Ekstrak enzim yang diperoleh setelah sonikasi dipisahkan dari debris sel dengan sentrifugasi. Debris sel akan mengendap karena memiliki berat molekul yang lebih besar daripada enzim restriksi sehingga ekstrak enzim akan berada pada bagian supernatan. Ekstrak enzim yang diperoleh merupakan ekstrak enzim kasar. Ekstrak enzim tersebut dapat langsung digunakan untuk uji aktivitas, namun masih terdapat partikel pengotor seperti materi genetik bakteri dan kontaminan nuklease spesifik lainnya. Enzim restriksi yang digunakan harus bebas dari DNA bakteri karena DNA bakteri dapat berikatan dengan enzim restriksi (inhibitor enzim). Selain itu, DNA bakteri yang tidak dipisahkan akan muncul sebagai fragmen-fragmen dalam elektroforesis sehingga dapat menyebabkan kesalahan analisis hasil pemotongan enzim restriksi.
Metode yang digunakan untuk memisahkan protein adalah metode pemisahan dua fase. Menurut Frank (1993), makromolekul seperti protein dan asam nukleat akan memisah berdasarkan struktur dan komposisi ionik dalam sistem fase. Sistem dua fase diperoleh dengan mencampurkan dua polimer dalam air. Polimer yang dipelajari dan banyak digunakan adalah PEG dengan dekstran atau PEG dengan garam seperti kalium fosfat (Kula (1979) dan Albertsson (1986) di acu dalamAndrew dan Asenjo (1989)).
Penambahan polietilen glikol (PEG) akan menyebabkan terjadinya hidrasi molekul air sehingga protein akan bersatu membentuk endapan. Menurut Suwanto et al., (1993), keuntungan penggunaan PEG adalah tidak bersifat toksik, tidak mudah terbakar, dan memiliki efek protektif terhadap protein. Suhartono (1989) juga menyebutkan bahwa enzim-enzim stabil dalam fase PEG. Sistem dua fase yang terdiri atas dekstran dan PEG sering digunakan untuk pemisahan enzim, protein, dan antibiotik. Paquet et.al.
(1993) menggunakan sistem ini untuk memisahkan antibiotik pristinamycins. Polimer lain yang sering digunakan dalam presipitasi asam nukleat adalah PEI (polietilen imin). Menurut Imber dan Bickle (1981), PEI yang digunakan adalah PEI 10% dengan konsentrasi akhir pada supernatan sebesar 1% dan garam yang digunakan adalah NaCl dengan konsentrasi akhir 0.2 M.
29
Chandrashekaran et al. (1999) menggunakan PEI dengan konsentrasi akhir 1% dan KCl 0.25 M untuk ekstraksi enzim KpnI. PEI juga digunakan untuk ekstraksi enzim AbeI oleh Vitkute et al. (1998). Konsentrasi akhir PEI adalah 0.2% dengan pH 7.5 dan garam KCl untuk presipitasi asam nukleat. Perbandingan metode yang digunakan untuk presipitasi asam nukleat dalam isolasi enzim restriksi dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Metode ekstraksi enzim endonuklease restriksi Nama enzim Presipitasi asam
nukleat Pemekatan enzim Purifikasi lanjut BalI (Gelinas et al., 1977) Streptomisin sulfat - 1. kromatografi DEAE- Selulosa 2. kromatografi kolom fosfoselulosa (2x) 3. kromatografi kolom ω- aminoheptil sepharosa BglI (Imber dan Bickle, 1981) PEI 1 % + NaCl 0.2 M (NH4)2SO4 70% 1. kromatografi kolom Heparin-Agarosa (HA) 2. kromatografi kolom DEAE-Sephacel SviI (Yun et al., 1995) Streptomisin sulfat (NH4)2SO4 45-80% 1. kromatografi kolom fosfoselulosa P11 2. kromatografi kolom DEAE-Selulosa 3. kromatografi Sephachryl S-200 HR AbeI (Vitkute et al., 1998) PEI 0.1 % pH 7.5 + KCl 0.1 M (NH4)2SO4 35-50% 1. kromatografi kolom DEAE-Selulosa 2. kromatografi kolom
Heparin Agarosa (HA)- Sepharose Ekstrak enzim Rhodobacter sp.MW 5 (Juliana, 1996) dekstran 7.1% dan PEG 6000 28.4 % (2x) - - Ekstrak enzim Xilanase negatif A (Rusli, 2006) dekstran 7.1% dan PEG 8000 28.4 % (2x) - -
Penelitian ini dekstran 7.1% dan PEG 6000 28.4 % (2x)
Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan protein dalam sistem dua fase adalah jenis polimer yang digunakan, berat molekul dan ukuran polimer, konsentrasi polimer, kekuatan ion, pH, dan kemurnian larutan protein. Pada umumnya, polimer dengan berat molekul lebih besar dan konsentrasi yang lebih rendah dibutuhkan untuk pembentukan sistem dua fase. Hal lain yang dapat dilakukan untuk optimasi pemisahan dengan sistem dua fase menggunakan PEG dan dekstran adalah menggunakan PEG dengan berat molekul lebih rendah, meningkatkan berat molekul dekstran, meningkatkan pH jika digunakan fosfat, dan meningkatkan konsentrasi fosfat (Andrews dan Asenjo, 1989).
Penelitian ini menggunakan sistem dua fase yang terdiri dari dekstran 7.1% dan PEG 6000 28.4 %. Menurut Juliana (1996), komposisi tersebut telah memberikan hasil yang baik dalam presipitasi asam nukleat. Pengulangan ekstraksi dengan polimer konsentrat sebanyak 2 kali menghasilkan enzim restriksi dengan aktivitas pemotongan yang baik pada substrat DNA fage lambda. Ekstraksi sebanyak 1 kali menghasilkan enzim restriksi yang tidak dapat memotong DNA fage lambda. Hal tersebut diakibatkan enzim hasil ekstraksi masih mengandung senyawa pengotor seperti asam nukleat. Ekstraksi sebanyak 3 kali juga tidak menghasilkan enzim restriksi dengan aktivitas pemotongan yang baik karena enzim mungkin ikut mengendap bersama polimer konsentrat atau mengalami kerusakan akibat ekstraksi berlebihan.
Chaplin (2004) mengemukakan bahwa sistem pemisahan berdasarkan fase sangat penting dalam aplikasi bioteknologi karena pemisahan protein dapat dilakukan secara cepat tanpa merusak struktur protein itu sendiri. Sistem ini juga telah berhasil memisahkan tipe yang berbeda dari membran dan organel sel dan purifikasi enzim. Sel, protein, dan material terdistribusi dalam dua fase berdasarkan koefisien partisinya (P), yaitu :
Dimana Ct menunjukkan konsentrasi fase atas dan Cb menunjukkan konsentrasi fase bawah. Hasil dan efisiensi pemisahan ditentukan oleh jumlah
31
relatif material pada dua fase tersebut dan tergantung pada perbandingan volume antar fase. Nilai koefisien partisi lebih besar dari tiga dibutuhkan jika hasil (yield) diperoleh dari ekstraksi satu kali. Biasanya koefisien partisi untuk protein berkisar antara 0.01-100. Nilai koefisien partisi dalam sistem dua fase yang digunakan dalam penelitian ini adalah empat (4). Dengan demikian, komposisi dekstran dan PEG 6000 tersebut cukup sesuai untuk pemisahan enzim dengan sistem dua fase.
Johansson (1998) mengemukakan bahwa penambahan garam merupakan salah satu cara memberikan kekuatan ionik dalam sistem fase, yang dapat mencegah terjadinya ikatan antara enzim restriksi dengan DNA bakteri. Enzim dapat diekstraksi dari fase atas (PEG) jika dilakukan penambahan garam (Chaplin, 2004). Garam yang digunakan dalam penelitian ini adalah NaCl dengan konsentrasi akhir 75 mM. Menurut Juliana (1996), penambahan NaCl sebanyak 75 mM dalam ekstraksi enzim endonuklease restriksi telah memberikan hasil yang terbaik. Konsentrasi garam yang digunakan harus diperhatikan karena konsentrasi garam sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim restriksi. Konsentrasi garam yang terlalu tinggi dapat menyebabkan enzim tidak mampu mengikat dan memotong substrat DNA, sedangkan konsentrasi garam yang terlalu rendah dapat menurunkan aktivitas enzim restriksi.
