Pemurnian enzim lebih lanjut dengan kromatografi diperlukan untuk memisahkan enzim endonuklease restriksi yang diperoleh dari kontaminan- kontaminannya atau memisahkan antar enzim endonuklease restriksi itu sendiri. Hal tersebut perlu dilakukan untuk mengetahui apakah ekstrak enzim yang diperoleh hanya terdiri dari satu jenis enzim endonuklease restriksi saja atau terdiri dari beberapa jenis enzim endonuklease restriksi. Perlakuan double digest perlu dilakukan kembali pada enzim yang sudah dimurnikan untuk melakukan pendugaan situs pemotongan enzim pada substrat DNA atau plasmid. Pemekatan enzim dengan menggunakan metode freeze drying juga diperlukan untuk meningkatkan aktivitas restriksi yang dimiliki oleh ekstrak enzim.
Karakterisasi enzim juga diperlukan untuk mengetahui pengaruh faktor pH, suhu, logam, dan kekuatan ion yang optimum untuk aktivitas optimum enzim. Penelitian lebih lanjut juga diperlukan untuk mengetahui sekuens pengenalan dan pemotongan enzim sehingga dapat diketahui apakan enzim yang diperoleh merupakan enzim endonuklease restriksi jenis baru atau merupakan isoschizomer atau neoschizomer dari enzim restriksi komersial yang telah ada di pasaran.
Abdurashitov, M.A., E.V.Kileva, T.V.Myakisheva, V.S.Dedkov, A.V. Shevchenko, dan S. Kh. Degtyarev. 2007. AccBSI: A New Restriction Endonuclease from Acinetobacter calcoaceticus BS. http://science.sibenzyme.com/article8_article_4_1.phtml [11 Mei 2007]
Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, dan J.D. Watson.1983. Molecular Biology of The Cell. Garland Publishing, Inc., New York.
Albertsson, P.A. 1986. Partition of Cell Particles and Macromolecules. 3rdEdition. Wiley & Sons, New York.
Andrew, B.A. dan Asenjo, J.A. 1989. Aqueous Two Phase Partitioning. Di dalam
: E.L.V. Harris dan S. Angal (Eds.). Protein Purification Method : A Practical Approach. Oxford University Press, New York.
Anonim. 2007. World enzyme demand to approach $5.1 billion in 2009. http://www.allbusiness.com/specialty-businesses/860515-1.html. [7 Juni 2007].
Boffey, S.A. 1986. Agarose Gel Electrophoresis of DNA. Di dalam : Walker, G.M. (ed). Method in Molecular Biology Volume 2. Humana Press, Clifton, New Jersey.
Bollag, D.M dan S.J. Edelstein. 1991. Protein Methods. Wiley Liss, USA.
Brown, T.A. 1990. Gene Clonning: An Introduction, 2nd Edition. Chapman and Hall, London.
Chandrasekaran, S., P. Babu, dan V. Nagaraja. 1999. Characterization of DNA Binding Activities of Over-Expressed KpnI Restriction Endonuclease and Modification Methylase. J. Biochem, Mol. Biol. and Biophysics. 3:225- 229.Glick, B.R dan J.J. Pasternak. 2003.Molecular Biotechnology : Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM Press, Washington DC
Chaplin, M. 2004. Aqueous Biphasic System.
http://www.lsbu.ac.uk/water/biphasic.html. [11 Mei 2007]
Chernukin, V.A., T.N. Najakshina, M.A. Abdurashitov, J.E. Tomilova, N.V. Mezentzeva, V.S. Dedkov, N.A. Mikhnenkova, D.A. Gonchar, S.K. Degtyarev. 2005. A Novel Restriction Endonuclease GlaI Recognizes Methylated Sequence 5’-G(m5C) GC-‘3. Biotekhnologia (Russian) 3:22-26. Published online-October 2005.
51
Chmusz, E.V., J.G. Kashirina, J.E. Tomilova., N.V. Mezentzeva, V.S. Dedkov., D.A. Gonchar, M.A. Abdurashitov, dan S.K. Degtyarev. 2005. Restriction endonuclease BisI from Bacillus subtilis T30 recognized methylated sequence 5’-G(m5C) NGC-3’. Biotekhnologia (Russian) 3:22-26.
Daniels, D.L. 1983. Lambda Map. Di dalam : Hendrix, R.W., Roberts, J.W., Stahl, F.W. dan Weisberg, R.A. (ed.) Lambda II: Appendix. Cold Spring Harbor Press, New York.
Davis, l.G., M.D. Dibner, dan J.F. Battey. 1986. Basic Method in Molecular Biology. Elsevier, New York.
Degtyarev, S.Kh, E.V. Chmuzh, J.G. Kashirina, J.E. Tomilova, N.V. Mezentzeva, V.S. Dedkov, D.A. Gonchar, dan M.A. Abdurashitov. Restriction endonuclease Bis I from Bacillus subtilis T30 recognizes methylated sequence5’-G(m5C)↓NGC-3’.
http://science.sibenzyme.com/article8_article_4_1.phtml [11 Mei 2007] Franks, F. 1993. Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and
Stabilization. Humana Press, New Jersey.
Gelinas, R.E., P.A. Myers, G.H. Weiss, R.J. Roberts, dan K. Murray. 1977. A Specific Endonuclease from Brevibacterium albidum. J. Mol. Biol. 114:433- 440.
Glick, B.R dan J.J. Pasternak. 2003. Molecular Biotechnology : Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM Press, Washington DC.
Imber, R dan T.A. Bickle. 1981. Purification and Properties of The Restriction Endonuclease BglII from Bacillus globigii. Eur. J. Biochem. 117:395-399. Johansson, G. 1998. Affinity Partitioning of Protein Using Aqueous Two-Phase
Systems. Di dalam : J.C. Janson dan L.Ryden (Eds.). Protein Purification : Principles, High Resolution Methods, and Appllications 2nd Edition. Wiley Liss, USA.
Juliana. 1996. Telaah Enzim Endonuklease Restriksi dari Rhodobacter sp. Asal Indonesia. Skripsi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.
Kawira, A.1993. Produksi Protease Bacillus pumilus yang Diisolasi dari Limbah Cair Tahu dengan Fermentasi terkontrol. Skripsi. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.
Kula, M.R. 1979. Appl. Biochem. Bioeng. 2:71.
Lehninger, A. 1982. Dasar–dasar Biokimia. Terjemahan: Maggy Thenawidjaja. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Likumahwa, M.Y.Y. 1993. Pencirian Bakteri Penghasil Protease yang Diisolasi dari Limbah Cair Tahu dengan Bantuan Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian. Insitut Pertanian Bogor, Bogor. Lynn, S.P., L.K. Cohen, S. Kaplan, dan J.F. Gardner. 1980. RsaI: A New
Sequence-specific Endonuclease Activity from Rhodopseudomonas sphaeroides. J. of Bacteriology. 142:380-383.
Old, R.W dan S.B. Primrose. 1989. Principles of Gene Manipulation, 4thEdition. Blackwell Scientific Publisher, Oxford.
Owen, R.B. 1999. Biology and Activity of Restriction Endonucleases. http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes.html. [20 September 2006].
Paquet, V., M. Myint, C. Roque, dan P. Soucaille. 1993. Partitioning of pristinamycins in aqueous two-phase systems: A first step toward the development of antibiotic production by extractive fermentation. http://www3.interscience.wiley.com/cgi-
bin/abstract/107624252/ABSTRACT?CRETRY=1&SRETRY=0 [11 Mei 2007].
Pingoud, A., dan A. Jeltsch. 2001. Structure and function of type II restriction endonukleases. Nucleic Acid Research. 29:3706-3727.
Pingoud, A., J. Alves, dan R. Greiger. 1993. Restriction Enzymes. Di dalam: Burrel, M.M. (Ed.). Methods in Molecular Biology Volume 16. Humana Press Inc., Totowa, New Jersey.
Roberts, R.J., dan S.E. Halford. 1993. Type II restriction enzymes. Di dalam: Nucleases, 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Roberts, R.J. dan Macelis. 2006. REBASE : The Restriction Enzyme Database.
http://www.rebase.neb.com/cgi-bin/statlist. [16 September 2006].
Rusli, F. 2006. Screening Awal Enzim Endonuklease Restriksi Spesifik dari Bakteri. Skripsi. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.
Sambrook, J., E.F. Fristch, dan T. Maniatis. 1989. Molecular Clonning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Santoso, T.H. 1996. Pengaruh Substrat, Inhibitor, dan Aktivator terhadap Protease
Bacillus pumilus Y1 dan Xanthomonas campestris pathovar glycines IFL dan YR32. Skripsi. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.
53
Sealey, P.G. dan Southern, E.M. 1982. Electrophoresis DNA. Di dalam: Rickwood, D. dan Hanes, B.D. Gel Electrophoresis of Nucleic Acids : A Practical Approach. IRL Press, Oxford.
Setiawan, B. 1998. Karakterisasi Enzim Endonuklease Restriksi dari Bakteri Fotosintetik Anoksigenik MW5. Skripsi. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.
Setyawati, I. 2006. Produksi dan Karakterisasi Xilanase Mikroba yang Diisolasi dari Tongkol Jagung. Skripsi. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.
Sharma, P., D.R. D’Souza, D. Bhandari, V.Parashar, dan N. Capalash. 2003. Demonstration of The Principles of Restriction Endonuclease Cleavage Reaction Using Thermostable BflI from Anoxybacillus flavithermus.
Biochem. and Mol. Biol. Education, 31:392-396.
Stephens, M.A. 1981. Partial Purification and Cleavage Specifity of a Site- specific Endonuclease, SciNI, isolated from Spiroplasma citri. J. of Bacteriology. 149: 508-514.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Pusat Antar Universitas IPB, Bogor.
Suwanto, A. 1993. Teknik Percobaan dalam Genetika Molekuler. Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB, Bogor.
Suwanto, A., Suhartono, M.T., dan Widjaja, H. 1992. Struktur Enzim dan Biokimiawi Protein. Pusat Antar Universitas IPB, Bogor
Todar, K. 2004. Pseudomonas and Related Bacteria.
http://textbookofbacteriology.net./pseudomonas.html. [20 September 2006]. Vitkute, J., Z. Maneliene, dan A.Janulaitis. 1998. AbeI, A Restriction
Endonuclease from Azotobacter beijerinckii, Which Recognizes The Asymmetric Heptanucleotide Sequence 5[prim]-CCTCAGC-3[prime] (-5/- 2). Nucleic Acid Research. 26:4917-4918.
Welch, S. G. dan R.A.D. William. 1995. Two Thermostable Type II Restriction Endonucleases from Icelandic Strains of The Genus Thermus. Biochem J. 309:595-599.
Widiyanto. 1996. Bakteri Fotosintetik Anoksigenik sebagai Biokondisioner di Tambak Udang : Pengurangan Produksi H2S dan Pengaruhnya pada Pertumbuhan Vibrio harveyi. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.
Yanisch-Perron, C., J. Vieira, and, J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33:103-119.
Yun, M.S., H.Y. Hwang, dan M. Bae. 1995. Purification and Characterization of a Thermostable Restriction Endonucleases from Streptomyces violochromogenes D2-5. J. Microbiol. Biotechnol. 5 (5).
55
LAMPIRAN
Lampiran 1. Komposisi Media Luria Bertani Komposisi media Luria Bertani (dalam 100 ml) : 1. Tripton 1.0 g
2. Ekstrak Khamir 0.5 g 3. NaCl 1.0 g Tahap pembuatan :
1. Bahan-bahan yang telah ditimbang dilarutkan dalam 90 ml air bebas ion 2. Diatur pH sampai 7.0 dengan NaOH 1 N
3. Ditera sampai 100 ml
Lampiran 2. Komposisi gel loading buffer dan buffer TAE stok 50x
Komposisi gel loading buffer (Sambrook et al., 1989) : 1. 40 % (w/v) Sukrosa dalam air
2. 0.25 % Bromfenol biru Disimpan dalam freezer
Komposisi buffer TAE stok 50x (Sambrook et al., 1989)
1. Tris(hydroxymethyl)-aminomethane 24.2 g
2. Na2EDTA 0.5 M pH 8.0 10 ml
3. Asam asetat glasial 5.71 ml Ditera hingga 100 ml dengan akuades steril.
57
Lampiran 3. Komposisi dan cara pembuatan polimer konsentrat
Komposisi polimer konsentrat
1. Dekstran T 500 7.1 g 2. Polietilen Glikol 6000(PEG 6000) 28.4 g Pembuatan polimer konsentrat
1. Dididihkan 50 ml air bebas ion dan disiapkan air bebas ion panas untuk menyiram.
2. Dekstran dimasukkan dalam 50 ml air bebas ion yang mendidih sambil diaduk menggunakan magnetic stirer.
3. Masukkan PEG 6000 secara perlahan hingga larut.
4. Tambahkan air bebas ion yang dipanaskan untuk menyiram sisa dekstran yang masih menempel pada wadah.
5. Timbang larutan polimer konsentrat.
