BAHAN DAN METODE
Percobaan 1. Skrining Ketahanan Cabai terhadap Layu Bakter
Percobaan ini mencakup dua kegiatan yaitu skrining ketahanan cabai terhadap layu bakteri pada lahan yang terinfestasi secara alami dan skrining ketahanan cabai terhadap layu bakteri dengan inokulasi buatan.
Skrining Ketahanan Cabai terhadap Layu Bakteri pada Lahan yang Terinfestasi Alami
Percobaan ini bertujuan untuk mengevaluasi kembali genotipe cabai yang telah diidentifikasi bersifat tahan. Empat genotipe telah diidentifikasi oleh AVRDC membawa sifat ketahanan cabai terhadap layu bakteri yaitu PBC 066, ICPN 12 #4, Tit Super dan Jatilaba. Percobaan ini dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan genotipe sebagai perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang 4 kali. Jumlah tanaman setiap ulangan berkisar antara 6 – 24 tanaman.
Pelaksanaan percobaan. Benih disemai dalam baki dengan media tanam steril dengan perbandingan tanah dan pupuk kandang adalah 2 : 1 (v/v). Setelah bibit telah berumur 35 hari dipindahkan ke lapang dengan jarak tanam 50 cm x 50 cm. Sebagai pupuk dasar, diberikan NPK dosis 10 g/tanaman pada saat tanam. Selanjutnya setiap minggu diberikan pupuk berupa larutan NPK konsentrasi 10 g/l air sebanyak 250 ml/tanaman. Pestisida yang digunakan Curacon 500EC, Dithane M-45, dan Kelthane 200EC, diaplikasikan setiap minggu.
Pengamatan. Peubah yang diamati adalah :
1. Masa Inkubasi : Masa inkubasi adalah waktu yang diperlukan sejak bakteri masuk kedalam jaringan tanaman sampai menimbulkan gejala. Masa inkubasi diamati satu minggu setelah tanam sampai minggu ke-8.
2. Kejadian Penyakit : Pengamatan kejadian penyakit yang diamati mulai umur 1 minggu setelah tanam (MST) sampai umur 8 MST. Kriteria tanaman yang menunjukkan gejala layu berdasarkan 100% daun layu dan kekonsistenan pada 1 – 2 minggu setelahnya.
Analisa Data. Kejadian penyakit layu dihitung dengan menggunakan rumus seperti yang dikemukakan Wang (1998):
P = a/b x 100% ...(rumus 1) Keterangan :
P = Kejadian penyakit
a = Jumlah tanaman yang menunjukkan gejala layu b = Jumlah tanaman yang diamati
Skrining Ketahanan Cabai terhadap Layu Bakteri dengan Inokulasi Buatan
Percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 2 ulangan. Genotipe sebagai perlakuan. Masing-masing satuan percobaan terdiri atas 12 tanaman. Percobaan ini bertujuan untuk mengevaluasi kembali genotipe cabai yang telah diidentifikasi membawa sifat ketahanan yang telah dilakukan oleh Khairul (2005) dan menentukan respon ketahanan cabai terhadap layu bakteri pada genotipe-genotipe yang lain.
Persiapan inokulum. Isolasi dilakukan dengan metode Wang (1998), pangkal batang tanaman cabai dicuci dengan aquades steril, kemudian disterilkan permukaannya dengan alkohol 70% setelah itu dibilas lagi dengan akuades steril. Pangkal batang dipotong-potong dengan pisau steril sepanjang 2 cm, kemudian potongan batang dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi aquades steril sebanyak 5 ml dan dibiarkan selama 15 menit. Potongan tersebut akan mengeluarkan lendir yang berwarna putih kekuningan atau putih kotor. Sebanyak satu lup suspensi R. solanacearum dipindahkan kedalam cawan petri yang telah berisi media 2,3,5 Triphenyl Tetrazolium Chlorida (TTC) dan diinkubasi selama 48 jam. Koloni yang menunjukkan ciri-ciri khas R. solanacearum virulen yaitu yang berwarna putih kotor dengan pusat merah muda atau merah, kemudian dipindahkan kedalam media TTC dan diulang sampai dua kali sampai kultur murni R. solanacearum diperoleh. Perbanyakan inokulum R. solanacearum dengan menggunakan media King’s B yang diinkubasi selama 48 jam. Pembuatan suspensi R. solanacearum dengan memindahkan massa bakteri ke dalam akuades.
17
Selanjutnya diukur konsentrasinya sampai nilai O.D. mencapai 0.3 pada 600nm yang setara dengan 108 colony forming unit (cfu)/ml dengan spektrometer (Gambar 3).
Uji hipersensitif respon (HR) dilakukan pada tanaman tembakau dengan cara menginfiltrasi pada daun. Pengamatan dilakukan 24 jam setelah infiltrasi apabila terjadi water soak maka menunjukkan isolat yang digunakan bersifat patogen (Lampiran 2). Selain uji HR juga dilakukan pengujian gram, fluorescens, warna koloni pada media King’s B. Penyimpanan isolat dengan menggunakan aquades steril dalam ependof yang berisi 1 ml dengan 1 lup koloni R. solanacearum. Penyimpanan dilakukan pada suhu ruang.
Gambar 3. Tahapan isolasi dan persiapan inokulum R.solanacearum. A. Tanaman cabai yang menunjukkan gejala layu; B. Pangkal batang berwarna coklat; C. Aliran massa bakteri; D1 dan D2. Koloni R. solanacearum pada media TTC; E. Uji HR pada daun tembakau; F. perbanyakan R. solanacearum pada media Kings’B; G. Suspensi inokulum yang berwarna putih keruh; H. Spektrometer.
Pembibitan dan Penanaman. Benih direndam dalam air hangat (50 oC) selama semalam kemudian disemai di baki. Bibit yang berumur 2 minggu dipindahkan kedalam polibag. Tanah yang digunakan adalah tanah campuran yang telah disterilkan secara kimia dengan menggunakan Basamid. Perbandingan tanah dan pupuk kandang adalah 2 : 1 (v/v). Tanah kemudian dimasukkan dalam polibag diameter 12 cm.
Inokulasi R. solanacearum. Inokulasi dilakukan pada tanaman cabai umur 30 hari (5-6 daun) dengan cara menyiramkan 30 ml suspensi bakteri pada daerah perakaran yang telah dilukai pada kedua sisi tanaman dengan pisau (Gambar 4). Galur rentan digunakan sebagai kontrol yaitu Randu.
Gambar 4. Inokulasi pada cabai dengan metode penyiraman
Pemeliharaan Tanaman. Pemupukan dilakukan satu minggu sebelum inokulasi dengan menggunakan NPK yang dilarutkan kedalam air dengan perbandingan 1 g NPK dengan 1 l air. Setiap tanaman disiram dengan larutan NPK sebanyak 300 ml. Penyiraman dilakukan satu sampai dua kali sehari tergantung pada cuaca. Penyiraman dilakukan pada pagi dan sore hari. Pengendalian hama dan penyakit lain dilakukan apabila perlu dengan menggunakan insektisida dan fungisida.
Pengamatan. Peubah yang diamati adalah :
1. Masa Inkubasi. Masa inkubasi adalah waktu yang diperlukan sejak bakteri masuk ke dalam jaringan tanaman sampai menimbulkan gejala. Masa inkubasi diamati setelah inokulasi R. solanacearum setiap hari sampai umur 30 hari. Pengamatan dilakukan pada setiap tanaman yang diuji pada masing-masing
19
populasi sampai munculnya gejala awal yang ditandai dengan layunya daun- daun muda, selanjutnya hasilnya dirata-ratakan.
2. Kejadian Penyakit. Pengamatan kejadian penyakit yang diamati mulai umur 1 MST sampai umur 4 MST (Gambar 5).
3. Indeks penyakit. Indeks penyakit diamati seminggu setelah inokulasi dengan interval 1 minggu sampai 4 minggu. Menurut AVRDC (2005) indeks penyakit untuk infestasi layu bakteri pada tanaman ditentukan berdasarkan persentase daun layu seperti ditampilkan pada Tabel 2.
Gambar 5. Gejala layu yang dimulai pada daun-daun muda sampai layu permanen
Tabel 2. Penentuan indeks penyakit pada tanaman cabai yang terserang penyakit layu bakteri
Indeks penyakit ( 6 kelas skor) Gejala
0 1 2 3 4 5
Tidak ada gejala (sehat) 20% daun layu 40% daun layu 60% daun layu 80% daun layu 100% daun layu
Indeks penyakit dan respon ketahanan terhadap layu bakteri berdasarkan kejadian penyakit menggunakan metode Peter et al. 1993 yang dimodifikasi (Tabel 3).
Tabel 3. Respon ketahanan cabai terhadap layu bakteri (R. solanacearum) berdasarkan kejadian penyakit dan indeks penyakit
Indeks penyakit Kejadian penyakit (%) Respon ketahanan 0≤X <1 1≤X ≤2 2< X ≤3 >3 0≤X < 20% 20≤X ≤40% 40< X ≤60% >60% Tahan Agak tahan Agak rentan Rentan
Analisa Data. Korelasi (r) antar peubah Indeks penyakit dan Kejadian penyakit dengan koefisien korelasi Pearson menggunakan piranti lunak Minitab versi 14.
Percobaan 2. Studi Pewarisan Karakter Ketahanan Cabai terhadap