BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.4 Kromatografi Cair kinerja tinggi (KCKT)
2.4.1 Prinsip Kerja KCKT
Prinsip kerja KCKT adalah fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan pompa melalui kolom dektektor yang di dalamnya sudah di masukkan sampel dengan cara disuntik. Adanya perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam, sehingga terjadi pemisahan komponen-komponen cairan. Menurut Gandjar dan Rohman (2007), pemisahan senyawa dalam KCKT diatur
19 oleh distribusi senyawa dalam fasa gerak dan fasa diam. Komponen dalam suatu campuran, akan dideteksi oleh detektor dalam bentuk kromatogram.
Analisis menggunakan KCKT relatif lebih cepat, daya pemisahan yang baik, tingkat sensitifitas yang tinggi hingga nanogram/mililiter, pemilihan kolom yang bervariasi, kolom dapat digunakan kembali, dapat menganalisis senyawa dengan ukuran bervariasi dan campuran yang memiliki titik didih yang tinggi (Harmita, 2006). Sesuai pada Gambar 1, fasa gerak yang akan dialirkan menuju kolom dengan bantuan pompa yang kemudian siap diinjeksikan dan data akan muncul pada komputer.
Gambar 1. Diagram sistem KCKT. (a) wadah fasa gerak; (b) pompa; (c) injektor;
(d) kolom; (e) detektor; (f) sistem pendataan (Snyderet al., 2010). a. Wadah Fasa gerak.
Wadah fasa gerak berisi fasa gerak yang berguna untuk memisahkan komponen sampel. Wadah ini harus dalam keadaan bersih dan lembam (inert). Dalam penentuan pelarut fasa gerak, sangat dianjurkan menggunakan pelarut dengan tingkat kemurnian yang tinggi karena jika adanya zat pengotor, partikel yang kecil akan terkumpul dalam kolom sehingga dapat mengakibatkan kekosongan pada kolom yang kemudian dapat menyebabkan gangguan pada sistem pembacaan kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).
20 b. Fasa Gerak
Fasa gerak KCKT berupa zat cair atau disebut juga eluent atau pelarut. Menurut Gandjar dan Rohman (2007), fasa gerak atau eluent biasanya terdiri dari atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Diperkuat oleh Kazakevich dan Lo Brutto (2007), fasa gerak pada KCKT menggunakan fasa terbalik yaitu campuran hidro organik. Senyawa organik yang umumnya digunakan adalah asetonitril dan metanol atau campuran keduanya.
Persyaratan fasa gerak KCKT:
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali
3. Zat cair mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun 4. Zat cair tidak kental. Kekentalan tidak > 0,5 cp
5. Sesuai dengan detektor
6. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindari penyumbatan pada kolom. Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter pori 0,45 µl.
Konsentrasi dari larutan organik dalam fase gerak merupakan faktor dominan yang mempengaruhi retensi analit dalam sistem KCKT. Pertimbangan dalam memilih solven fasa gerak meliputi kompabilitas antar solven, kelarutan sampel dalam eluen, polaritas, transmisi cahaya, viskositas, stabilitas dan pH.
Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis dalam keberhasilan pemisahan. Hingga saat ini pemilihan fasa gerak berdasarkan
21 eksperimen trial dan error karena belum ada teori yang pasti. Trial error dilakukan hingga diperoleh kromatogram yang sesuai harapan analit.
c. Pompa
Pompa berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam KCKT harus memiliki syarat sebagai berikut:
1. Menghasilkan tekanan hingga 5000 psi (pons/in2) 2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,001 – 10 mL/menit 4. Bahan tahan korosi (Rohman, 2009)
Gambar 2. Skema pompa piston resiprok tunggal (Ahuja dan Dong, 2005)
Pompa yang digunakan pada KCKT memiliki desain resiprok seperti pada Gambar 2. Pada gambar tersebut dapat dilihat terdapat cam bermotor yang dapat menjalankan piston kearah depan dan belakang untuk mengalirkan solven melalui suatu vulva inlet dan outlet (Ahuja dan Dong, 2005).
Solvent keluar Motor Katup periksa piston Segel piston Solvent masuk Katup periksa
22
Gambar 3. Skema pompa dual-piston dengan pompa paralel (Ahuja dan Dong,
2005)
Perkembangan model pompa yang telah dimodifikasi pada desain
dual-piston yang kini banyak digunakan seperti pada Gambar 3. Pompa ini memiliki
dua piston dijalankan oleh dua motor yang terpisah (Ahuja dan Dong, 2005). d. Injektor
Sampel cair yang telah siap dianalisis disuntikan secara langsung kedalam fasa gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom. Pada proses injeksi hindari memasukkan sampel dalam jumlah yang banyak yang dapat mengakibatkan ketidaktepatan pengukuran KCKT karena adanya keterulangan pemasukkan. Maka disarankan untuk menggunakan sampel sedikit mungkin (Gandjar dan Rohman, 2007).
e. Kolom
Kolom yang digunakan terbuat dari stainless steel atau gelas yang berdinding tebal. Menurut Harvey (2000), kolom merupakan bagian KCKT yang berisi fasa diam. Fasa diam pada KCKT berupa lapisan film cair yang terikat pada basis partikel silika yang bertujuan untuk mencegah kemungkinan terjadinya kebocoran cairan fasa. Partikel silika direaksikan dengan organochlorosilane atau Si(CH3)2RCl, di mana R merupakan suatu alkil atau gugus alkil terdistribusi. Kepolaran dari fasa diam bergantung pada jenis R, fasa diam dan gugus fungsi harus memiliki sifat kepolaran yang sama.
23 f. Detektor
Detektor berfungsi sebagai mendeteksi sampel yang terdapat didalam kolom analitik. Syarat suatu detektor harus memiliki tingkat sensitifitas yang tinggi, stabil, cepat, reprodusibel dan mempunyai volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita yang dihasilkan, kemudian tidak sensitif terhadap perubahan suhu kecepatan alir fasa gerak (Rohman, 2009). Terdapat tiga detektor, detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya sampel. Detektor spesifik memberi respon terhadap sampel yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Detektor yang bersifat umum terhadap sampel setelah fasa gerak dihilangkan dengan pengumpan. Menurut Kar (2005), salah satu detektor yang populer digunakan adalah detektor UV-Vis. Prinsip dasar detektor ini pada adanya penyerapan ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Visible) dengan kisaran panjang gelombang 190-800 nm yang dapat mendeteksi gugus-gugus kromoforik.
Gandjar dan Rohman (2007) mengatakan, analisis kualitatif KCKT berupa pengamatan waktu retensi (tR) pada senyawa baku yang baku dan senyawa dalam suatu sampel yang belum diketahui dan membandigkannya dengan cara kromatografi secara bergilir dengan kondisi alat yang stabil dengan rentang perbedaan waktu pengoprasian antar keduanya sekecil mungkin. Analisis kuantitatif pada KCKT dengan mengukur tinggi puncak sebagai garis dasar ke puncak maksimum. Sedangkan luas puncak diukur sebagai hasil kali tinggi puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2). Menurut Harmita (2006), analisis kualitatif KCKT dilihat dari kekhasan waktu retensi namun tidak spesifik, artinya terdapat lebih dari satu komponen zat yang mempunyai waktu retensi yang sama