KAYU SENGON
2. Tahap Pemurnian Dengan Kolom Kromatografi Cair
Penelitian isolasi MnP isolat Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 dimulai dengan kromatografi kolom dan SDS-PAGE fraksi hasil kromatografi kolom tersebut. Untuk isolat Pleurotus EA4 menggunakan kromatografi kolom terbuka penukar ion dengan matriks DEAE dan matriks Phenyl, sedang untuk Pleurotus
EB9 menggunakan kromatografi kolom terbuka penukar ion dengan matriks DEAE.
Hasil ekstraksi dan purifikasi enzim kasar Pleurotus EA4, pada perlakuan inkubasi 4 hari maupun 12 hari tidak diperoleh pita-pita yang menunjukkan keberadaan MnP atau enzim, walaupun sudah ditambahkan amonium sulfat 40%. Hal ini menunjukkan bahwa isolat Pleurotus EA4 tidak menghasilkan MnP, sehingga tidak dilakukan eksperimen lebih lanjut (Gambar 5.6).
Isolasi enzim MnP Pleurotus EB9 yang difermentasi 6 hari tanpa diberi amonium sulfat tidak menghasilkan enzim karena diduga konsentrasinya kurang pekat. Setelah diberi amonium sulfat 40%, diperoleh beberapa fraksi enzim dari mulai enzim kasar sampai hasil elusi 0,1, 0,2, 0,3 dan 0,4% NaCl dan pita dengan bobot molekul kira-kira 43 kDa yang merupakan bobot molekul rata-rata MnP (Gambar 5.7).
Keterangan: Pada sampel pemekatan 40% amonium sulfat sebelum kromatografi, diperoleh aktivitas (U/mL): MnP, 0; LiP, 0,179; lakase, 0,086.
Buffer pp+AS: buffer pirofosfat dan ammonium sulfat; M: marker LMW
Gambar 5.6 SDS-PAGE hasil kromatografi kolom gel hidrofobik (Phenyl-
Sepharose) terhadap sampel pemekatan 40% amonium sulfat isolat
Pleurotus EA4.
Keterangan: Pada sampel pemekatan 40% AS sebelum kromatografi, diperoleh aktivitas (U/mL): MnP, 0, 138; LiP, 0; lakase, 0,914; Crude E4 12 h ink: ekstrak kasar Pleurotus EA4 umur kultur 12 hari inkubasi.
Gambar 5.7 SDS-PAGE hasil kromatografi kolom penukar anion (DEAE- Sepharose) terhadap sampel pemekatan 40% amonium sulfat isolat
Pleurotus EB9.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Lane :
M = LMW
1 = ekstrak AS 60 %
2 = elusi 0.04% buffer pp+AS 3 = elusi 0.08 % buffer pp+AS 4 = elusi 0.12% buffer pp+AS 5 = elusi 0.16% buffer pp+AS 6 = elusi 0.20% buffer pp+AS 7 = elusi 0.24% buffer pp+AS 8 = elusi 0.28% buffer pp+AS 9 = elusi 0.32% buffer pp+AS 10= elusi 0.36% buffer pp+AS 11= elusi 0.40% buffer pp+AS 12= ekstrak kasar 14,4 20,1 30,0 45,0 66,0 97,0 kDa
Gambar 5.8 Kromatogram pemurnian protein sampel Pleurotus EB9-amonium sulfat 40% dengan gel kromatografi.
Ekstrak kasar Pleurotus EB9 yang sudah diberi amonum sulfat kemudian disentrifugasi. Endapan yang diperoleh dilarutkan dengan buffer pirofosfat pH 7 sebanyak 10 ml dan didialisis dengan buffer yang sama sebanyak 2 liter selama 17 jam. Hasil pemurnian protein menunjukkan bahwa aktivitas MnP muncul pada fraksi ke 96 (Gambar 5.8). Purifikasi parsial MnP dilakukan dengan mengelusi endapan yang telah dilarutkan ke dalam kolom kromatografi gel HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 resolusi tinggi (GE Biosciences) menggunakan buffer 10 mM potassium fosfat pH 7,0, dengan kecepatan alir 0,3 mL/menit dan fraksinasi 1,5 mL/fraksi pada HPLC AKTA Purifier (GE Biosciences).
Pada Gambar 5.9 disajikan fraksi 96 kromatografi gel isolat Pleurotus EB9 yang kemudian dilakukan SDS-PAGE dan hasilnya terdapat pita yang sangat jelas dengan bobot molekul sekitar 41,7 sampai dengan 43 kDa yang diperkirakan bobot molekul MnP.
Aktivitas spesifik MnP untuk Pleurotus EB9 filtrat enzim kasar sebesar 1,092 U/mg, sedangkan aktivitas spesifik enzim MnP untuk Pleurotus EB9 40% amonium sulfat (presipitas 40% AS) sebesar 1,605 U/mg. Aktivitas spesifik MnP untuk Pleurotus EB9-Fraksi 96 kromatografi gel diperoleh sebesar 4,133 U/mg protein. Kemungkinan tingkat kemurnian total akan jauh lebih besar, karena hanya 1 ml yang diambil untuk HPLC dari 40 ml contoh (Tabel 5.8).
Keterangan: M: marker; 1: lajur 1, yaitu sampel awal sebelum kromatografi gel; 2: lajur 2, fraksi 96
Gambar 5.9 SDS-PAGE hasil kromatografi kolom gel terhadap sampel pemekatan 40% amonium sulfat dari Pleurotus EB9.
Hasil tahapan purifikasi disajikan pada Tabel 5.8, terlihat bahwa persen perolehan kembali (recovery) MnP yang didapat sebesar 4,133 U/mg protein dengan kemurnian 3,8 kali. Tingkat keberhasilan pemurnian (yield) ini masih sangat rendah, sehingga di kemudian hari masih perlu diperbaiki tahap pemurnian yang lebih efektif.
Tabel 5.8 Aktivitas enzim MnP dari Pleurotus EB9 pada tahapan pemurnian parsial
Konsentrasi Protein Aktivitas MnP No. Sampel Volume Sampel (ml) mg/ml Mg per volume total
U/ml Unit per volume total U/mg Tingkat Kemurnian (x) Yield (%) 1 Filtrat kasar 550 0,195 107,25 0,213 117,15 1,092 1,0 100 2 Presipitas 40% AS 40 0,086 3,44 0,138 5,52 1,605 1,5 4,7 3 Fraksi 96 kromatografi gel 1 0,015 0,015 0,062 0,06 4,133 3,8 0,05
Pembahasan
Hasil uji pendahuluan dalam percobaan untuk melihat ekspresi enzim ligninolitik jamur kelompok Pleurotus tersebut, menunjukkan bahwa isolat
Pleurotus EA4, Pleurotus EB6, Pleurotus EAB7, Pleurotus EB24 dan P. ostreatus HO tidak menghasilkan MnP dengan jumlah signifikan. Sementara
Pleurotus EB9 paling tinggi menghasilkan MnP dalam substrat serbuk gergajian kayu sengon.
Penelitian yang sama dilakukan pada ketujuh isolat dengan penentuan aktivitas ligninolitik MnP ekstrak. Isolat Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4, diketahui memiliki kemampuan dalam proses delignifikasi material lignoselulosa yaitu substrat kayu sengon. Produksi skala besar untuk isolasi MnP dengan memakai isolat Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 dilakukan dengan menggunakan substrat kayu sengon dan menggunakan bioreaktor. Sesuai dengan hipotesis yang disampaikan, bahwa isolat spesies jamur yang berbeda memiliki aktivitas ligninase yang berbeda. Ternyata bahwa jenis isolat dan juga media berpengaruh dalam produktivitas enzim ligninolitik. Dalam penelitian ini media yang digunakan adalah media yang mengandung mangan yang dimodifikasi dari Brown et al. (1990), yaitu dengan penambahan serbuk kayu sengon sebanyak 8 gram/l. Penambahan sumber lignin alami diharapkan dapat meningkatkan aktivitas enzim. Karena sumber lignin alami serbuk kayu sengon ini juga dapat memperbaiki pertumbuhan jamur liar yang diuji.
Aktivitas MnP, LiP dan lakase pada produksi skala kecil oleh jamur kelompok Pleurotus dalam penelitian tampak berfluktuasi, hasil ini diduga disebabkan ketidakstabilan enzim ekstraseluler atau adanya kebocoran pada sel jamur, sesuai dengan pendapat Kerem et al. (1992). Hasil penelitian ini diduga juga disebabkan kurangnya ulangan (hanya 2 ulangan) dan dilakukan dalam botol, yang harus dibuka ketika tiap kali dilakukan pengambilan ekstrak kasar dengan cara mengambil langsung menggunakan mikropipet. Disarankan pada penelitian yang akan datang, kultur dilakukan di dalam bioreaktor yang memudahkan dalam pengambilan ekstrak kasar tanpa harus mengganggu pertumbuhan jamur.
Produksi enzim skala besar pada isolat Pleurotus EB9 menghasilkan MnP dan lakase yang signifikan, sementara produksi LiP tidak terlalu signifikan. Aktivitas MnP mulai muncul pada hari ke-3 inkubasi, dan semakin meningkat seiring masa inkubasi sampai hari ke enam. Demikian juga aktivitas lakase, yang mulai muncul sejak satu hari inkubasi, walaupun tampak adanya fluktuasi. Pada hari keenam, enzim kasar tersebut dipanen. Selama kultur masal 1 liter dalam bioreaktor selama 6 hari, pH menurun perlahan dari 5,6-4,8. Pada panen hari ke-6 diperoleh pH optimum sebesar 4,8. Penurunan pH secara perlahan sebesar lebih kurang 0,8 selama 6 hari inkubasi menunjukkan pertumbuhan miselium yang optimum, yang menunjukkan respirasi berjalan normal. Gangguan seperti kurangnya aerasi pada kultivasi ini dapat mengakibatkan penurunan pH secara drastis menjadi 2,8 pada hari ke 6.
Perbandingan antara Pleurotus EB9 dan Pleurotus EA4 hasil produksi yang sudah diberi amonium sulfat untuk memekatkan kadar enzimnya, diketahui bahwa Pleurotus EB9 menghasilkan MnP sebesar 0,138 U/ml dan aktivitas LiP tidak terdeteksi dan lakase sebesar 0,914 U/ml sedangkan pada isolat Pleurotus
EA4 aktivitas MnP tidak terdeteksi dan produksi LiP dan lakase, berturut-turut adalah 0,179 dan 0,086 U/mL. Menurut Sarkar et al. (1997), manganese peroksidase pada media glucose-amonium tartrate atau glukose-peptone, muncul pada hari ke 3 dan maksimal pada hari ke 6, kemudian akan menurun. Deteksi dilakukan dengan heme absorban pada λ 410 nm, sedang pada P. chrysosporium
maksimal pada hari ke 5 dengan λ 415 nm, dan pada P. radiata dapat dideteksi pada λ 610 nm. Jenis isolat dan media berpengaruh pada produktivitas enzim ligninolitik.
Aktivitas spesifik MnP untuk Pleurotus EB9 filtrat enzim kasar sebesar 1,092 U/mg, sedangkan aktivitas spesifik enzim MnP untuk Pleurotus EB9 dengan presipitas 40% amonium sulfat sebesar 1,605 U/mg. Aktivitas spesifik MnP untuk Pleurotus EB9-Fraksi 96 kromatografi gel yang diperoleh sebesar 4,133 U/mg protein dengan kemurnian 3,8 kali. Hasil rangkuman data pemurnian MnP dari Pleurotus EB9, menunjukkan tingkat keberhasilan pemurnian (yield) yang masih sangat rendah, sehingga dikemudian hari masih perlu diperbaiki tahap pemurnian yang lebih efektif. Dalam percobaannya, Sarkar et al. (1997)
melaporkan bahwa medium pepton meningkatkan hasil MnP pada P. ostreatus
sampai 65% dan faktor purifikasi 25. Pada P. eryngii, P. ostreatus, P. pulmonarius dan P. sajor-caju, MnP tidak terdeteksi bila ditumbuhkan dalam media cair dengan ammonium tartrate sebagai sumber N, aktivitas tinggi MnP diperoleh pada medium pepton mendekati 3 U/ml pada kultur P. eryngii.
Fraksi 96 kromatografi gel isolat Pleurotus EB9 yang kemudian dilakukan SDS-PAGE dan hasilnya terdapat pita yang sangat jelas dengan bobot molekul sekitar 41,7 sampai dengan 43 kDa yang diperkirakan bobot molekul MnP. Hasil ini diyakini bahwa isolat Pleurotus EB9 menghasilkan MnP yang telah berhasil dimurnikan dan menunjukkan bobot molekul 43 kDa.
Ligninolitik berhubungan dengan produksi enzim ekstraseluler pendegradasi lignin yang dihasilkan oleh jamur pelapuk putih. Dua enzim yang berperan dalam proses tersebut adalah lakase, LiP dan MnP (Howard et al. 2003; Kirk et al. 1978).
Lakase merupakan enzim multi-copper yang dapat mengkatalis reaksi oksidasi beberapa substrat seperti polifenol, substituen penol, diamin dan beberapa senyawa anorganik (Thurston 1994). Mekanisme reaksi enzimatik yang terjadi oleh lakase adalah reaksi oksidasi satu elektron. Dibutuhkan peranan molekul oksigen sebagai penerima elektron dan kemudian membentuk molekul air. Ketika reaksi oksidasi berlangsung, substrat kehilangan satu elektronnya dan biasanya terbentuk radikal fenoksi bebas (Thurston 1994) yang berperan sebagai intermediet. Radikal bebas yang tidak stabil tersebut dapat melangsungkan reaksi oksidatif enzimatik selanjutnya atau reaksi non-enzimatik seperti hidrasi, disproporsionasi dan polimerisasi (Thurston 1994).
Lakase telah banyak menjadi subyek penelitian untuk dimanfaatkan secara luas oleh karena lakase sifat spesifiknya yang rendah terhadap substrat- substratnya (Cavallazzi et al. 2004; Thurston 1994). Pemanfaatan lakase sangat luas diterapkan dalam berbagai bidang antara lain dalam proses bioremediasi dan biodegradasi polutan organik pada tanah seperti klorofenol (Ahn et al. 2002), dan polisiklik aromatik hidrokarbon (Han et al. 2004), pada proses dekolorisasi dan detoksifikasi pada pewarna tekstil (Abadulla et al. 2000) serta digunakan sebagai
bleaching pada proses biodelignifikasi pada pulp industri kertas (Bourbonnais dan Paice 1992).
Lignin peroksidase (EC.1.11.1.14; diarilpropan: oksigen, hidrogen peroksida oksidoreduktase; bobot molekul antara 38 dan 43 kDa) dan MnP (EC.1.11.1.13; Mn(II): H2O2 oksidoreduktase; bobot molekul antara 43 dan 49
kDa) merupakan glikoprotein yang memiliki sebuah protoporfirin IX sebagai gugus prostetik dan membutuhkan hidrogen peroksida sebagai oksidan (Hatakka 1994; Tien dan Kirk 1984; Gold dan Alic 1993).
Enzim ekstraseluler LiP dan MnP memiliki peranan yang sangat penting dalam proses biodelignifikasi. LiP memiliki kemampuan mengkatalis beberapa reaksi oksidasi antara lain pemecahan ikatan Cα-Cβ rantai samping propil non fenolik komponen aromatik lignin, oksidasi benzil alkohol, oksidasi fenol, hidroksilasi benzylic methylenegroups dan pemecahan cincin aromatik komponen non phenolik senyawa lignin (Tien dan Kirk 1984). Sedangkan MnP diketahui memiliki kemampuan mengoksidasi baik komponen fenolik maupun non fenolik senyawa lignin.
Seperti enzim peroksidase lainnya, LiP memiliki siklus katalitik yang dinamakan mekanisme ping-pong. Reaksi yang terjadi yakni H2O2 mengoksidasi
enzim pada keadaan awal (resting enzyme) dengan dua elektron membentuk senyawa intermediet I, senyawa tersebut kemudian mengoksidasi substrat aromatik dengan menggunakan satu elektron membentuk senyawa intermediet II dan produk radikal bebas. Senyawa intermediet II yang dihasilkan dapat kembali mengoksidasi substrat lainnya sehingga terbentuk enzim awal dan produk radikal bebas (Cullen dan Kersten 1992). Terbentuknya radikal bebas secara spontan atau bertahap inilah yang mengakibatkan lepasnya ikatan antar molekul dan beberapa inti pada cincin aromatik.
Prinsip fungsi MnP adalah bahwa enzim tersebut mengoksidasi Mn2+ membentuk Mn3+ dengan adanya H2O2 sebagai oksidan. Aktivitasnya dirangsang
oleh adanya asam organik yang berfungsi sebagai pengkelat atau penstabilkan Mn3+. Mekanisme reaksi yakni MnP pada keadaan awal dioksidasi oleh H2O2
membentuk MnP-senyawa I yang dapat direduksi oleh Mn2+ dan senyawa fenol membentuk MnP-senyawa II. Senyawa tersebut kemudian direduksi kembali oleh
Mn2+ tetapi tidak oleh fenol membentuk enzim keadaan awal dan produk (Wariishi et al. 1989). Adanya Mn2+ bebas sangat penting untuk menghasilkan siklus katalitik yang sempurna.
Manganese peroksidase dihasilkan oleh P. ostreatus (Sarkar et al. 1997) dan juga oleh P. crysosporium (Brown et al. 1990) dan oleh Phlebia radiata
(Vares et al. 1995). Masing-masing jamur menghasilkan kombinasi enzim yang berbeda-beda, misalnya ada yang hanya menghasilkan LiP dan MnP, MnP dan lakase, atau jamur yang menghasilkan LiP dan lakase (Kerem dan Hadar 1998). Sampai saat ini isolat jamur pelapuk putih P. chrysosporium banyak menjadi obyek para peneliti dikarenakan menghasilkan aktivitas LiP dan MnP yang tinggi. Seperti halnya pada lakase selain potensi dalam proses biodelignifikasi, lignin peroksidase dan mangan peroksidase berpotensi dalam proses biobleaching dan
biopulping pulp serta proses degradasi senyawa-senyawa berbahaya.
Terdapat dua tipe jamur pelapuk putih yaitu : a) yang menghasilkan LiP, MnP dan lakase dan 2) tanpa LiP (Hatakka 1994). LiP dan MnP secara umum telah dikarakterisasi pada P. chrysosporium, dan produksi lakase telah dilaporkan pada jamur ini dengan media dengan selulosa sebagai sumber karbon (Srinivasan
et. al. 1995). Umumnya jamur pelapuk putih, termasuk P. eryngii dan P. ostreatus, termasuk grup kedua. Ketidakadaan LiP pada tipe kedua ini menyebabkan degradasi lignin lebih condong dalam jerami gandum (Martinez et al. 1994 dalam Sarkar et al. 1997). Menurut Peláez et al. (1995) tipe ini menghasilkan juga aril alkohol oksidase (AAO). Meskipun tanpa LiP, spesies tersebut mampu mendegradasi lignin jerami gandum (Martinez et. al. 1996), yang merupakan sifat penting untuk aplikasi bioteknologi yang berhubungan dengan industri pulp dan kertas dan makanan hewan. Spesies ini juga menghasilkan aryl- alcohol oxidase (AAO) (Peláez et. al. 1995) sebuah enzim yg berpartisifasi dalam produksi hidrogen peroksida yang penting untuk aksi MnP (Guillén et.al. 1996). Studi-studi saat ini menunjukkan pengaruh positif Mn2+ pada degradasi lignin oleh Pleurotus (Camarero et. al. 1996).
Pleurotus spp. diketahui mempunyai daya delignifikasi yang selektif dibanding P. chrysosporium yang delignifikasinya tidak selektif (Kerem et al.
1992). Hal ini merupakan potensi yang besar untuk industri pulp, khususnya dalam proses biobleaching dan biopulping (Jurasek dan Paice 1990).
Aktivitas ligninolitik jamur pelapuk putih seperti pada Trametes versicolor
dan P. chrysosporium meningkat pada media tumbuh yang kandungan karbon sederhana dan nitrogennya rendah (Eaton dan Hale 1993; Katagiri et al. 1995). Namun berdasarkan hasil penelitian Sugipriatini (1998) diketahui bahwa penambahan glukosa dapat menekan pertumbuhan maupun aktivitas ligninolitik salah satu jamur pelapuk putih Ganoderma spp.. Beberapa jamur liar diketahui memiliki kemampuan mendegradasi lignin yang tinggi dan dalam pertumbuhannya menggunakan lignin sebagai sumber karbon (Artiningsih et al.
2000). Ho et al. (1990) juga mengemukakan bahwa penambahan 0,25% pulp pada media inokulum mendorong kecepatan pertumbuhan C. versicolor dengan memperpendek periode lag bleaching dari 2 hari menjadi 1 hari dan mempertinggi proses rangkaian pemutihan pulp.
Karakterisasi ligninolitik isolat-isolat jamur uji pada substrat gergajian kayu sengon menunjukkan bahwa Pleurotus EB9, Pleurotus EA4 dan Pleurotus
EAB7 mempunyai potensi ligninolitik. Namun dalam aktivitas enzim Pleurotus
EB9 lebih menonjol dibanding isolat lainnya. Perbedaan potensi isolat Pleurotus
dalam biodegradasi diduga karena kondisi kultur yang berbeda yaitu antara media padat dan cair juga diduga dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Pada media padat, enzim yang disekresikan lebih terkonsentrasi atau mengumpul karena mempunyai kerapatan atau densitas molekulnya yang tinggi. Pada media cair, enzim yang terinduksi akan mudah menyebar dan molekul enzimnya akan bereaksi dengan substrat yang berada cukup jauh karena disebarkan oleh air. Selain itu dengan menggunakan media cair, maka dapat dilakukan pengadukan, sehingga proses degradasi substrat lebih merata dan sempurna. Kultivasi media yang padat akan mempersulit pengadukan. Menurut laporan Ho et al. (1990) dan Reid et al. (1990) pengadukan secara mekanik dengan kecepatan 110-220 putaran per menit telah dapat mencegah penggumpalan dan proses pemutihan biologis berjalan sempurna. Menurut Herliyana (1997) proses pemutihan pulp kayu akasia dan pulp kayu pinus dengan menggunakan P. chrysosporium pada kondisi aerasi maupun non-aerasi menghasillkan perubahan warna pulp yang masih belum
merata, yaitu terlihat masih adanya warna gelap pada sebagian pulp pinus. Selain faktor aerasi dan tidak adanya pengadukan, ukuran gumpalan pulp juga diduga menjadi salah satu faktor penyebab belum meratanya degradasi lignin pada pulp.
Degradasi lignin, prinsipnya merupakan proses oksidatif dan tidak-spesifik oleh jamur pelapuk putih. Proses tersebut berhubungan dengan lignin peroxidase dan sistem kompleks dengan beberapa enzim (ligninolytic, H2O2-producing and reductases) dan reduced oxygen species (Kirk dan Farrell 1987; Hatakka 1994; Guillén et. al. 1996). Enzim-enzim ligninolitik, LiP, MnP dan lakase, mengkatalisis oksidasi satu elektron unit lignin aromatic radicals yang memulai depolimerisasi non-enzymatic. Jamur yang menghasilkan MnP ini adalah P. ostreatus (Sarkar et al. 1997), P. chrysosporium (Brown et al. 1990) dan Phlebia radiata (Vares et al. 1995). Enzim ini akan menghasilkan produk berupa Mn 3+ dan air, reaksinya adalah MnSO4 + H2O2 ↔ Mn 3+ + H2O.
Terdapat tiga MnP yang berbeda telah dipurifikasi dari P. ostreatus dan satu MnP isoenzyme telah dipetakan (Becker dan Sinitsyn 1993; Asada et. al.
1995). MnP isoenzymes pada P. eryngii menunjukkan sifat katalitik yang telah dikarakterisasi dari media glukosa pepton (Martinez et. al. 1996).
Sifat biokimia dan molekuler MnP isoenzymes yang dihasilkan P. eryngii
dan P. ostreatus dalam media glucose-peptone telah dianalisis. Dua DNA probes
untuk P. eryngii dan P. ostreatus diperoleh dengan PCR untuk mendeteksi homologi diantara gen-gen MnP pada kedua jamur tersebut (Sarkar et. al. 1997).
Simpulan
Isolat dengan MnP yang signifikan yaitu Pleurotus EB9 dan Pleurotus
EA4 kemudian dipurifikasi MnP-nya. Berdasarkan hasil yang telah didapatkan, bahwa produk enzim ligninolitik dipengaruhi oleh kondisi media, jenis isolat, dan suhu serta lama penyimpanan. Isolat Pleurotus EB9 menunjukkan ekspresi lakase dan MnP yang signifikan pada media cair, namun untuk LiP tidak terdeteksi. Sebaliknya isolat Pleurotus EA4 menunjukkan ekspresi lakase dan LiP yang signifikan, namun untuk MnP tidak terdeteksi.
Isolasi enzim dengan kolom kromatografi cair dari Pleurotus EA4 tidak didapatkan pita-pita yang menunjukkan keberadaan MnP. Hal ini menunjukkan bahwa Pleurotus EA4 tidak menghasilkan enzim MnP.
SDS-PAGE hasil kromatografi kolom penukar ion (DEAE-Sepharose) terhadap sampel pemekatan 40% amonium sulfat dari Pleurotus EB9 diperoleh pita dengan bobot molekul kira-kira 43 kDa, yang merupakan BM rata-rata MnP. Selanjutnya hasil pemurnian dengan kolom gel kromatografi HiPrep 16/60
Sephacryl S-200 resolusi tinggi diperoleh peak pada fraksi ke 96. SDS PAGE hasil kromatografi kolom gel terhadap sampel pemekatan 40% amonium sulfat dari Pleurotus EB9 diyakini bahwa Pleurotus EB9 menghasilkan MnP.
Data pemurnian MnP dari Pleurotus EB9 menunjukkan bahwa tingkat pemurnian masih sangat rendah (3,8). Aktivitas spesifik MnP yang diperoleh sekitar 4,133 U/mg protein.
(Identification Based Physiological, Ligninolytical and Morphological Characters of Six Isolates of PleurotusGroup of Bogor)
Abstrak
Lebih dari 24 isolat jamur pelapuk putih kelompok Pleurotus diisolasi dari beberapa tempat di Bogor. Enam isolat diantaranya dapat membentuk tubuh buah pada media serbuk gergajian kayu sengon (Paraserianthes falcataria). Enam isolat tersebut adalah Pleurotus EB14-2, Pleurotus EB24, Pleurotus EA4,
Pleurotus EAB7, Pleurotus EB6 dan Pleurotus EB9. Identifikasi dilakukan berdasarkan karakter fisiologi, ligninolitik dan morfologi. Karakter fisiologi mencakup tipe koloni kultur dan laju pertumbuhan koloni pada media PDA, MEA dan MPA, serta reaksi oksidasi dengan menggunakan media malt yang mengandung asam galat (AAG) dan asam tanat (AAT). Karakter ligninolitik meliputi produksi enzim ligninase khususnya manganese peroksidase (MnP). Karakter morfologis secara makroskopis dan mikrokopis meliputi penampakan tubuh buah secara visual, jumlah tangkai, ukuran pileus dan tangkai, panjang dan lebar basidiospora, sistidia dan basidia. Teknik parafin untuk membuat preparat mengacu pada modifikasi SPM (2002). Pengamatan morfologi dilakukan dengan mikroskop cahaya, mikroskop lusida, teknik mikroskop elektron payaran (SEM). Selain foto mikroskopik dan makroskopik, dilakukan pula line-drawing oleh pelukis berlisensi. Terminologi untuk deskripsi karakteristik morfologi makroskopis mengacu pada Corner (1981 dan 1994) dan Brown (1981). Terminologi untuk deskripsi karakteristik tekstur koloni jamur mengacu pada Stalpers (Rayner dan Boddy 1988). Terminologi karakteristik mikroskopik mengacu pada Rayner dan Boddy (1988), Corner (1981 dan 1994) dan Brown (1981).
Hasil identifikasi enam isolat yang dapat membentuk tubuh buah adalah lima isolat Hohenbuehelia petaloides yang terdiri atas EB14-2 (cokelat-muda), EB24 (cokelat keabu-abuan), EA4 (cokelat muda), EAB7 (cokelat keabu-abuan), dan EB6 (cokelat keabu-abuan) serta Pleurotus djamor EB9 (pink). Analisis kelompok isolat berdasarkan karakterisasi fisiologi dan morfologi menunjukkan bahwa P. djamor EB9 berbeda dengan H. petaloides. Produksi enzim ligninase khususnya MnP P. djamor EB9 dan H. petaloides EA4 juga berbeda.
Kata-kata Kunci: Jamur pelapuk putih kelompok Pleurotus, P. djamor EB9, H. petaloides, morfologi, identifikasi
Abstract
More than 24 isolates of white-rot fungi of Pleurotus group were isolated from various places in Bogor. Six among them were able to form fruit body on sengon (Paraserianthes falcataria) wood sawdust medium. Those six isolates are
Pleurotus EB14-2, Pleurotus EB24, Pleurotus EA4, Pleurotus EAB7, Pleurotus
EB6 dan Pleurotus EB9. The identification was based on its physiological, ligninolytical, and morphological characters. The physiological character includes colony type culture and colony growth rate on PDA, MEA, and MPA mediums, and the oxidation reaction using malt medium that contain galat (AAG) and tannic (AAT) acids. The ligninolytical character includes the production of ligninase enzyme, especially manganese peroksidase (MnP) of P. djamor EB9 and H. petaloides EA4. The morphological character, macroscopically and microscophically, includes the visual appearance of fruit body, the number of stalks, the sizes of pileus and stalk, the lengths and widths of basidospora, sistidia, and basidia. The paraphine technique in making preparats was referred to microtom methode/SPM modification (2002). The morphological observation was