Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini yaitu cangkang telur ayam sebagai donor kalsium, diamonium hidrogen fosfat ((NH4)2HPO4) pro analis (Merck) dan kitosan (Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan IPB) sebagai matriks organik. Bahan pendukung lain yang digunakan yaitu aquades, aquabides dan asam asetat.
Alat yang digunakan terdiri dari dua kelompok, peralatan yang digunakan untuk pembuatan sampel dan pengujian sampel. Peralatan pembuatan sampel terdiri dari magnetic stirrer, ultrasonic chamber, hot plate, neraca analitik,
thermometer digital, furnace, incubator, buret 100 mL, gelas kimia, mortar,
pipette Mohr, corong, dan kertas saring (whatman 40). Pembuatan sampel dilakukan di Laboratorium Biofisika Departemen Fisika FMIPA-IPB.
Peralatan karakterisasi sampel pada prinsipnya digunakan untuk tiga jenis analisis. Analisis struktur dilakukan dengan menggunakan difraktometer sinar-X Shimadzu Philips Diffraktometer yang terdapat di Laboratorium Terpadu bagian Kimia Kayu di Badan Penelitian dan Pengembangan Hutan (Balithut) Bogor. Difraksi menggunakan sinar-X karakteristik Kα Cu (λkαCu = 1,54002 Å). Kandungan gugus fungsi sampel dianalisis dengan spektrometer Fourier Transform Infrared (FTIR) Burker Tensor 37 milik Laboratorium Biofarmaka IPB-Bogor. Morfologi permukaan diamati dengan Mikroskop elektron JEOL SEM (Scanning Electron Microscope) yang dilakukan di Pusat Penelitian Geologi–Bandung.
Metode
Sintesis komposit kalsium fosfat-kitosan sebagai material substitusi tulang dilakukan dalam dua tahap. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk memperoleh fase kalsium fosfat kristal stabil dan kristal yang dapat larut dalam cairan tubuh. Telah diketahui fase senyawa hidroksiapatit (HA)10 sebagai kristal stabil dan fase trikalsium fosfat (TKF) atau apatit karbonat (AK) sebagai kristal yang lebih
mudah larut oleh cairan tubuh20. Tahap kedua melakukan sintesis dan karakterisasi komposit kalsium fosfat-kitosan.
Tahap Pertama: Sintesis Kalsium Fosfat
Proses ini diawali dengan kalsinasi cangkang telur untuk memperoleh senyawa kalsium. Selanjutnya dilakukan sintesis kalsium fosfat. Masing-masing tahapan diuraikan di bawah ini.
1. Kalsinasi Cangkang Telur
Proses kalsinasi cangkang telur diawali dengan membersihkan cangkang dari membran dan kotoran makro dengan menggunakan aquades. Selanjutnya, dikeringkan pada termperatur ruang dan dikalsinasi pada termperatur 1000oC selama 5 jam dengan laju kenaikan termperatur 5oC/menit. Karakterisasi fase diamati dengan menggunakan difraksi sinar-X dan kadar kalsium diuji dengan spektroskopi serapan atom. Secara skematis proses kalsinasi cangkang telur dapat ditunjukkan pada Gambar 16.
Gambar 16 Proses kalisinasi cangkang telur.
Karakterisasi difraksi sinar-X Cangkang telur yang
sudah dibersihkan Kalsinasi pada T=1000oC selama 5 jam Serbuk hasil kalsinasi Karakterisasi serapan atom
2. Sintesis Kalsium Fosfat
Senyawa kalsium fosfat diperoleh dengan mereaksikan prekursor kalsium (Ca) dan prekursor fosfat (P). Prekursor Ca diperoleh dari hasil kalsinasi cangkang telur. Prekursor P diperoleh dari senyawa (NH4)2HPO4. Masing masing prekursor dilarutkan dalam aquabides.
Kedua prekursor direaksikan dengan metode presipitasi, yang dilakukan dengan cara meneteskan 100 ml larutan (NH4)2HPO4 ke dalam 100 ml suspensi Ca dari hasil kalsinasi cangkang telur (Gambar 17). Presipitasi dilakukan pada termperatur 37oC larutan diaduk dengan magnetic stirrer. Selanjutnya, hasil presipitasi diendapkan selama 24 jam pada termperatur ruang. Kemudian presipitat disaring dan dikeringkan pada termperatur 110oC selama 5 jam.
Gambar 17 Skema tahap-tahap presipitasi.
Penyaringan dengan whatman 40 Pengeringan pada T=110oC selama 5 jam Presipitat kering Larutan (NH4)2HPO4 Suspensi CaO Presipitasi T=37oC Pengendapan selama 24 jam, T= ruang
Presipitasi untuk sintesis HA dilakukan dengan berbagai variasi konsentrasi komponen prekursor yang dapat dilihat pada Tabel 4. Presipitat kering yang diperoleh selanjutnya disintering pada termperatur 900oC selama 5 jam.
Tabel 4 Variasi konsentrasi Ca dan P pada pembuatan HA konsentrasi Kode sampel Ca (M) P (M) 0,10 0,06 H1 0,20 0,12 H2 0,30 0,18 H3 0,40 0,24 H4 0,50 0,30 H5
Sintesis AK dilakukan setelah diperoleh fase HA optimum karena konsentrasi yang digunakan pada presipitasi AK sama dengan konsentrasi yang digunakan untuk memperoleh HA optimum. Perbandingan konsentrasi tersebut adalah 0,3 M suspensi Ca dari hasil kalsinasi cangkang telur dan 0,18 M larutan (NH4)2HPO4. Proses yang dilakukan seperti pada sintesis HA namun tanpa proses sintering.
Untuk memperoleh fase TKF, proses presipitasi dilakukan dengan mereaksikan 100 ml larutan Ca dari hasil kalsinasi cangkang telur 0,3 M dan 100 ml larutan (NH4)2HPO4 0,2 M. Selanjutnya dilakukan sintering presipitat kering pada termperatur yang bervariasi mulai 1000oC sampai 1300oC. Variasi waktu sintering dipilih sesuai dengan kemampuan furnace. Variasi temperatur dan waktu sintering ditunjukkan pada Tabel 5. Analisis senyawa HA, AK dan TKF dilakukan dengan difraktometer sinar-X dan uji kelarutan dalam larutan Simulated Body Fluid (SBF).
Tabel 5 Variasi termperatur dan waktu pada sintesis TKF Termperatur (oC) Waktu (jam) Kode sampel
1000 5 T1 1000 10 T2 1000 15 T3 1100 3 T4 1300 3 T5 1300 5 T6
3. Uji kelarutan dalam Simulated Body Fluid (SBF)
Simulated Body Fluid (SBF) adalah larutan sintetik yang memiliki komposisi ionik mendekati komposisi dalam plasma darah. Dalam penelitian ini SBF dibuat dengan mencampur larutan-larutan ionik KCl 0,8 M, NaCl 2 M, NaHCO3 0,54 M, MgSO4.7H2O 0,2 M, CaCl2 52,5 mM, Tris+HCl 0,77 M, NaN3 1,54 M, KH2PO4 0,2 M. Pembuatan SBF mengikuti Muller L dan Muller FA (2006) dilakukan dengan cara menambahkan secara berurutan KCl, NaCl, NaHCO3, MgSO4.7H2O, CaCl2, Tris+HCl, NaN3, KH2PO4 sesuai dengan Tabel 6 ke dalam 70 ml aquabides. Hasil pencampuran ditambah dengan aquabides sampai 100 ml. SBF yang hasilkan dengan cara yang sama telah diuji konsentrasi ionik yang ditunjukkan pada Tabel 7.
Tabel 6 Volume larutan ionik untuk pembuatan SBF Larutan ionik SBF (ml) KCl 0,8 M 0,50 NaCl 2 M 5,60 NaHCO3 0,54 M 2,78 MgSO4.7H2O 0,2 M 0,50 CaCl2 52,5 mM 2,50 Tris+HCl 0,77 M 5,00 NaN3 1,54 M 1,00 KH2PO4 0,2 M 0,50
Tabel 7 Komposisi ionik dalam SBF Ion Jumlah (mM) Na+ 108,69 K+ 5,01 Mg2+ 1,11 Ca2+ 0,99 Cl- 155,13 SO43- 1,08 PO43- 2,01
Pada pengujian HA dan campuran HA-AK yang dipilih adalah yang disintesis dengan konsentrasi larutan Ca dari hasil kalsinasi cangkang telur 0,3 M dan (NH4)2HPO4 0,18 M sedangkan TKF yang digunakan yaitu seluruh sampel TKF. Cara uji kelarutan dilakukan dengan merendam sampel dalam 10 ml SBF selama 24 dan 48 jam. Laju kelarutan diamati dengan membandingkan bobot sebelum dan setelah perendaman.
Gambar 18 Pengujian kelarutan kalsium fosfat dalam SBF.
SBF 10 ml Serbuk kalsium fosfat Perendaman dalam SBF
(24 dan 48 jam) Penyaringan dengan whatman 40
Serbuk kalsium fosfat setelah perendaman
Tahap kedua: Pembuatan dan Karakterisasi Komposit Kalisum Fosfat- Kitosan
1. Pembuatan Komposit Kalsium Fosfat-Kitosan
Pembuatan komposit kalsium fosfat-kitosan dilakukan metode sonikasi. Larutan kitosan 2% (b/v) diperoleh dengan melarutkan serbuk kitosan dalam asam asetat 3% (v/v). Larutan kitosan yang digunakan dengan konsentrasi 2%. Larutan yang diperoleh disaring dan disimpan pada termperatur ruang selama lebih dari 12 jam untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara. Kalsium fosfat yang digunakan HA dan campuran HA-AK. Selanjutnya HA dan campuran HA-AK didispersikan dalam aquabidest dengan menggunakan ultrasonik selama 1 jam. Larutan kitosan dengan HA dan AK dicampurkan dengan fraksi massa bervariasi dengan metode sonikasi sampai homogen. Variasi fraksi massa pembuatan komposit ditunjukkan pada Tabel 8. Secara skematis pembuatan komposit kalsium fosfat-kitoan ditunjukkan pada Gambar 19. Untuk memastikan homogentitas campuran tersebut dilakukan penyimpanan selama 12 jam pada temperatur ruang. Secara visual diamati sampel terlihat tetap homogen. Selanjutnya sampel dikeringkan pada termperatur 50oC selama 15 jam. Pembuatan sampel komposit untuk masing-masing variasi dilakukan tiga kali ulangan.
Tabel 8 Variasi komposisi sintesis komposit
Kitosan (C) (%) Kalsium fosfat (A) (%) Kode Sampel
HA Campuran HA-AK 20 80 0 C1A1 64 16 C1A2 56 24 C1A3 0 80 C1A4 30 70 0 C2A1 56 14 C2A2 49 21 C2A3 0 70 C2A4
2. Karakterisasi Komposit Kalsium Fosfat-Kitosan
Komposit yang dihasilkan dikarakterisasi dengan menggunakan difraksi sinar-X, SEM dan spektroskopi FTIR. Prngukuran difraksi sinar-X dilakukan pada rentang 10-80o dengan laju 0,02o per detik. Untuk kedelapan sampel komposit dilakukan masing-masing 2 kali ulangan. Persiapan sampel untuk pengukuran dengan spektrometer FTIR dilakukan dengan mencampurkan 10 mg sampel dan 100 mg KBr kemudian ditekan sehingga membentuk pellet. Pengukuran FTIR dilakukan pada rentang bilangan gelombang 400-4000 cm-1. Untuk pengamatan morfologi dengan SEM, sebelumnya sampel dilapisi dengan emas untuk memberikan sifat konduktif pada sampel. Observasi dilakukan sampai perbesaran 20.000 kali.
Gambar 19 Proses sonikasi komposit kalsium fosfat-kitosan.
Sonikasi selama 3 jam Larutan
kitosan
Dispersi HA dan AK
Campuran Larutan kitosan + HA dan AK
Campuran homogen