C. PENGUJIAN AKTIVITAS EKSTRAK ENZIM RESTRIKSI
1. Plasmid sebagai Substrat
Plasmid direaksikan dengan ekstrak enzim restriksi dalam buffer reaksi. Kontrol yang digunakan adalah kontrol negatif, yaitu plasmid utuh.
Plasmid utuh dapat memiliki dua macam konfigurasi, yaitu superkoil dan
open circular (Brown, 1990). Bentuk superkoil mengalami pergerakan tercepat dan open circular mengalami pergerakan terlambat. Plasmid yang direaksikan dengan enzim diharapkan menghasilkan plasmid linier, yaitu berupa pita yang terletak diantara pita plasmid superkoil dan open circular. Jika pemotongan kurang sempurna, bentuk open circular dan linier dapat dihasilkan (Roberts dan Halford, 1993).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Gambar 5. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim A, Y1, K1, K2, P1, P, MW4, MW5, MW7, MW9, MW10 dengan substrat plasmid pUC 19, digesti semalam (37oC), agarosa 1%.
1 : DNA fage lambda(10 ng/ μl) 2 : Plasmid pUC 19 utuh (070207) 3 : Plasmid pUC 19 utuh (110207) 4 : Plasmid pUC 19 utuh (070307)
5 : Ekstrak enzim Xilanase negatif A (Ekstrak A) + pUC 19 6 : Ekstrak enzim Xilanase negatif A (Ekstrak A) + pUC 19 7 : Ekstrak enzim Bacillus pumlus Y1 (Ekstrak Y1) + pUC 19 8 : Ekstrak enzim MBXi K1 (Ekstrak K1) + pUC 19
9 : Ekstrak enzim MBXi K2 (Ekstrak K2) + pUC 19
10 : Ekstrak enzim Pseudomonas syringae (Ekstrak P)+ PuC 19 11 : Ekstrak enzim MBXi P1 (Ekstrak P1) + pUC 19
12 : Ekstrak enzim Rhodobacter sp.MW4 (Ekstrak 4)+ pUC 19 13 : Ekstrak enzim Rhodobacter sp.MW5 (Ekstrak 5)+ pUC 19 14 : Ekstrak enzim Rhodobacter sp.MW7 (Ekstrak 7)+ pUC 19 15 : Ekstrak enzim Rhodobacter sp.MW9 (Ekstrak 9)+ pUC 19 16 : Ekstrak enzim Rhodobacter sp.MW10 (Ekstrak 10)+ pUC19
33
Gambar 5 menunjukkan hasil elektroforesis DNA plasmid yang direaksikan dengan berbagai ekstrak enzim. Sumur kedua hingga keempat adalah plasmid utuh yang memperlihatkan tiga konformasi plasmid, yaitu
open circular, linier, dan superkoil. Pita plasmid pada keempat sumur tersebut merupakan kontrol negatif. Kontrol negatif digunakan untuk mengetahui seberapa jauh kerusakan plasmid atau DNA akibat perlakuan fisik. Plasmid dapat mengalami perubahan konformasi karena digesti oleh enzim restriksi maupun perlakuan fisik, seperti memipet dan menggoyang. Pita paling atas pada setiap sumur adalah pita DNA genom bakteri yang masih terbawa saat isolasi plasmid. Namun kehadiran pita tersebut tidak mempengaruhi reaksi digesti plasmid oleh ekstrak enzim. Pita pada sumur kesebelas sampai sumur keenambelas tidak menunjukkan aktivitas pemotongan karena pita plasmid masih memiliki konformasi seperti pita plasmid utuh pada sumur kedua, ketiga, dan keempat sehingga dapat diperkirakan ekstrak enzim tersebut tidak memiliki aktivitas restriksi pada plasmid pUC 19. Kemungkinan terjadi kesalahan dalam tahapan proses ekstraksi enzim sehingga enzim restriksi dari Rhodobacter sp. MW4, MW5, MW7, MW9, dan MW10 tidak terekstrak. Kemungkinan lain adalah kontaminasi kultur stok atau kultur sudah tidak baru lagi (1998)
sehingga bakteri yang tumbuh pada media bukan bakteri yang diinginkan. Pita pada sumur ketujuh kemungkinan menunjukkan plasmid yang
telah terpotong menjadi bentuk linier seluruhnya. Konformasi open circular dan superkoil tidak ada lagi dan digantikan oleh satu pita, yaitu pita plasmid linier yang berada diantara pita plasmid open circular dan superkoil. Pemotongan dapat dikatakan cukup sempurna karena konformasi plasmid yang terbentuk hanya satu jenis, yaitu linier. Indikasi pemotongan juga dapat dilihat dari turunnya pita DNA genom bakteri. Dengan demikian, ekstrak enzim yang berpotensi diujikan lebih lanjut adalah ekstrak enzim restriksi dari bakteri Y1 (Bacillus pumilus Y1). Namun, ekstrak enzim A, K1, K2, dan P juga perlu diujikan lebih lanjut dengan peningkatan jumlah enzim yang digunakan karena adanya indikasi
pemotongan jika dilihat dari intensitas warna terang yang memudar pada pita plasmid.
Memudarnya warna (terang) pita plasmid merupakan indikasi awal bahwa enzim mungkin memotong plasmid, tetapi pemotongannya belum sempurna. Pemotongan belum sempurna akan mengakibatkan pita yang diperoleh masih seperti pita plasmid utuh namun memiliki intensitas warna (terang) yang lebih pudar. Hal tersebut dapat dilihat pada sumur kelima, kedelapan, kesembilan, dan kesebelas sehingga perlu dilakukan konfirmasi ulang. Konfirmasi dilakukan dengan melakukan digesti ulang terhadap ekstrak A, K1, K2, P, dan Y1. Jumlah enzim yang digunakan menjadi dua kali lipat dengan komposisi 32 μl ekstrak enzim, 4 μl DNA plasmid, dan 4 μl buffer reaksi stok 10 x.
1 2 3 4 5 6 7 8
Gambar 6. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim A, Y1, K1, K2, P1 (peningkatan volume enzim dua kali lipat) dengan substrat plasmid pUC 19, digesti semalam (37oC), agarosa 1%.
1 : Plasmid pUC 19 utuh (070207) 2 : Ekstrak enzim A + pUC 19 3 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 4 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 (1x) 5 : Ekstrak enzim K1 + pUC 19 6 : Ekstrak enzim K2 + pUC 19 7 : Ekstrak enzim P1 + pUC 19 8 : Plasmid pSl utuh
Gambar 6 menunjukkan hasil elektroforesis DNA plasmid yang direaksikan dengan ekstrak enzim Y1, A, K1, K2, dan P dengan
35
peningkatan volume enzim sebesar dua kali lipat. Peningkatan volume enzim dilakukan untuk mengantisipasi kemungkinan ekstrak memiliki aktivitas enzim restriksi, namun aktivitasnya rendah sehingga diharapkan penambahan volume enzim akan meningkatkan aktivitas restriksi yang dimiliki enzim.
Pita paling atas pada setiap sumur merupakan pita DNA genom bakteri. Pita kedua, ketiga, dan keempat (dari pita paling atas, DNA genom) adalah pita plasmid pUC 19 yang terdiri dari tiga konformasi, yaitu open circular, linier, dan superkoil. Konformasi linier dapat terbentuk selama penyimpanan dan akibat perlakuan fisik. Smear pada pita paling bawah adalah RNA. RNA masih terdapat karena tidak dilakukan penambahan RNase saat isolasi plasmid. Menurut Pingoud et al. (1993), RNA seluler dapat dihilangkan dengan penambahan DNase-free Rnase. Kontaminasi protease, terutama nuklease non spesifik dapat dihilangkan dengan ekstraksi fenol dan kloroform setelah inkubasi dengan proteinase K.
Ekstrak enzim A, K1, K2, dan P kemungkinan tidak memiliki aktivitas enzim endonuklease restriksi karena plasmid tidak mengalami perubahan konformasi. Hal tersebut dapat dilihat pada pita kedua, kelima, keenam, dan ketujuh yang tidak berbeda dengan kontrol negatif, yaitu plasmid utuh. Tidak adanya aktivitas enzim endonuklease restriksi bukan berarti tidak ada enzim endonuklease restriksi pada ekstrak enzim tersebut. Hal tersebut dapat diakibatkan oleh tidak adanya situs pengenalan dan pemotongan pada pUC 19 sehingga ekstrak enzim tidak dapat memotong DNA plasmid.
Pita pada sumur ketiga menunjukkan konformasi plasmid linier sehingga kemungkinan plasmid terpotong oleh ekstrak enzim Y1. Pita pada sumur keempat juga menunjukkan plasmid yang terpotong namun masih terdapat konformasi plasmid superkoil selain konformasi linier. Hal tersebut menunjukkan bahwa peningkatan volume enzim meningkatkan aktivitas enzim restriksi. Dengan demikian, ekstrak enzim bakteri Y1 (Bacillus pumilus Y1) memiliki aktivitas enzim endonuklease restriksi
sehingga diperlukan uji lebih lanjut dengan menggunakan substrat DNA fage lambda dan pengujian kondisi reaksi optimum yang dilakukan dengan variasi garam dan konsentrasinya.
Selain penggunaan kontrol negatif, upaya lain yang dapat dilakukan untuk memberikan hasil elektroforesis yang lebih baik adalah dengan memberikan kondisi reaksi optimum pada tahap digesti substrat dengan ekstrak enzim. Salah satu faktor yang mempengaruhi kondisi reaksi optimum adalah kekuatan ionik. Kekuatan ionik dapat diperoleh dengan menambahkan NaCl, KCl, dan CaCl2 ke dalam buffer reaksi stok 10x. Setiap enzim memiliki preferensi masing-masing terhadap jenis dan konsentrasi garam. Sebagai contoh, enzim SmaI yang memiliki aktivitas optimum pada 20 mM KCl. Namun, pengaturan kekuatan ionik ini harus diperhatikan karena konsentrasi yang terlalu kecil dapat menyebabkan terjadinya aktivitas bintang (star activity) dan konsentrasi yang terlalu tinggi dapat menyebabkan inaktivasi enzim endonuklease restriksi nonspesifik kontaminan atau menghambat aktivitas enzim endonuklease restriksi (Pingoud et al., 1993). Aktivitas bintang adalah keadaan dimana enzim restriksi kehilangan spesifitasnya terhadap sekuens DNA sehingga selain memotong sekuens spesifik yang dikenalinya, enzim restriksi juga memotong substrat pada situs lainnya yang tidak spesifik (Sambrook et al., 1989).
Pengujian dilakukan dengan melakukan perlakuan perbedaan konsentrasi garam, yaitu NaCl 50 mM, 100 mM, dan 150 mM, KCl 50 mM, 100 mM, dan 150 mM, CaCl2 50 mM, 100 mM, dan 150 mM. Jenis garam dan konsentrasinya ditentukan berdasarkan data kondisi reaksi berbagai enzim endonuklease restriksi komersial dalam Pingoud et al.
(1993), dimana garam yang paling umum digunakan adalah NaCl. Pengujian pengaruh jenis dan konsentrasi garam dilakukan dengan mengunakan substrat plasmid pUC 19. Hasil uji dapat dilihat pada Gambar 7 berikut.
37
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Gambar 7. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim Y1 dengan substrat plasmid pUC 19 (variasi jenis dan konsentrasi garam), digesti semalam (37oC), agarosa 1%.
1 : Plasmid pUC 19 utuh (7 Februari 2007) 2 : DNA Lambda Fermentas (10 ng/ μl)
3 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 50 mM NaCl 4 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 100 mM NaCl 5 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 50 mM KCl 6 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 100 mM KCl 7 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 150 mM NaCl 8 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 150 mM KCl 9 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 50 mM CaCl2 10 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 100 mM CaCl2 11 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 150 mM CaCl2
Pita paling atas pada setiap sumur merupakan pita DNA genom. Pita pada sumur kesatu merupakan pita plasmid pUC 19 utuh, sedangkan pita pada sumur kedua merupakan pita DNA fage lambda utuh. DNA fage lambda digunakan untuk membandingkan intensitas warna (terang) pita plasmid dan kontrol DNA genom bakteri.
Sumur ketiga hingga kedelapan menunjukkan hasil pemotongan yang baik. Pita-pita plasmid linier tersebut terlihat dengan jelas pada sumur ketiga, kelima, keenam, dan kedelapan, dimana hal ini menunjukkan bahwa ekstrak enzim Y1 membutuhkan buffer dengan penambahan NaCl dan KCl. Namun, smear terbentuk pada sumur kesembilan, kesepuluh, dan kesebelas sehingga pita linier plasmid tidak terlihat dengan jelas. Smear dapat terjadi akibat pemotongan DNA genom bakteri oleh ekstrak enzim atau adanya kontaminan nuklease. Senyawa kontaminan tersebut dapat berupa eksonuklease dan endonuklease nonspesifik.
Pengujian aktivitas restriksi yang dimiliki oleh enzim dilakukan dengan menggunakan perlakuan double digest, dimana aktivitas enzim hasil ekstraksi dibandingkan dengan aktivitas enzim restriksi komersial. Perlakuan double digest dapat digunakan untuk pendugaan situs pengenalan dan pemotongan yang dimiliki oleh ekstrak enzim endonuklease restriksi hasil isolasi. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan dua enzim sekaligus, yaitu ekstrak enzim Y1 dan enzim restriksi komersial yang direaksikan terhadap plasmid pUC 19. Hasil pengujian dapat dilihat pada Gambar 8.
Perlakuan double digest memberikan hasil bahwa ekstrak enzim Y1 dipastikan memiliki aktivitas restriksi, khususnya pada plasmid pUC 19. Sumur ketiga, kesepuluh, dan kesebelas menunjukkan pita plasmid linier yang merupakan hasil pemotongan plasmid pUC 19 oleh ekstrak enzim Y1. Ekstrak enzim Y1 hasil ekstraksi ulang kedua juga diujikan aktivitasnya. Namun, ekstrak enzim Y1 ulangan kedua ini tidak memiliki aktivitas endonuklease restriksi. Hal tersebut mungkin terjadi akibat kesalahan selama tahap ekstraksi enzim, seperti inkubasi dalam es. Sumur kesepuluh dan kesebelas menunjukkan pita plasmid linier yang terletak di bawah pita DNA genom bakteri. Pita plasmid linier yang terbentuk cukup tebal dan terang sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak enzim Y1 membutuhkan kekuatan ion dari NaCl atau KCl.
39 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 3000 2000
Gambar 8. Hasil uji aktivitas restriksi ekstrak enzim Y1 dengan perlakuan
double digest, digesti semalam (37oC), agarosa 1%. 1 : DNA Ladder 1 Kb
2 : DNA fage lambda utuh (10 ng/ μl), 7 μl 3 : Plasmid pUC 19 utuh
4 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 (normal digest) 5 : Enzim HindIII + pUC 19
6 : Enzim BamHI + pUC 19 7 : Enzim PstI + pUC 19
8 : Ekstrak enzim Y1 + enzim HindIII + pUC 19 9 : Ekstrak enzim Y1 + enzim BamHI + pUC 19 10 : Ekstrak enzim Y1 + enzim PstI+ pUC 19 11 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 50 mM NaCl 12 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 50 mM KCl
13 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 (ekstraksi ulangan ke-2)
Pita pada sumur keempat menunjukkan plasmid pUC 19 yang dipotong oleh enzim HindIII. Hasil pemotongan plasmid pUC 19 oleh enzim HindIII menghasilkan dua pita. Seharusnya pita yang terbentuk hanya ada satu karena HindIII hanya memiliki satu situs pada plasmid pUC 19, yaitu pada basa urutan ke-447. Perlakuan double digest dengan menggunakan ekstrak enzim Y1 dan enzim HindIII dapat dilihat pada 2000
sumur ketujuh, dimana terbentuk satu pita yang terletak diantara pita plasmid open circular dan superkoil. Pita yang terbentuk hanya ada satu sehingga dapat disimpulkan bahwa situs pemotongan ekstrak enzim Y1 mungkin berada dekat dengan situs pemotongan enzim HindIII.
Pita pada sumur kelima menunjukkan plasmid pUC 19 yang tidak terpotong oleh enzim BamHI karena pita plasmid masih sama seperti pita plasmid utuh (pita pada sumur kedua). Seharusnya terbentuk satu pita plasmid linier karena enzim BamHI memiliki satu situs pemotongan pada plasmid pUC 19, yaitu pada basa urutan ke-417. Perlakuan double digest
ekstrak enzim Y1 dengan enzim BamHI dapat dilihat pada sumur kedelapan, dimana terbentuk dua pita yang terletak diantara konformasi plasmid open circular dan superkoil. Namun, hasil yang diperoleh tidak dapat dianalisis lebih lanjut karena tidak diperoleh hasil pemotongan plasmid pUC 19 oleh enzim BamHI. Hal tersebut juga terjadi pada enzim
PstI, dimana plasmid pUC 19 tidak dipotong oleh enzim PstI (sumur keenam). Seharusnya terbentuk satu pita plasmid linier karena enzim
BamHI memiliki satu situs pemotongan pada plasmid pUC 19, yaitu pada basa urutan ke-435. Analisis hasil double digest enzim PstI dan ekstrak enzim Y1 tidak dapat dilakukan karena kontrol plasmid pUC 19 yang didigesti dengan PstI tidak ada.
Tabel 7. Perlakuan double digest
Enzim Jumlah Pita
HindIII 2 BamHI - PstI - Y1 1 Y1 + HindIII 1 Y1 + BamHI 2 Y1 + PstI 2 pUC 19 + Y1 : 2600 bp
pUC 19 + HindIII : 2600 bp pUC 19 + Y1 + HindIII : 2000 bp
41
Pendugaan situs pemotongan ekstrak enzim Y1 pada plasmid pUC 19 masih dilakukan secara kasar karena enzim belum dimurnikan. Berdasarkan sketsa pemotongan plasmid diatas dapat diduga bahwa situs pengenalan ekstrak enzim Y1 berdekatan dengan enzim HindIII, yaitu sekitar pada urutan basa ke-447. Pita yang terbentuk akibat perlakuan
double digest berukuran kurang dari 2600 pb. Hal tersebut menunjukkan situs pemotongan ekstrak enzim Y1 yang berdekatan dengan enzim
HindIII sehingga memungkinkan diperolehnya dua fragmen DNA plasmid setelah pemotongan. Namun, fragmen yang terbentuk sangat kecil (akibat letak situs pemotongan enzim yang berdekatan) sehingga fragmen yang berukuran lebih kecil tidak terlihat pada hasil elektroforesis.
Pengujian ulang dilakukan dengan menggunakan enzim komersial
BamHI karena bakteri penghasil enzim tersebut adalah Bacillus amiloliquefaciens. Ekstrak enzim Y1 yang digunakan dalam penelitian ini juga merupakan ekstrak enzim dari Bacillus pumilus Y1. Dengan demikian kedua enzim berasal dari genus yang sama, yaitu Bacillus. Penggunaan enzim dari genus yang sama diharapkan memberikan pendekatan terhdap hasil reaksi enzim dengan substrat DNA. Perlakuan double digest
dilakukan dengan metode yang berbeda, yaitu enzim komersial dan enzim hasil ekstraksi tidak dicampur bersama-sama, tetapi secara bertahap (delapan jam setelah reaksi dengan enzim pertama baru ditambahkan enzim kedua). Perlakuan dua tahap tersebut diharapkan dapat memberikan hasil digesti yang lebih baik. Ekstrak enzim Y1 mungkin akan memotong plasmid pUC 19 dahulu, kemudian enzim komersial BamHI akan memotong plasmid yang telah didigesti oleh ekstrak enzim Y1 sehingga akan terbentuk dua pita plasmid. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada Gambar 9.
1 2 3 4 5 6 7 8
3000 2000
Gambar 9. Hasil uji aktivitas restriksi ekstrak enzim Y1 dengan perlakuan
double digest (ulangan kedua), digesti semalam (37oC), agarosa 1%.
1 : DNA Ladder 1 Kb
2 : DNA fage lambda utuh (10 ng/ μl), 7 μl 3 : Plasmid pUC 19 utuh
4 : Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 (normal digest) 5 : Enzim BamHI + pUC 19
6 : Enzim enzim Y1 + enzim BamHI + pUC 19
7 : Enzim enzim Y1 + enzim BamHI + pUC 19 (bertahap) 8 : Plasmid pUC 19 utuh
Perlakuan double digest ditunjukkan pada sumur keempat hingga ketujuh. Pita paling atas pada sumur ketiga hingga sumur kedelapan adalah pita DNA genom bakteri. Pita kedua, ketiga, dan keempat pada sumur ketiga adalah pita plasmid pUC 19 utuh dengan tiga konformasi. Pita dibawah pita DNA genom bakteri pada sumur keempat hingga ketujuh merupakan pita plasmid konformasi linear yang telah terpotong oleh ekstrak enzim Y1 maupun BamHI. Perlakuan double digest secara bertahap memberikan hasil yang cukup berbeda nyata. Hal tersebut dapat dilihat pada sumur keenam dan ketujuh. Sumur keenam menunjukkan digesti plasmid pUC 19 dengan menggunakan ekstrak enzim Y1 dan
BamHI selama 16 jam (semalam) penuh. Pita yang terbentuk sejajar dengan pita plasmid linier pada sumur kelima sehingga dapat disimpulkan bahwa plasmid didigesti oleh BamHI karena pita yang terbentuk sama dengan pita hasil digesti plasmid oleh BamHI saja. Sumur ketujuh menunjukkan digesti plasmid pUC 19 dengan menggunakan ekstrak enzim Y1 selama 8 jam, kemudian ditambahkan BamHI dan digesti dilanjutkan
43
kembali selama 8 jam sehingga total reaksi tetap 16 jam. Pita yang terbentuk sejajar dengan pita plasmid linier pada sumur keempat sehingga dapat disimpulkan bahwa plasmid pUC 19 didigesti oleh ekstrak enzim Y1.
Perlakuan double digest ulangan kedua ini tidak dapat digunakan untuk menduga situs pemotongan enzim secara optimum karena hanya diperoleh informasi bahwa pita plasmid hasil pemotongan enzim BamHI berada di bawah pita plasmid hasil pemotongan ekstrak enzim Y1. Analisis double digest dengan pemetaan hasil pemotongan juga tidak dapat digunakan untuk menduga situs restriksi ekstrak enzim Y1 pada plasmid pUC 19. Hasil pemotongan yang diperoleh tidak spesifik dan menunjukkan perbedaan situs restriksi enzim seperti yang terlihat pada pemetaan di bawah ini.
pUC 19 + Y1 : 3000 bp
pUC 19 + BamHI : 2600 bp pUC 19 + Y1 + BamHI : 2600 bp
pUC 19 + Y1 + BamHI : 3000 bp
Ekstrak enzim Y1 ekstraksi ulangan kedua tidak memiliki aktivitas enzim endonuklease restriksi sehingga dilakukan kembali ekstraksi ulangan ketiga sehingga diperoleh bahwa ekstrak enzim Y1 ulangan ketiga memiliki aktivitas enzim endonuklease restriksi. Hasil digesti plasmid pUC 19 oleh ekstrak enzim Y1 ulangan ketiga dapat dilihat pada Gambar 10. Smear yang terbentuk pada sumur kedua hingga kelima menunjukkan DNA genom yang terpotong oleh ekstrak enzim Y1. Potongan-potongan DNA genom bakteri yang terbentuk sangat banyak dan memiliki perbedaan jumlah basa yang sangat berdekatan sehingga membentuk
smear. Namun, pita yang terdapat pada sumur kedua hingga kelima menunjukkan pita plasmid konformasi linear yang terbentuk akibat pemotongan plasmid oleh ekstrak enzim Y1. Adanya aktivitas enzim restriksi setelah pengulangan ekstraksi enzim menunjukkan bahwa
Bacillus pumilus Y1 dapat digunakan sebagai sumber bakteri penghasil enzim endonuklease restriksi yang cukup potensial.
Enzim yang dihasilkan oleh Bacillus pumilus Y1 tidak hanya endonuklease restriksi saja. Bakteri ini juga menghasilkan enzim protease. Enzim protease dapat mendegradasi protein termasuk protein enzim sehingga aktivitas protease perlu dihambat agar enzim endonuklease restriksi tidak terdegradasi. Menurut Santoso (1986), PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) dapat menghambat aktivitas protease yang dihasilkan oleh Bacillus pumilus Y1. Selain itu, penambahan senyawa pereduksi seperti β-merkaptoetanol dan dithiothreitol menurunkan aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh Bacillus pumilus Y1.
1 2 3 4 5 6
Gambar 10. Hasil pengujian ekstrak enzim Y1 ulangan ketiga dengan plasmid pUC 19, digesti semalam (37oC), agarosa 1%. 1: Plasmid pUC 19 utuh
2: Ekstrak enzim Y1 + pUC 19
3: Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 50 mM KCl 4: Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + 50 mM NaCl 5: Ekstrak enzim Y1 + pUC 19 + buffer reaksi BamHI 6: Enzim BamHI + pUC 19
