Penelitian ini dibagi menjadi dua tahapan yaitu tahap penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan meliputi karakterisasi bahan baku dengan metode analisis proksimat, optimasi ekstraksi dan karakterisasi glikogen hasil ekstraksi. Penelitian utama meliputi proses ekstraksi, presipitasi dan kuantitasi DNA femur hasil presipitasi dengan penambahan larutan ekstrak glikogen temilok. Tahapan penelitian tersebut secara ringkas disajikan pada Gambar 5.
Gambar 5 Skema tahapan penelitian. Tahapan penelitian
1. Karakterisasi bahan baku
3. Ekstraksi DNA femur
1. Konsentrasi KOH, konsentrasi resin kationik, dan lama pengadukan 2. Kadar glukosa di dalam glikogen
terekstrak (%)
3. Rendemen glikogen terekstrak (%) 4. Residu nitrogen di dalam glikogen
terekstrak (ppm)
5. Residu asam nukleat di dalam glikogen terekstrak (mg/mL) Hasil proksimat meliputi kadar air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat temilok (%)
Keluaran
2. Optimasi ekstraksi dan
karakterisasi glikogen terekstrak
Konsentrasi DNA yang terpresipitasi (ng/µL) dengan penambahan larutan glikogen terekstrak dan tanpa penambahan larutan glikogen 4. Presipitasi DNA dengan/tanpa
penambahan glikogen 5. Kuantitasi DNA
Larutan DNA
3.3.1 Karakteristik proksimat temilok (Metode SNI.01-2891-1992)
Kadar proksimat yang diuji meliputi air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat (by difference). Glikogen adalah salah satu jenis karbohidrat, yaitu polisakarida yang terdiri dari unit terkecil (monosakarida) yaitu glukosa, oleh karena itu kadar karbohidrat yang dihitung dari hasil uji proksimat suatu bahan dapat dijadikan sebagai petunjuk awal kandungan glikogen di dalam bahan tersebut.
3.3.2 Optimasi ekstraksi glikogen temilok (modifikasi Metode Nicoletti dan Baiocchi 1994)
Ekstraksi glikogen temilok dilakukan dengan melakukan modifikasi proses ekstraksi glikogen metode Nicoletti dan Baiocchi. Optimasi proses yang dilakukan meliputi penentuan konsentrasi KOH (%), persentase resin kationik (%) yang digunakan, dan lama pengadukan (jam). Optimasi tersebut bertujuan untuk mendapatkan glikogen terekstrak dengan residu nitrogen dan asam nukleat yang terendah. Modifikasi proses yang dilakukan adalah konsentrasi etanol untuk mempresipitasi glikogen, suhu dan lama pengeringan presipitat glikogen kasar, serta volume pelarut (akuades) yang ditambahkan setelah pengeringan awal.
Prosedur ekstraksi glikogen yang telah dimodifikasi dari metode Nicoletti dan Baiocchi yaitu 100 g temilok tanpa cangkang dan pallet direbus hingga suhu 100 oC dengan larutan KOH. Konsentrasi KOH optimal ditentukan dengan perlakuan konsentrasi KOH 20%, 30%, dan 40%, setelah suhu 100 oC tercapai perebusan dihentikan dan larutan dibiarkan hingga suhu 32 oC kemudian ke dalam larutan tersebut ditambahkan 150 mL etanol 96%. Presipitat yang terbentuk kemudian disaring dengan kertas saring lalu dikeringkan di dalam oven pada suhu 50 oC selama 21 jam. Presipitat hasil pengeringan kemudian dilarutkan dengan penambahan 150 mL akuades lalu pH larutan tersebut dinetralkan dengan penambahan beberapa mL asam asetat glasial. Larutan disaring dengan kertas saring lalu ditambah dengan 6% resin kationik (persen bobot resin kationik terhadap 100 g bahan baku), diaduk dengan magnetic stirrer selama 24 jam pada suhu ruang. Larutan hasil penyaringan ditambah dengan etanol 96% dengan perbandingan volume 1:1 hingga terbentuk presipitat. Presipitat diambil dengan penyaringan menggunakan kertas saring. Presipitat yang diperoleh kemudian
dikeringkan di dalam desikator vakum gel silika hingga diperoleh bobot tetap. Presipitat yang diperoleh kemudian ditimbang. Perbandingan antara bobot presipitat setelah pengeringan dan bobot awal bahan baku dihitung sebagai rendemen ekstrak glikogen temilok. Interaksi persentase resin kationik dan lama pengadukan yang optimal ditentukan setelah konsentrasi KOH optimal diperoleh, yaitu dengan percobaan konsentrasi resin kationik 9% dan 12% dengan lama pengadukan 8, 16, dan 24 jam. Resin kationik dipisahkan dari larutan dengan penyaringan menggunakan kertas saring. Prosedur optimasi ekstrasi glikogen temilok secara ringkas dapat dilihat pada Gambar 6.
3.3.3 Karakterisasi ekstrak glikogen (Bennett et al. 2007)
Karakterisasi ekstrak glikogen dilakukan untuk memastikan produk hasil ekstraksi adalah glikogen. Karakterisasi suatu bahan dapat dilakukan secara fisika, atau kimia, baik kualitatif maupun kuantitatif.
Bennet et al. (2007) melaporkan bahwa sampel glikogen dikarakterisasi secara kimia dengan pereaksi fenol-sulfat (fesul), lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm untuk mengetahui konsentrasi glukosa di dalam glikogen. Penghitungan konsentrasi glukosa di dalam glikogen dilakukan dengan terlebih dahulu membuat persamaan kurva standar dengan cara mereaksikan glukosa standar pada beberapa tingkat konsentrasi yang ditentukan dengan pereaksi fesul, lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Persamaan regresi dari hubungan antara konsentrasi glukosa standar dan nilai absorbansinya setelah direaksikan dengan pereaksi fesul dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi glukosa di dalam glikogen. Asam sulfat dapat menghidrolisis glikogen secara sempurna meskipun sumber bahan baku tidak sama, sehingga glikogen yang terhidrolisis juga sangat stabil hingga jam ke-24. Metode ini memiliki limit of detection (LOD) hingga konsentrasi glikogen sebesar 4,29 ppm, dan limit of quantification (LOQ) hingga konsentrasi glikogen sebesar 7,16 ppm.
Gambar 6 Prosedur optimasi ekstraksi glikogen temilok. Penambahan 150 ml etanol 96% pada suhu ruang
Pengadukan dengan penambahan resin kationik Amberlite IR-120 pada suhu ruang
Penambahan 150 mL akuades Perebusan dengan larutan KOH dengan rasio
1:1 (b/v) hingga mencapai suhu 100 oC
Penambahan etanol 96% 1:1 (v/v) pada suhu ruang
Pengeringan residu dengan desikator vakum Penyaringan
Penyaringan Penyaringan
Penetralan pH larutan dengan asam asetat glasial Pengeringan residu dalam oven pada suhu
50 oC selama 21 jam Penyaringan
Glikogen 100 g Temilok
Penurunan suhu larutan hingga suhu 32 oC
KOH 20%, 30%, dan 40%, Resin kationik 9% dan 12% dengan lama pengadukan 8, 16, dan 24 jam
3.3.4 Aplikasi glikogen sebagai ko-presipitan DNA (Lennard et al. 2007)
Proses ekstraksi DNA femur dilakukan dengan menyiapkan bufer ekstraksi (campuran 50 µL Proteinase K 20 mg/mL, 1 mL bufer TENS, dan 6 mg DTT solid) lalu dikocok perlahan dengan inversi selama 5 detik. Sampel serbuk femur sebanyak 0,2 g ditimbang di dalam safe lock tube steril berukuran 2 mL, kemudian 1.000 µL larutan buffer ekstraksi ditambahkan ke dalam tiap tube yang berisi sampel serbuk femur, dan satu tube tanpa serbuk femur (sebagai blanko ekstraksi). Campuran yang dihasilkan kemudian divortex selama 10 detik dan sampel diinkubasi pada suhu 56 oC selama 20 jam dalam shaking water bath. Sampel disentrifugasi pada 3.000 rpm selama 5 menit hingga serbuk femur mengendap, lalu supernatan dipindahkan ke dalam safe lock tube steril berukuran 2 mL yang baru. Larutan PCIA sebanyak 800 µL ditambahkan ke dalam supernatan lalu dikocok dengan inversi selama 10 menit, dan disentrifugasi pada 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan (bagian bening paling atas) diambil dari dalam tube dengan pipet volumetrik 200 µL. Langkah dari penambahan larutan PCIA hingga pengambilan supernatan hasil sentrifugasi diulang sebanyak 2 kali.
Presipitasi DNA femur hasil ekstraksi dilakukan dengan menambahkan 40 µL sodium asetat 3 M (pH 5,2) dan 20 µL larutan glikogen (20 µg glikogen dalam ddH2O hingga 1 µL) ke dalam 800 µL larutan DNA femur. Analisis dilakukan 3 kali ulangan untuk sampel glikogen dan larutan blanko (tanpa glikogen). Larutan glikogen disinari dengan ultraviolet selama 30 menit sebelum dicampur dengan larutan sodium asetat dan larutan DNA. Hal ini dilakukan untuk menghancurkan kontaminan berupa asam nukleat. Larutan campuran di atas lalu ditambah dengan 1100 µL etanol absolut dingin, dikocok dengan inversi selama 5 menit. Larutan diinkubasi di dalam freezer pada suhu -80 oC selama 40 menit, kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 oC. Supernatan yang terbentuk dipisahkan sedangkan bagian pelet diambil lalu dikeringkan di dalam laminar flow cabinet pada suhu ruangan selama 20 menit. Bufer TE sebanyak 50 µL ditambahkan sambil diaduk dengan pipet, kemudian sampel divortex selama 3 detik. Sampel hasil ekstraksi disimpan pada suhu 4 oC sebagai stok untuk tahap kuantitasi dengan RT-PCR.