Alat-alat dissecting-set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur in vitro dicuci dan dikeringkan. Kemudian bungkus tabung dengan plastik tahan panas atau letakkan pada rak tabung, sedangkan untuk botol biasanya bisa langsung diletakkan pada autoklaf. Disterilkan tabung/botol dengan autoklaf pada tekanan 1 atm dan suhu 121oC selama 60 menit. Setelah itu sterilkan secara kering tabung uji/botol di dalam oven pada suhu 150oC selama 1-2 jam.
Pembuatan Media
MS (Murashige and Skoog)
Media yang digunakan adalah media Murashige and Skoog (MS) padat. Sebelum dilakukan pembuatan media MS, dilakukan pembuatan larutan stok ZPT BAP dan NAA. Larutan stok ZPT masing-masing dibuat 100 mg/100 ml. Larutan stok BAP dan NAA disaring menggunakan minisar guna meningkatkan sterilitas dari hormon tersebut dan dilakukan di Laminar Air Flow Cabinet (LAFC).
Pada pembuatan media MS, tahap pertama adalah membuat larutan stok bahan kimia hara makro dengan pembesaran 10x, hara mikro dengan pembesaran 100x, larutan iron dengan pembesaran 50x, larutan vitamin dengan pembesaran 100x, sukrosa 30 g, myo-inositol 0,1 g dan agar 7 g. Tahap berikutnya, sukrosa dimasukkan ke dalam beaker glass yang telah berisi aquades 750 ml, lalu diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer sebagai pengaduk. Kemudian ditambahkan myo-inositol diaduk hingga larut. Dimasukkan larutan stok hara makro 100 ml, larutan stok hara mikro 10 ml, iron 8 ml dan vitamin 4 ml. Kemudian larutan ditempatkan menjadi 2000 ml. Keasaman diukur dengan pH meter. pH yang
dikehendaki adalah 5,8, untuk mengatur pH yaitu menaikkan atau menurunkan pH dapat digunakan larutan NaOH dan HCl 0,1 N. Letakkan agar mikrobiologi dan dimasak di atas kompor gas sampai larutan mendidih dan bening (semua agar telah larut). Larutan dipindahkan ke erlenmeyer berukuran 3000 ml dan ditutup dengan aluminium foil. Hasil Media MS secara keseluruhan di sterilisasi dengan tekanan 1 atm pada suhu 121°C selama 20 menit di autoklaf. Setelah proses sterilisasi selesai, media dimasukkan ke ruang kultur dan dimasukkan ke ruangan Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) untuk dibagikan ke 3 tabung erlenmeyer berukuran 1000 ml dengan masing-masing tabung berisi 650 ml. Teteskan BAP dan NAA ke masing-masing tabung uji sesuai perlakuan. Dituangkan media ke dalam tabung uji berisikan 13 ml/tabung dan ditutup penutup tabung steril untuk multiplikasi. Sehingga didapat ± 50 tabung uji. Tabung uji diberi label sesuai dengan perlakuan. Selanjutnya disimpan dalam ruang kultur sebelum digunakan. WPM (Woody Plant Medium)
Media yang digunakan adalah media Woody Plant Medium (WPM). Sebelum dilakukan pembuatan media WPM, dilakukan pembuatan larutan stok ZPT BAP dan NAA. Larutan stok ZPT masing-masing dibuat 100 mg/100 ml. Kemudian larutan stok BAP dan NAA disaring menggunakan minisar guna meningkatkan sterilitas dari ZPT tersebut dan dilakukan di Laminar Air Flow Cabinet (LAFC).
Pada pembuatan media WPM, tahap pertama adalah membuat larutan stok bahan kimia hara makro dengan pembesaran 10x, hara mikro dengan pembesaran 100x, larutan iron dengan pembesaran 50x, larutan vitamin dengan pembesaran 100x, sukrosa 50 g, myo-inositol 0,1 g dan agar 7 g. Tahap berikutnya, sukrosa
dimasukkan ke dalam beaker glass yang telah berisi aquades 750 ml, lalu diaduk dengan menggunakan magnetik stirer sebagai pengaduk. Kemudian ditambahkan myo-inositol diaduk hingga larut. Dimasukkan larutan stok hara makro 100 ml, larutan stok hara mikro 10 ml, iron 8 ml dan vitamin 4 ml. Kemudian larutan ditepatkan menjadi 2000 ml dengan menambahkan aquades. Keasaman diukur dengan pH meter. pH yang dikehendaki adalah 5,8 untuk mengatur pH yaitu menaikkan atau menurunkan pH dapat digunakan larutan KOH dan HCl 0,1 N. Ditambahkan agar biotek dan dimasak di atas kompor gas sampai larutan mendidih dan bening (semua agar telah larut). Larutan dipindahkan ke erlenmeyer berukuran 3000 ml dan ditutup dengan aluminium foil dan diikat dengan tali plastik. Kemudian media WPM di sterilisasi dengan tekanan 1 atm pada suhu 121°C selama 20 menit di autoklaf. Setelah proses sterilisasi selesai, media dimasukkan ke ruang kultur dan dimasukkan ke Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) untuk dibagikan ke 3 tabung erlenmeyer berukuran 1000 ml dengan masing-masing tabung berisi 650 ml. Teteskan BAP dan NAA ke masing-masing tabung uji sesuai perlakuan. Dituangkan media ke dalam tabung uji berisikan 13 ml/tabung dan ditutup dengan penutup tabung steril untuk multiplikasi. Sehingga diperoleh ± 50 tabung uji dari setiap perlakuannya. Tabung uji diberi label sesuai dengan perlakuan. Selanjutnya disimpan dalam ruang kultur sebelum digunakan.
Persiapan Ruang Tanam
Seluruh permukaan laminar air flow cabinet sebelumnya dibersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol 96% lalu di sterilkan dengan sinar Ultra Violet selama 1 jam sebelum proses penanaman dilakukan. Semua alat dan bahan
yang akan dipakai harus disemprot dengan alkohol 96% dan beberapa alat seperti pinset, gunting, scalpel setelah disemprot lalu dibakar di dalam ke dalam laminar air flow cabinet selama 1 menit. Hal ini dilakukan untuk menghindari resiko bahan penelitian terkontaminasi. Steribox dihidupkan dan disediakan alkohol 70% untuk membersihkan alat yang telah digunakan.
Multiplikasi
Setelah selesai tahap kultur primer (±6 minggu), eksplan yang menghasilkan tunas selanjutnya diperbanyak. Proses perbanyakan dilakukan dengan memotong tunas baru menjadi bagian yang lebih kecil, dan selanjutnya dikulturkan pada medium baru. Pada tahap ini terdapat tiga bentuk eksplan, yaitu eksplan stock (bonggol) yang merupakan eksplan awal yang diperoleh dengan memisahkan tunas baru yang terbentuk, eksplan nodal (nodus) yang diperoleh dari bagian batang tunas baru, serta eksplan shoot (pucuk) yang merupakan bagian apikal tunas baru, biasanya mengandung beberapa daun muda. Eksplan yang digunakan pada penelitian ini adalah eksplan stock (bonggol). Eksplan tersebut dikulturkan di 6 medium baru. Eksplan yang akan dikulturkan ke dalam media tanam diletakkan di piringan kaca tebal dengan alas kertas plano. Kemudian eksplan ditanamkan ke dalam tabung uji sesuai dengan perlakuan, setiap tabung uji terdiri dari 1 eksplan. Kemudian ujung tabung uji ditutup dengan menggunakan kain kasa steril yang dibalut dan diikat benang. Kegiatan penanaman dilakukan di LAFC dan di bawah api bunsen. Tabung uji diletakkan di rak kultur di bawah cahaya dan ruangan memiliki air conditioner dengan suhu 18oC. Kondisi pemeliharaan dan lingkungan kultur sama seperti pada tahap kultur
primer. Satu siklus tahap multiplikasi adalah empat minggu, dan tahap ini dapat diulang antara 3 – 12 siklus tergantung jumlah planlet yang diinginkan.
Pemeliharaan Eksplan dan Pengaturan Lama Penyinaran
Tabung-tabung uji diletakkan pada rak kultur di dalam ruang kultur. Ruangan ini diusahakan bebas dari bakteri dan cendawan, dimana setiap hari disemprot dengan alkohol 96% atau dan disemprot formalin agar bebas dari organisme yang menyebabkan terjadi kontaminasi. Dalam penelitian ini suhu ruangan kultur yang digunakan + 20-25°C, paling optimum 18oC. Sedangkan untuk pengaturan lama penyinaran disesuaikan dengan perlakuan. Perlakuan lama penyinaran pertama, semua kultur diletakkan di rak kultur dengan intensitas cahaya 2000 lux dengan lama penyinaran 12 jam terang dan 12 jam gelap. Perlakuan lama penyinaran kedua, tabung-tabung uji diletakkan pada rak kultur dengan intensitas cahaya 2000 lux dengan lama penyinaran 24 jam terang. Sedangkan perlakuan lama penyinaran ketiga, tabung-tabung uji diletakkan pada rak kultur yang ditutup dengan kain gelap/hitam (tanpa merubah suhu) sehingga diperoleh penyinaran dengan besaran intensitas cahaya 0 lux, serta dengan kondisi ruangan memiliki air conditioner dengan hefa yang dibersihkan selama 6 bulan sekali. Apabila mengalami kontaminasi, segera diambil dari rak kultur agar mencegah kontaminasi ke tabung lainnya.
Peubah Amatan
Persentase Eksplan Membentuk Tunas (%)
Pengamatan dilakukan pada akhir percobaan (4 Minggu Setelah Kultur) berdasarkan jumlah tunas yang muncul dari keseluruhan ulangan.
Persentase terbentuknya tunas = jumlah tunas yang terbentuk x 100% jumlah eksplan seluruhnya (per perlakuan) Umur Muncul Tunas (hari)
Umur kemunculan tunas dihitung berdasarkan hari ke berapa munculnya tunas.
Jumlah Tunas (tunas)
Dihitung pada akhir penelitian (4 Minggu Setelah Kultur) dengan menghitung banyaknya tunas baru yang terbentuk dari setiap eksplan.
Panjang Tunas (cm)
Panjang tunas diukur pada tunas tertinggi dengan menggunakan kertas milimeter yang diukur dari tempat munculnya tunas (pangkal) sampai ujung tunas tertinggi. Panjang tunas keseluruhan dari setiap perlakuan dibagi dengan jumlah ulangan. Pengukuran dilakukan pada akhir penelitian (4 Minggu Setelah Kultur). Persentase Eksplan Membentuk Daun (%)
Jumlah daun dihitung dari daun yang terbentuk yang telah terbuka sempurna pada eksplan. Pengamatan dilakukan pada akhir penelitian (4 Minggu Setelah Kultur). Persentase terbentuknya daun dihitung pada akhir penelitian dengan rumus:
Persentase terbentuknya daun = jumlah daun yang terbentuk x 100% jumlah eksplan seluruhnya (per perlakuan) Jumlah Daun (helai)
Jumlah daun dihitung dari daun yang terbentuk yang telah terbuka sempurna pada eksplan yang dilakukan pada akhir penelitian (4 Minggu Setelah Kultur).
Kehadiran Kalus (visual)
Kehadiran kalus dilihat dari ada atau tidaknya kemunculan kalus dari bekas potongan/pelukaan eksplan atau dari bagian manapun dari eksplan. Pengamatan dilakukan pada akhir penelitian (4 Minggu Setelah Kultur).
Warna Kalus (visual)
Dilihat dari penampakan warna kalus yang muncul. Warna kalus dilihat pada akhir penelitian (4 Minggu Setelah Kultur).
Morfogenesis
Kemunculan tunas di luar jaringan meristem aksilar (pangkal batang, ujung batang maupun bagian lainnya dari eksplan).
