BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
D. Validasi metode
1. Selektivitas (Spesifisitas)
Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada penelitian ini, spesifisitas metode dibuktikan dengan membandingan panjang gelombang maksimum larutan blangko dengan panjang gelombang maksimum larutan baku pirantel pamoat dengan melakukan scanning
pola spektra kedua larutan tersebut pada panjang gelombang 200-400 nm. Jika panjang gelombang maksimum yang didapat dari pola spektra kedua larutan tersebut berbeda, maka dapat dikatakan bahwa metode tersebut spesifik (Ermer
and Miller, 2005). Larutan blangko yang dimaksud adalah campuran DMSO dan metanol. Konsentrasi larutan baku pirantel yang digunakan adalah konsentrasi 20 ppm untuk mewakili konsentrasi tengah dari seri konsentrasi larutan baku pirantel pamoat. Penentuan konsentrasi larutan yang akan digunakan tidak berpengaruh pada pola spektra dan panjang gelombang maksimal yang dihasilkan. Hal ini dibuktikan pada penentuan panjang gelombang maksimal. Pada ketiga konsentrasi yang digunakan (10, 20, dan 30 ppm) menunjukkan absorbansi maksimal pada panjang gelombang yang sama (Gambar 8).
Perbedaan pola spektra larutan blangko dan larutan baku pirantel pamoat ditunjukkan pada gambar 11 dan 12 berikut ini:
(a) (b)
Gambar 11. Pola spektra larutan blangko (a); Panjang gelombang maksimal larutan blangko (b)
(a) (b)
Gambar 12. Pola spektra larutan baku pirantel pamoatkonsentrasi 20 ppm dalam pelarut DMSO-metanol (a); Panjang gelombang maksimal larutan baku pirantel pamoat (b)
Pada gambar 12b, didapatkan peak absorbansi yang tinggi pada panjang gelombang 243 nm. Absorbansi pada panjnag gelombang tersebut
merupakan absorbansi dari pelarut yang digunakan. Berdasarkan data yang diperoleh, larutan blangko memiliki absorbansi maksimal pada panjang gelombang 208,40 nm (gambar 11b), sedangkan larutan baku pirantel pamoat memiliki absorbansi maksimal pada panjang gelombang 301 nm (gambar 12b). Larutan blangko dan larutan baku pirantel pamoat memiliki pola spektra dan panjang gelombang maksimal yang berbeda. Perbedaan pola spektra dan panjang gelombang maksimal larutan blangko dan larutan baku pirantel pamoat yang ditunjukkan pada gambar 11 dan 12, menunjukkan bahwa pelarut yang digunakan tidak memberikan absorbansi pada panjang gelombang maksimum dari analit. Berdasarkan hasil tersebut, dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan memiliki spesifisitas yang baik.
2. Linieritas
Linieritas adalah kemampuan metode analisis dalam memberikan respon secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik dan proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita, 2004).
Pada metode spektrofometri UV, respon yang diperoleh dari hasil uji adalah berupa nilai absorbansi sampel. Nilai respon absorbansi dengan konsentrasi analit tersebut dihubungkan dalam suatu kurva kalibrasi. Pada penelitian ini, kurva kalibrasi yang digunakan adalah persamaan garis linier, sehingga hubungan yang proporsional antara respon dan konsentrasi analit dinyatakan dalam nilai koefisien korelasi (r) dari persamaan garis yang dibuat.
Menurut Snyder et al. (1997), syarat suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik apabila nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,999, terutama untuk penetapan kadar senyawa tunggal. Nilai yang yang semakin mendekati nilai 1, menunjukkan hubungan yang semakin proporsional antara absorbansi dan konsentrasi analit. Peningkatan maupun penurunan konsentrasi analit yang diukur, akan diikuti peningkatan maupun penurunan absorbansi yang proporsional.
Nilai koefisien korelasi kurva baku pirantel pamoat yang didapat pada penelitian ini yaitu sebesar 0,9996; 0,9998; dan 0,9992 untuk replikasi I, II, dan III (Tabel 4). Ketiga replikasi kurva baku tersebut memiliki nilai koefisien korelasi ≥ 0,999, sehingga ketiganya memenuhi persyaratan linieritas yang baik seperti yang ditunjukkan pada gambar 13.
(a) (b) y = 0,0392x - 0,0114 r = 0,9996 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 Ab so rb an si
Konsentrasi pirantel pamoat (ppm)
Replikasi I
y = 0,0400 x - 0,0344 r = 0,9998 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 0,00 20,00 40,00 Ab so rb an siKonsentrasi pirantel pamoat (ppm)
(c)
Gambar 13. Linieritas Kurva Baku Replikasi I (a), replikasi II (b), dan replikasi III (c)
3. Akurasi
Parameter akurasi menyatakan ketelitian metode analisis atau kedekatan nilai yang terukur dengan nilai yang sebenarnya (nilai teoritis) yang dinyatakan dalam nilai % recovery (perolehan kembali).
Pada penelitian ini, penentuan parameter akurasi dilakukan dengan dua cara, yaitu metode simulasi dengan menggunakan larutan baku dan metode standar adisi (standard addition method). Metode simulasi menggunakan larutan baku digunakan untuk mengetahui akurasi dari instrumen yang digunakan, sedangkan metode standar adisi (standard addition method) digunakan untuk mengetahui akurasi dari metode yang digunakan.
Penentuan parameter akurasi metode yang digunakan, dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu: membandingkan respon sampel dengan reference standard, recovey analit yang dispiked dalam placebo (blank matrix), dan menggunakan metode standar adisi (Snyder et al., 1997). Metode standar adisi dipilih karena metode tersebut merupakan metode yang mungkin dilakukan pada
y = 0,0407x - 0,0194 r = 0,9992 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 0,00 20,00 40,00 Ab so rb an si
Konsentrasi pirantel pamoat (ppm)
penelitian ini. Peneliti tidak dapat mendapatkan sampel placebo dari sediaan suspensi yang digunakan. Oleh karena itu, penentuan akurasi metode dilakukan dengan menggunakan metode standar adisi (standard addition method).
Menurut dokumen ICH Q2(R1) (2004), pengukuran akurasi, dilakukan pada 3 konsentrasi yang berbeda dengan 3 kali replikasi pada masing-masing konsentrasi, sehingga didapatkan 9 data. Oleh karena itu, pada penelitian ini pengujian parameter akurasi dengan metode simulasi menggunakan larutan baku, dilakukan pada 3 level konsentrasi larutan baku pirantel pamoat, yaitu konsentrasi 10 ppm untuk perhitungan akurasi konsentrasi rendah, 20 ppm untuk perhitungan akurasi konsentrasi tengah, dan 30 ppm untuk perhitungan akurasi konsentrasi tinggi. Ketiga level konsentrasi tersebut mewakili konsentrasi rendah, tengah, dan tinggi dari seri konsentrasi larutan baku pirantel pamoat yang digunakan pada persamaan kurva baku.
Pada larutan baku, konsentrasi baku pirantel pamoat dalam matrik yaitu 100% karena baku memiliki kemurnian yang tinggi, sehingga termasuk dalam macro analysis. Persyaratan akurasi yang baik untuk sampel dengan konsentrasi 100% adalah memenuhi nilai recovery 98-102% (AOAC cit. Gonzales
and Herrador, 2007). Data akurasi pada metode simulasi dengan larutan baku ditunjukkan pada tabel 6.
Tabel 6. Data % recovery larutan baku pirantel pamoat
Konsentrasi larutan % recovery
Replikasi I (%) Replikasi II (%) Replikasi III (%)
10 ppm (low) 98,09 100,05 100,54
20 ppm (medium) 100,37 100,24 99,88
Berdasarkan dari data akurasi pada tabel 6, dapat diketahui bahwa rentang nilai recovey pada ketiga replikasi sebesar 98,09-100,54% untuk konsentrasi rendah, 99,88-100,37% untuk konsentrasi tengah, dan 98,35-100,88% untuk konsentrasi tinggi. Nilai recovery pada masing-masing konsentrasi untuk tiap replikasinya, memenuhi persyaratan akurasi yaitu 98-102% (AOAC cit.
Gonzales and Herrador, 2007). Rentang nilai recovery pada ketiga konsentrasi larutan juga masuk dalam rentang nilai % recovery 98-102%. Perhitungan nilai
recovery baku pirantel pamoat ditunjukkan pada lampiran 8, 9, dan 10.
Metode pengukuran parameter akurasi yang kedua dilakukan dengan
standard addition method. Pada metode ini dilakukan penambahkan larutan baku pirantel pamoat pada larutan sampel dengan 3 konsentrasi penambahan, yaitu 5 ppm untuk penambahan baku konsentrasi rendah, 10 ppm untuk penambahan baku konsentrasi tengah, dan 15 ppm untuk penambahan baku konsentrasi tinggi. Penambahan konsentrasi baku yang ditambahkan ke dalam larutan sampel tidak boleh menyebabkan konsentrasi dan absorbansi sampel adisi melebihi konsentrasi dan absorbansi kurva baku (ekstrapolasi). Oleh karena itu, dilakukan penetapan konsentrasi sampel tanpa standar adisi terlebih dahulu. Cara perhitungan konsentrasi baku adisi yang ditambahkan ditunjukkan pada lampiran 12b.
Pada penetapan konsentrasi analit dalam matrik sampel, dilakukan ekstraksi sampel terlebih dahulu. Hal ini bertujuan untuk memisahkan analit dari matrik sampel. Pada metode spektrofotometri UV tidak terjadi pemisahan analit dari senyawa pengganggu yang lain, seperti; suspending agent, pewarna, perasa, maupun senyawa tambahan lain yang terdapat dalam formulasi sediaan suspensi.
Oleh karena itu, diperlukan tahapan pemisahan dan ekstraksi analit dari senyawa yang lain sebelum dilakukan pengukuran nilai absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer UV. Pada penelitian ini, metode ekstraksi yang digunakan adalah metode ekstraksi cair-cair menggunakan ultrasonikator. Metode ini dipilih sebagai hasil perbandingan yang dilakukan FanggidaE (2013) dan merupakan satu kesatuan penelitian. Metode ekstraksi cair-cair dengan menggunakan ultrasonikator ini dipilih karena pengerjaannya yang lebih mudah dibandingkan dengan metode ekstraksi cair-cair dengan menggunakan corong pisah. Selain itu, berdasarkan hasil perbandingan FanggidaE (2013), penggunaan ultrasonikator menghasilkan nilai CV dan % recovery yang lebih baik. Selektivitas metode ekstraksi ini ditunjukkan dari adanya kesamaan pola spektra dan panjang gelombang maksimal, antara baku pirantel pamoat dengan sampel yang diekstraksi. Oleh karena itu, pada penelitian ini dipilih metode ekstraksi cair-cair dengan menggunakan ultrasonikator.
Konsentrasi sampel tanpa penambahan standar adisi didapatkan sebesar 10 ppm, sehingga pada penambahan 5, 10, dan 15 ppm baku pirantel pamoat, konsentrasi sampel adisi masih berada dalam rentang kurva baku, yaitu 15, 20, dan 25 ppm. Data akurasi dengan metode standar adisi ditunjukkan pada tabel 7.
Tabel 7. Data % recovery larutan baku pirantel pamoat (metode standar adisi)
Konsentrasi pirantel pamoat yang ditambahkan (ppm)
% recovery
Replikasi I
(%) Replikasi II (%) Replikasi III (%) 5 (low) 98,99 98,49 99,49
10 (medium) 100,49 101,24 100,99
Konsentrasi pirantel pamoat dalam matriks sampel adalah 7,21%. Nilai %recoveryyang diperbolehkan untuk konsentrasi analit < 10% adalah 97-103% (AOAC cit. Gonzales and Herrador, 2007). Akan tetapi pada penelitian ini dilakukan penambahan baku pirantel pamoat dengan metode standar adisi. Baku yang ditambahkan memiliki kemurnian yang tinggi, sehingga parameter nilai %
recovery yang digunakan adalah 98-102% ( AOAC cit.Gonzales and Herrador, 2007), yaitu % recovery untuk konsentrasi analit 100%. Cara perhitungan konsentrasi analit dalam sampel ditunjukkan pada lampiran 11.
Berdasarkan dari data pada tabel 7, dapat diketahui bahwa rentang nilai % recovey pada ketiga replikasi sebesar 98,49-99,49% untuk penambahan baku konsentrasi rendah, 100,49-101,24% untuk penambahan baku konsentrasi tengah, dan 100,49-101,82% untuk penambahan baku konsentrasi tinggi. Nilai
recovery pada masing-masing konsentrasi untuk tiap replikasi, memenuhi persyaratan akurasi menurut AOAC yang dikutip oleh Gonzales and Herrador (2007), yaitu 98-102%. Rentang nilai % recovery pada ketiga konsentrasi larutan juga masuk dalam rentang nilai % recovery 98-102%. Cara perhitungan %
recovery baku adisiditunjukkan pada lampiran 13, 14, dan 15.
Berdasarkan dari hasil akurasi kedua metode tersebut, maka dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan memenuhi persyaratan akurasi yang baik. Penetapan kadar dengan metode ini dapat dilakukan baik pada level rendah, tengah, maupun tinggi.
4. Presisi
Presisi adalah ukuran yang menyatakan derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang yang telah dihomogenkan dengan suatu metode analisis (Snyder et al., 1997). Presisi merupakan ketelitian pengujian. Nilai presisi menunjukkan kedekatan hasil pengukuran pada setiap replikasinya dengan kondisi analisis yang sama. Parameter presisi dinyatakan dalam nilai Coefficient of Variation (CV) atau
Relative Standard Deviation (RSD). Persyaratan nilai CV untuk konsentrasi analit 100% dalam matrik adalah < 2,0% (Horwitz cit.Gonzales et al., 2010). Nilai CV semakin kecil, menunjukkan ketelitian yang lebih baik. Hal ini berarti bahwa hasil pengukuran antar replikasi pengukuran, memiliki hasil pengukuran yang hampir sama.
Cakupan penentuan nilai CV, melibatkan nilai simpangan baku, dan jumlah percobaan yang dilakukan. Jumlah percobaan yang dapat diukur untuk penentuan nilai CV minimal adalah 3. Hal ini terkait dengan rumus perhitungan CV yang ditunjukkan pada lampiran 6 dan 8. Pada penelitian ini, dilakukan replikasi 3 kali untuk masing-masing level konsentrasi baku pirantel, pada sampel tanpa adisi maupun sampel adisi.
Penentuan nilai CV dilakukan terhadap larutan baku pirantel pamoat pada 3 level konsentrasi, yaitu konsentrasi rendah (10 ppm), konsentrasi tengah (20 ppm), dan konsentrasi tinggi (30 ppm). Perhitungan nilai CV juga dilakukan pada larutan baku pirantel pamoat yang ditambahkan pada matrik sampel (standard addition method) pada 3 level konsentrasi penambahan baku pirantel
pamoat, yaitu 5 ppm untuk penambahan baku konsentrasi rendah, 10 ppm untuk penambahan baku konsentrasi tengah, dan 15 ppm untuk penambahan baku konsentrasi tinggi. Penetapan nilai CV dilakukan terhadap konsentrasi baku pirantel pamoat baik pada sampel tanpa adisi, maupun pada sampel adisi.
Parameter nilai CV yang digunakan adalah nilai CV untuk konsentrasi analit 100%, yaitu <2%. Parameter ini digunakan karena pada penelitian ini dilakukan penambahan baku pirantel pamoat dengan metode standar adisi. Baku yang ditambahkan memiliki kemurnian yang tinggi, sehingga parameter nilai CV yang digunakan adalah < 2% ( Horwitz cit. Gonzales and Herrador, 2007), yaitu nilai CV untuk konsentrasi analit 100%.
Tabel 8. Nilai CV baku pirantel pamoat tanpa adisi Konsentrasi baku adisi
(ppm) Kadar rata-rata ( ̅) SD CV (%)
10 ppm (low) 10,19 0,132287566 1,30
20 ppm (medium) 20,49 0,05204165 0,25
30 ppm (high) 30,57 0,387567198 1,27
Tabel 9. Nilai CV baku pirantel pamoat dalam matrik sampel Konsentrasi baku adisi
(ppm) Kadar rata-rata ( ̅) SD CV (%)
5 ppm (low) 4,95 0,025000 0,51
10 ppm (medium) 10,14 0,052042 0, 51
15 ppm (high) 15,16 0,104083 0,69
Berdasarkan data pada tabel 8 dan 9 dapat diketahui bahwa nilai CV baku pirantel pamoat dari masing-masing perlakuan, menunjukkan nilai CV < 2,0% baik pada level rendah, tengah, maupun tinggi. Hal ini membuktikan bahwa hasil pengukuran pada masing-masing replikasi disemua level konsentrasi baku, menunjukkan hasil pengukuran yang hampir sama. Berdasarkan data tersebut,
maka metode yang digunakan memenuhi persyaratan nilai presisi yang baik. Penetapan kadar dengan metode ini dapat dilakukan baik pada level rendah, tengah, maupun tinggi.
