiran 3). 2. Total padatan terlarut.
3. Analisis kadar alkohol pada fermentasi alkohol dan fermentasi asam asetat (Lampiran 3).
4. Dry weight pada fermentasi alkohol dan fermentasi asam asetat (Lampiran 3).
5. pH substrat pada fermentasi alkohol dan fermentasi asam asetat. 6. Kadar asam asetat pada fermentasi asam asetat (Lampiran 3). 7. Kenetika Fermentasi µmaks (jam-1), Y x/s, dan Y p/s.
Rancangan Percobaan
Urutan pengerjaan penelitian pada proses fermentasi alkohol yang kemudian dilanjutkan dengan fermentasi asam asetat dilakukan mengikuti Rancangan Percobaan Acak Lengkap Faktorial (Sudjana 1994). Faktor yang diamati pengaruhnya adalah kultur batch dan fed-batch (S1, S2) serta faktor penambahan enzim selulase 0, 13.8 U/l medium fermentasi (E1,E2,). Replikasi ditetapkan sebanyak 2 kali. Model matematis dari rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut :
Y ijk = μ + Si + Ej + (SE)ij + εijk ... ( 6 ) Keterangan :
Y ijk = nilai variabel respon unit percobaan yang dikenai taraf ke-i faktor kultur dan taraf ke-j faktor penambahan enzim selulase dengan ulangan ke-k μ = rata-rata umum
Si = pengaruh kultur substratke-i (i = 1, 2, 3)
Ej = pengaruh penambahan enzim selulase ke-j (j = 1, 2, 3, 4) (SE)ij = pengaruh kulturke-i dengan penambahan enzim selulase ke-j
εijk = error pada unit percobaan yang dikenai faktor S taraf ke-i, faktor E taraf ke-j dengan ulangan ke-k.
Hipotesa dapat dirumuskan sebagai berikut :
1. H1 ; (S1) ≠ 0 (i = 1, 2, 3), dimana H0 berarti tidak ada pengaruh faktor kultur yang digunakan terhadap respon yang diamati. H1 berarti ada pengaruh faktor kultur yang digunakan terhadap respon yang diamati.
2. H2 ; (E1) ≠ 0 (j = 1, 2, 3, 4), dimana H0 berarti tidak ada pengaruh faktor penambahan enzim selulase terhadap respon yang diamati. H1 berarti ada pengaruh faktor penambahan enzim selulase terhadap respon yang diamati. 3. H3 ; (SE)ij ≠ 0, dimana H0 berarti tidak ada pengaruh interaksi antara taraf
ke-i faktor kultur yang digunakan dan taraf ke-j faktor penambahan enzim selulase terhadap respon yang diamati. H1 berarti ada pengaruh interaksi antara taraf ke-i faktor kultur yang digunakan dan taraf ke-j faktor penambahan enzim selulase terhadap respon yang diamati.
H1 dan H2 menyatakan bahwa faktor S dan faktor E berpengaruh dalam eksperimen. H3 menyatakan bahwa terdapat pengaruh interaksi faktor S dan faktor E terhadap respon yang diamati. Jika nilai F hitung > F α dengan αmerupakan taraf signifikasi, maka hipotesa akan diterima. Uji jarak berganda Duncan (Duncan Multiple Range Test) dilakukan bila terdapat perbedaan yang signifikan dari faktor perlakuan yang dicobakan atau hasil sidik ragam menunjukkan perbedaan berpengaruh nyata.