ABSTRAK
Terapi menggunakan stem cell mesenkimal sumsum tulang telah banyak dilakukan pada penyakit degeneratif. Conditioned medium (CM) dari beberapa jenis kultur sel diperkirakan mengandung berbagai bahan bioaktif yang disekresikan secara in vitro sudah diuji terhadap transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang. Penelitian ini dilakukan untuk menguji CM sel Leydig terhadap diferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang. Conditioned medium dikoleksi dari kultur sel Leydig hasil purifikasi dengan gradien Nycodenz masing-masing sebanyak 1x 106 sel/ml setelah dikultur di dalam medium: 1) DMEM + NBCS 10% (M) sebagai kontrol; 2) dengan hCG 2.5 IU/ml; 3) dengan insulin 5 μg/ml, transferrin 10 μg/ml, Selenium 5 μg/ml (ITS) serta 4) hCG dan ITS. Setelah dikultur selama tiga hari, medium dari masing-masing perlakuan diganti dengan medium DMEM tanpa serum dengan perlakuan yang sama. Conditioned medium dikoleksi pada tiga hari kemudian dan disimpan dalam temperatur -20o C. Setelah dianalisis, CM yang diperoleh dari perlakuan hCG+ITS ditetapkan untuk digunakan sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang tikus. Masing-masing sebanyak 1x 106 sel/ml stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur di dalam medium: 1) DMEM+ NBCS 10% sebagai kontrol ; 2) dengan testosteron 10 ng/ml; 3) dengan CM sel Leydig 50% ; 4) dengan CM sel Leydig 50% dan hCG 2.5 IU/ml. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan hCG+ITS pada CM sel Leydig meningkatkan konsentrasi testosteron (0,71 ng/ml) dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Perlakuan yang sama juga meningkatkan konsentrasi protein (985,29µg/ml) yang terdapat di dalam CM dibandingkan dengan perlakuan lainnya (p<0,05). Pita protein yang dihasilkan mempunyai berat molekul (BM) mendekati 29 kDA, 62- 70 kDa dan 95-130 kDa. Stem cell mesenkimal sumsum tulang yang dikultur dengan CM sel Leydig bereaksi positif terhadap pewarnaan spesifik 3β-HSD menghasilkan sel Leydig (53,2%), testosteron (0,93 ng/ml) dan protein (1251,94
μg/ml). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig mampu meningkatkan konsentrasi testosteron (10,22 ng/ml) (p<0,05) dibandingkan dengan tanpa hCG. Dapat disimpulkan bahwa CM sel Leydig mampu mengarahkan stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig. Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig yang digunakan sebagai medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang meningkatkan perolehan sel Leydig dan testosteron yang disekresikan.
Kata kunci : conditioned medium, sel Leydig, stem cell mesenkimal, sumsum tulang, tikus, testosteron
ABSTRACT
Bone marrow mesenchymal stem cells theraphy have been carried out on degenerative diseases. Conditioned medium (CM) from several types of cultured cells contain of bioactive materials secreted in vitro. In this study were used Leydig cells conditioned medium to evaluate the ability differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Conditioned medium was collected from culture of 1x 106 cells/ml with 4 treatments, respectively: 1) DMEM supplemented with 10 % NBCS (M) as control ; 2) M supplemented with 2.5 IU/ml hCG ; 3) M supplemented with 5 µg/ml insulin, 10 µg/ml transferrin, 5 mg/ml Selenium (ITS) and 4) M supplemented with the combination of hCG and ITS. Each culture medium treatment was replaced after 3 days using DMEM without serum. Conditioned medium were collected 3 days later and analyzed for testosterone and protein concentration. The best result of treatment above was used for culture medium of bone marrow mesenchymal stem cells. The 1x 106 cells/ml bone marrow mesenchymal stem cells cultured in : 1) DMEM supplemented with 10% NBCS as control (M) , 2) M supplemented with 10 ng/ml testosterone; 3) M supplemented with 50% Leydig cells CM; 4) M supplemented with 50% Leydig cells CM and 2.5 IU/ml hCG respectively. The result showed that Leydig cells CM from combination of hCG and ITS had higher testosterone concentration (0.71 ng/ml) compared to ITS (0.69 ng/ml), hCG (0.68 ng/ml) and control (0.56 ng/ml). The similar result also showed on protein concentration. Leydig cells CM had three protein bands with molecular weight (29 kDa, 62-70 kDa and 95-130 kDa). Bone marrow mesenchymal stem cells cultured with Leydig cells CM has positive reaction to 3β-HSD specific stained for Leydig cells (53.2%) and produced testosterone (0.93 ng/ml). Supplementation of hCG to Leydig cell CM have an ability to increase testosterone production (10.22 ng/ml) and the positive number cells of Leydig cells (71.9% ) (p<0.05) compared without hCG. It can be concluded that Leydig cells conditioned medium can support differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells to Leydig cells.
Keywords : conditioned medium, Leydig cells , mesenchymal stem cells, bone marrow, rat, testosterone
PENDAHULUAN
Stem cell adalah sel yang terdapat dalam tubuh dan memiliki beberapa karakteristik yang cukup unik karena sel tersebut belum berdiferensiasi dan memiliki fungsi khusus, serta mampu memperbanyak diri sendiri menghasilkan sel yang sama dengan sel induknya (self renewal). Stem cell dapat berdiferensiasi
32
menjadi lebih dari satu jenis sel (multipoten atau pluripoten). Berdasarkan sumbernya, dapat digolongkan menjadi stem cell embrionik dan stem cell dewasa (Prentice 2003). Stem cell dewasa merupakan sel yang belum berdiferensiasi pada jaringan dan bersifat multipoten. Dapat ditemukan pada sumsum tulang, otak, pembuluh darah perifer, gastrointestinal, folikel rambut, hati, pankreas, jantung, kornea, retina, lemak dan otot skeletal. Sel tersebut berfungsi dalam memelihara dan memperbaiki kerusakan jaringan secara in vivo (Prentice 2003). Jika dibandingkan dengan stem cell embrionik, kemampuan berdiferensiasi stem cell dewasa lebih terbatas karena hanya mampu berdiferensiasi menjadi beberapa jenis sel saja serta hanya ditemukan dalam jumlah yang sedikit. Sejak dilaporkannya beberapa penelitian yang menyatakan bahwa stem cell dewasa mampu melakukan transdiferensiasi, maka harapan penggunaan stem cell dewasa khususnya stem cell mesenkimal dari sumsum tulang sebagai terapi alternatif penyakit degeneratif menjadi lebih besar. Penggunaan stem cell dewasa merupakan alternatif untuk mengatasi kendala etika penggunaan stem cell embrionik pada manusia.
Transdiferensiasi adalah perubahan sel yang irreversible dari suatu sel tertentu menjadi jenis sel lainnya (Eguizabal et al. 2013). Stem cell mesenkimal mampu berdiferensiasi menjadi sel saraf atau stem cell hematopoietik yang berdiferensiasi menjadi sel jantung merupakan contoh dari transdiferensiasi stem cell (Halim et al. 2010). Induksi transdiferensiasi stem cell mesenkimal secara langsung dari satu galur mesenkimal menjadi galur yang lain dapat dilakukan dengan mengubah faktor lingkungan mikro (Song & Tuan 2004). Stem cell mesenkimal juga mempunyai kemampuan berdiferensiasi menjadi sel yang spesifik jika dikombinasikan dengan bahan bioaktif dan stimulus diferensiasi tertentu (Caplan & Bruder 2001). Selain itu, transdiferensiasi secara in vivo juga dipengaruhi oleh lingkungan mikro dari jaringan (Phinney & Prockop 2007).
Sel yang dikultur secara in vitro mampu mensekresikan berbagai bahan bioaktif yang bermanfaat bagi pertumbuhan sel dalam kultur. Bahan bioaktif yang dihasilkan di antaranya adalah faktor pertumbuhan (growth factor, GF) dan produk lain yang diperlukan dalam perkembangan sel di dalam kultur. Conditioned medium (CM) adalah medium yang telah digunakan untuk mengkultur sel dan diperkirakan mengandung bahan bioaktif yang dihasilkan oleh kultur sel atau jaringan. Media tersebut dapat digunakan untuk menumbuhkan jenis sel yang sama ataupun yang berbeda. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui peranan faktor-faktor yang terdapat dalam CM dengan menggunakan stem cell mesenkimal sumsum tulang. Penggunaan CM kultur sel saraf untuk mengkultur stem cell mesenkimal sumsum tulang secara in vitro mampu mengarahkan sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel saraf (Djuwita et al. 2010). Diferensiasi sel saraf pada stem cell mesenkimal tikus dan manusia
juga dapat diinduksi oleh DMSO, β-mercapto-ethanol atau butylated hydroxyanisole (Woodbury et al. 2000)
Sel Leydig pada tikus dewasa bukan berasal dari sel Leydig fetus tetapi berasal dari sel prekursor yang belum berdiferensiasi (Habert 2001). Progenitor sel Leydig diduga merupakan sel mesenkim karena mempunyai morfologi seperti sel yang terdapat pada jaringan ikat yang berasal dari mesoderm embrio (Hardy et al. 1991 ) dan sel tersebut disebut sebagai stem cell mesenkimal (Ariyaratne et al. 2000). Sel Leydig terutama menghasilkan hormon testosteron, tetapi juga
mensekresikan berbagai bahan bioaktif seperti peptida, Interleukin-1 (IL-1) dan Interleukin- 6 (IL-6) (Chemes et al. 1992, Cudicini et al. 1997) ke dalam medium kulturnya. Sel Leydig diketahui juga mensekresikan beberapa faktor pertumbuhan seperti: Insulin-like Growth Factor I (IGF-I), Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Epidermal Growth Factor (EGF), Fibroblast Growth Factor (FGF), Platelet-derived Growth Factor –A (PDGF-A) dan lainnya (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001, Saez 1994, Avallet et al. 1991). Yazawa et al. (2006) telah melaporkan bahwa stem cell mesenkimal sumsum tulang dapat berdiferensiasi secara in vivo menjadi sel Leydig ketika ditransplantasikan ke dalam testis. Hasil tersebut menunjukkan bahwa stem cell mesenkimal rodentia mempunyai kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi sel steroidogenik yang serupa dengan sel Leydig.
Pengarahan stem cell mesenkimal menjadi sel Leydig diharapkan dapat menjadi alternatif penyediaan sumber sel Leydig untuk transplantasi dan dapat menggantikan terapi testosteron sintetis yang umum dilakukan pada pria lanjut usia atau pada pasien penyakit hipogonadism. Terapi sel tersebut diharapkan dapat menghindari efek samping akibat pemberian testosteron sintetis dalam jangka waktu yang lama. Sun et al. (2009) menyimpulkan bahwa transplantasi sel Leydig dewasa pada tikus dengan penyakit hipogonadism dan dilakukan pada saat pra-pubertas mempunyai potensi terapeutik. Pengarahan sel dipengaruhi oleh kondisi lingkungan mikro stem cell mesenkimal tersebut, conditioned medium sel Leydig diduga menghasilkan bahan bioaktif yang dapat mendukung diferensiasi sel progenitor menjadi sel Leydig. Apabila pasien dalam kondisi hanya memiliki sel progenitor sel Leydig dalam jumlah yang sedikit di dalam testisnya maka kemungkinan penggunaan stem cell mesenkimal sebagai stem cell pengganti untuk menghasilkan sel Leydig perlu diketahui. Tujuan penelitian ini adalah menguji kemampuan sekreta yang dihasilkan CM sel Leydig untuk mengarahkan transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang menjadi sel Leydig.
MATERI DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi; di Laboratorium Hormon, Unit Rehabilitasi Reproduksi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB dan di Laboratorium Reproduksi dan Kultur Sel Hewan, Puslit Bioteknologi LIPI mulai dari Desember 2012 sampai Agustus 2013.
34
Materi Penelitian
Suspensi stem cell mesenkimal sumsum tulang dikoleksi dari 3 ekor tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu yang diperoleh dari Fakultas Peternakan IPB. Penyediaan conditioned medium sel Leydig dilakukan dengan mengkultur sel Leydig yang dipurifikasi dari testis yang diambil dari 3 ekor tikus jantan dewasa. Perlakuan terhadap hewan percobaan pada penelitian ini telah dilakukan dengan mengikuti kaidah ilmiah terstandar dengan memperhatikan prinsip-prinsip kesejahteraan hewan.
Metode Penelitian
Tahapan kegiatan dalam penelitian ini adalah :
1. Kultur Sel Leydig Hasil Purifikasi dengan Gradien Nycodenz 2. Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari CM Sel Leydig 3. Isolasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang
4. Kultur In Vitro Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang dengan CM Sel Leydig
5. Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari Medium Kultur Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang Setelah Dikultur dengan CM Sel Leydig
Kultur Sel Leydig Hasil Purifikasi dengan GradienNycodenz
Tikus (Sprague Dawley) jantan dewasa berumur 8-10 minggu diambil testisnya setelah dibius dan dikorbankan dengan cara cervical dislocation. Selaput tunika albuginea dan jaringan ikat lainnya dibuang, kemudian jaringan testis ditempatkan di dalam cawan petri berisi medium Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline (DPBS) tanpa Ca dan Mg (Gibco, 21600-010, Invitrogen, NY, USA). Jaringan tersebut kemudian dicuci sebanyak tiga kali menggunakan medium DPBS yang ditambah Newborn Calf Serum 0.1% (NBCS, Gibco, 16010- 159, Invitrogen, New Zealand, DPBS). Pengambilan jaringan testis dilakukan secara aseptis kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi satu ml collagenase type I (Sigma, C0130,St Louis, MO, USA) 0.04% dan trypsin inhibitor (Sigma, T9003, St Louis, MO, USA) 10 µg/ml dalam DPBS. Jaringan diinkubasi di dalam waterbath (Eyela SB-24) pada suhu 34 o C selama 40 menit. Suspensi sel diencerkan sebanyak empat kali volume awal dengan medium DPBS, kemudian didiamkan selama dua menit agar sel mengendap. Cairan
supernatan dikoleksi dan disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel dicuci sebanyak dua kali menggunakan medium DPBS dengan cara yang sama. Terakhir, pelet sel diencerkan dengan 500 µ l medium DPBS.
Isolasi dan purifikasi sel Leydig dilakukan dengan menggunakan metode gradien Nycodenz. Pelet sel yang telah diencerkan kemudian dimasukkan ke dalam larutan Nycodenz dengan gradien 4%, 8%, 10%, 12%, 15%. Setelah itu, larutan gradien disentrifugasi menggunakan sentrifus swing rotor (Kokusan H- 26F) dengan kecepatan 1500 g selama 10 menit pada suhu ruang. Lapisan sel yang terbentuk kemudian dikoleksi dan dicuci berturut-turut dengan DPBS sebanyak empat kali dan medium DMEM (Sigma, D5532, St Louis, MO, USA) yang ditambah NBCS 10% sebanyak satu kali dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama tiga menit. Pelet sel diencerkan dengan 500 µ l medium DMEM, kemudian dilakukan penghitungan konsentrasi sel dengan menggunakan hemositometer Neubauer.
Sel Leydig sebanyak 1 x 106 sel/ml ditempatkan dalam cawan petri (Corning, 430165, NY USA) berukuran 35 x 10 mm dengan perlakuan medium DMEM yang ditambah dengan 10% NBCS (M) sebagai kontrol (1); dengan 2.5 IU/ml hCG (Chorulon, Intervet, EU) (2); dengan 5 μg/ml insulin, 10 μg/ml
transferrin, 5 μg/ml Se (ITS, Sigma I3146, St Louis, MO,USA) (3) serta hCG dan ITS (4) kemudian dikultur dalam inkubator 5% CO2 (Sanyo, MCO-95, Japan) dengan temperatur 37 C. Setelah dikultur selama tiga hari, medium diganti menggunakan medium DMEM tanpa penambahan serum. Pada hari ke-3, conditioned medium (CM) kemudian dikoleksi dan disterilkan dengan filter syringe (MS®CA)0,22 µm. Medium tersebut disimpan pada temperatur -200 C untuk pengujian ELISA, SDS PAGE dan spektrofotometer.
Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari CM Sel Leydig
Konsentrasi testosteron dari CM sel Leydig kemudian diukur menggunakan kit Testosteron ELISA (DRG Diagnostic EIA 1559). Hasil dianalisis dengan menggunakan alat ELISA reader Biotek EL 808.
Analisis kandungan protein di dalam CM sel Leydig dilakukan dengan metode SDS PAGE menggunakan gel Poliakrilamid 12%, kemudian masing- masing sebanyak 10 µ l sampel CM sel Leydig sesuai perlakuan dimasukkan ke dalam sumur gel setelah dicampurkan dengan loading buffer dengan perbandingan 1 : 2. Disamping itu, dimasukkan pula larutan ukuran baku protein sebagai marker (kontrol positif) Chromatein Prestained Protein Ladder (PR- 0602 Vivantis). Alat elektroforesis (SCIE-PLAS) dijalankan dengan kuat arus listrik 30mA, tegangan 140 V(Consort EU 261) selama 3 jam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses visualisasi protein dengan metode pewarnaan Coomassie Brilliant Blue (Phast GelTM Blue-R, Pharmacia 17-0518- 01). Analisis hasil dilakukan secara deskriptif terhadap perbedaan berat molekul protein yang dihasilkan dari pita-pita pada masing-masing CM sel Leydig perlakuan dibandingkan dengan berat molekul protein standar (marker) yang digunakan.
36
Konsentrasi protein di dalam CM sel Leydig diukur dengan menggunakan alat UV spectrophotometer Shimadzu UV-1800 dengan menggunakan software UV Probe 2.42. Masing-masing sampel sebanyak 60 μl ditambahkan dengan 940
μl Protein Assay Dye Reagent (reagen Bradford, BioRad 500-0006), kemudian dimasukkan di dalam cuvet dan dilakukan pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 595 nm. Hasil pembacaan dikoreksi dengan menggunakan kurva
standar linier BSA 0 μg/ml sampai 1500 μg/ml yang telah dibuat sebelumnya. Isolasi Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang
Sumsum tulang (bone marrow) diisolasi dari tulang femur tikus jantan dewasa Sprague Dawley berumur 8-10 minggu. Tulang tibia atau femur dibersihkan dari jaringan dan darah, kemudian pada kedua ujung pangkal dilakukan pemotongan tulang rawan. Bagian stroma tulang dibilas dengan tiga ml medium DPBS dengan menggunakan syringe satu ml dengan jarum 26G. Bilasan ditampung dalam cawan petri kaca yang steril kemudian dihomogenkan dengan mikropipet 1000 µl. Setelah homogen, suspensi dimasukkan ke dalam tabung 15 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 200 g selama 10 menit. Setelah supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan tiga ml medium DPBS dan disentrifugasi ulang. Pencucian dilakukan masing-masing sebanyak dua kali menggunakan medium DPBS dan satu kali dengan medium kultur DMEM. Kemudian pelet sel diresuspensi dengan 1000 µ l medium kultur DMEM.
Kultur In Vitro Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang dengan CM Sel Leydig
Setelah dilakukan penghitungan konsentrasi sel, sebanyak 1 x 106 sel/ml stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur ke dalam cawan petri yang berisi medium kultur DMEM yang ditambah NBCS 10%. Pada cawan petri lainnya diberi gelas cover steril untuk pengamatan morfologi sel. Setelah 24 jam, stem cell mesenkimal sumsum tulang dikultur dengan perlakuan medium: 1) DMEM ditambahkan NBCS 10%; 2) dengan testosteron 10 ng/ml (Nacalay Tesque 32811-61 Kyoto, Japan); 3) dengan CM Leydig 50%; 4) dengan CM Leydig 50% dan hCG 2.5 IU/ml. Conditioned medium sel Leydig yang digunakan untuk mengkultur stem cell mesenkimal diperoleh dari perlakuan DMEM+hCG+ITS. Cawan petri dikultur di dalam inkubator CO2 5% pada temperatur 37oC. Penggantian media dilakukan setiap 48 jam dan kultur dilakukan sampai hari ke-10. Parameter yang diamati adalah morfologi sel yang tumbuh dalam kultur dan pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD untuk mendeteksi sel Leydig. Analisis data dilakukan secara deskriptif terhadap perubahan morfologi sel yang terjadi. Medium kultur kemudian dikoleksi, disterilisasi dengan filter syringe serta disimpan pada temperatur -20o C untuk dilakukan pengujian ELISA dan spektrofotometer.
Analisis Kandungan Testosteron dan Protein dari Medium Kultur Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang Setelah Dikultur dengan CM Sel Leydig
Medium kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang perlakuan di atas kemudian dikoleksi dan digunakan untuk dilakukan pengukuran konsentrasi testosteron menggunakan kit Testosteron ELISA (DRG Diagnostic EIA 1559).
Pengukuran konsentrasi protein dengan menggunakan alat UV spectrophotometer Shimadzu UV-1800 dengan menggunakan software UV Probe 2.42.
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Kultur sel Leydig dilakukan sebanyak tiga kali ulangan untuk setiap perlakuan. Conditioned medium dikoleksi dari masing-masing perlakuan untuk dilakukan analisis testosteron, protein dan SDS PAGE. Data yang diperoleh kemudian diuji secara statistik dengan uji ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% dan uji lanjut Duncan. Hasil SDS PAGE dianalisis secara deskriptif. Conditioned medium terpilih yaitu hasil perlakuan penambahan hCG dan ITS kemudian diperbanyak untuk digunakan pada penelitian selanjutnya.
Kultur stem cell mesenkimal sumsum tulang dilakukan sebanyak tiga kali ulangan untuk setiap perlakuan. Parameter yang diamati adalah morfologi sel dan
reaksi terhadap pewarnaan histokimia 3β-HSD. Analisis kandungan testosteron dan protein dilakukan dari setiap perlakuan dengan tiga kali ulangan. Data yang diperoleh kemudian diuji secara statistik dengan uji ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% dan uji lanjut Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis CM Sel Leydig
Conditioned medium (CM) sel Leydig dari empat perlakuan menghasilkan konsentrasi testoteron sebesar 0,56 sampai 0,71 ng/ml. Penambahan hCG dan ITS menghasilkan testosteron yang lebih banyak dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Penambahan hCG (601,66µg/ml), ITS (572,08 µg/ml) maupun hCG+ITS (985,29 µg/ml) meningkatkan konsentrasi protein di dalam conditioned medium sel Leydig dibandingkan dengan kontrol (436,92 µg/ml) (p<0,05) Tabel 8.
38
Tabel 8. Analisis konsentrasi testosteron dan protein dari conditioned medium sel Leydig
Conditioned medium sel Leydig dari
perlakuan:
Testoteron (ng/ml) Protein
(μg/ml)
DMEM+ NBCS 10% 0,56 436,92 a
DMEM+ hCG 2.5 IU/ml 0.68 601,66 b
DMEM+ ITS (insulin 5 μg/ml, transferrin,
10 μg/ml,Se 5 μg/ml)
0.69 572,08 c
DMEM+hCG+ITS 0.71 985,29 d
Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) dengan uji statistik Duncan.
Hasil analisis protein dengan SDS PAGE terhadap CM sel Leydig ditampilkan pada Gambar 5. Conditioned medium sel Leydig pada penelitian ini menghasilkan pita protein antara berat molekul (BM) mendekati 29 kDa, 62–70 kDa dan 95-130 kDa.
Gambar 5. Hasil analisis SDS PAGE terhadap conditioned medium kultur sel Leydig
Sel Leydig merupakan sel yang memproduksi hormon testosteron di dalam tubuh hewan jantan. Berdasarkan penelitian sebelumnya, perlakuan kultur sel Leydig dengan medium DMEM yang ditambahkan dengan serum, ITS dan hCG menghasilkan konsentrasi testosteron yang paling tinggi sebesar 5,25 ng/ml (Kaiin et al 2013). Pada penelitian ini, kandungan testosteron dari conditioned medium (CM) kultur sel Leydig yang diberi perlakuan hCG dan ITS juga menunjukkan konsentrasi testoteron yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan lainnya. Bilinska et al (2009) menyatakan bahwa sel Leydig manusia hasil pemurnian dengan Percol secara in vitro menghasilkan testosteron sebanyak 5,76 ng/106 sel dalam waktu 24 jam dan dengan penambahan hCG mampu meningkatkan produksi testosteron menjadi 9,83 ng/106 sel Pada penelitian lain, sel Leydig yang dikultur secara in vitro menghasilkan testosteron
sebesar 3,5 ng/106 sel, dan dengan penambahan hCG di dalam medium menghasilkan testosteron sebesar 4,5ng/106 sel ( Risbridger et al. 1981).
Protein dengan BM mendekati 29 kDa pada CM kultur sel Leydig diperkirakan adalah Interleukin 1 (IL-1). Menurut Saez (1994), IL-1 memiliki berat molekul yang bervariasi antara 10-30 kDa. Protein lainnya yang terdeteksi berdasarkan SDS PAGE memiliki BM yang cukup besar yaitu antara 62- 70 kDa dan 95-130 kDa. Lakshmanan et al. (1990) menemukan EGF yang dideteksi dari urin mencit dewasa mempunyai berat molekul 66 dan 56 kDa, sedangkan pro- EGF mempunyai berat molekul 165 kDa. TGF-β merupakan famili dari polipeptida berukuran 25 kDa yang terdistribusi dan disintesis oleh sel yang berbeda-beda (Lawrence 1995 dalam Kropf et al. 1997), pada penelitian ini tidak ditemukan protein dengan berat molekul tersebut. Di dalam testis, EGF berfungsi untuk menstimulasi sintesis androgen, demikian juga hal yang sama terjadi pada kondisi in vitro (Suarez-Quian & Niklinski 1990). PDGF-A merupakan faktor penting dalam proses diferensiasi sel Leydig, tetapi bagaimana mekanismenya belum banyak diketahui (Mendis-Handagama & Ariyaratne 2001). Selain faktor pertumbuhan tersebut masih banyak faktor lain yang disekresikan oleh sel Leydig seperti: Corticotropin-releasing factor (CRF), Arginin-vasopressin (AVP), oxytocin (OT), Angiotensin-II (A-II) dan peptida lainnya (Saez 1994). Diperlukan penelitian lanjutan untuk menentukan protein yang dihasilkan dalam gambaran hasil SDS PAGE pada penelitian ini.
Uji Biologis CM Sel Leydig Terhadap Kultur Stem Cell Mesenkimal Sumsum Tulang
Transdiferensiasi stem cell mesenkimal sumsum tulang diuji dengan menggunakan CM sel Leydig. Hasil menunjukkan bahwa stem cell mesenkimal yang dikultur dengan CM sel Leydig bereaksi positif dengan pewarnaan histokimia spesifik 3β-HSD untuk mendeteksi sel Leydig (Gambar 6c), menghasilkan sel Leydig sebesar 53,2 % dan hasil tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (4,5%) maupun DMEM yang ditambahkan testosteron (20,5%) (p<0,05). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig meningkatkan perolehan sel Leydig (71,9%) (p<0,05). Perlakuan CM Leydig menghasilkan testosteron dan protein di dalam medium kultur stem cell mesenkimal (Tabel 9). Penambahan hCG ke dalam CM sel Leydig meningkatkan